专利名称：一种酶法去除普鲁兰多糖提取获得β－聚苹果酸的方法
技术领域：
本发明的技术方案属于生物法合成生物可降解高分子材料研究领域。
背景技术：
聚苹果酸(聚羟基丁二酸酯)[Poly (malic-acid)或Poly malate,简称为PMLA] 是以苹果酸为唯一单体的均聚高分子聚合物。尽管早在20世纪60年代晚期就 己发现聚苹果酸,但一直到20年后当它从几种生物中分离出来时才受到了重视。 1969年Shimada等发现一种由苹果酸组成的高分子化合物能抑制圆弧青霉 (尸e"/c,7/Z扁c少c/op/應)的酸性蛋白酶，当时酯键巾的羧基位置还没有确定，沉 寂儿年后，聚苹果酸在黏菌(/7/2，amm/w/ycep/2a/wm)中被重新发现。而后几年 聚苹果酸的发展儿乎处于停滞期，1989年Fischer等在黏齒(;^，w"m 戶^甲/w/画)中再次发现聚苹果酸它是DNA聚合酶a的抑制剂。迄今为止， 以Shimada ， Fischer, Holler etal， Lee等为代表的国外学者对PMLA的性能， 合成和应用做了较深入地研究，(3型聚苹果酸已有商业产品，我国在这方面研究 的相对较少，直到近几年才乂学者对聚苹果酸的合成与性能做了基础性的研究。 因此加强聚苹果酸的研究，构建可降解生物高分子的一个研究的平台，具有重 要的理论价值和应用价值。
聚苹果酸属T聚酯类聚合物，是一种新型的完全生物降解性高分子材料。生 物降解性材料是指通过自然界微生物(细菌、真菌等)作用而发生降解的高分 子物质。该种材料降解的产物无毒无害，不会对环境产生二次污染，近年来这种 高分子材料的开发研究得到了飞速发展。PMLA主要有二种结构:即ot型、(3型、Y型PMLA，唯一存在于人体内的只有(3型PMLA。
作为一种水溶性脂肪族聚酯，PMLA具有高度的水溶性、生物相容性、生物 可降解性、生物可吸收性、无免疫原性和可化学衍生性，PMLA可在水溶液中 自发或由酶促降解为小分子苹果酸，而苹果酸单体可被人体吸收并无任何毒副 作用。聚苹果酸分解或燃烧后，最终产物是二氧化碳和水，可被植物吸收，对 环境无毒无害。PMLA的羧基上可连接很多其它的基团，正是由于PMLA的这 种特殊结构，且PMLA及其降解产物的无毒性及无抗原性，所以它具有很强的 药物方面的用途，可以作为药物载体用于心血管及脑肿瘤方面的研究，还可作 为微胶囊材料、生物医学材料如手术缝合线及伤口、烧伤治疗的绷带等生物医 学材料，直接用于人体，由于聚苹果酸的无毒性和可吸水性，还可用于化妆产 品及食品包装等材料。
普鲁兰多糖是出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸过程中的副产物，它的存在会导 致发酵液粘度增大，更为重要的是普鲁兰多糖的存在会严重影响聚苹果酸的分 离提取。
普鲁兰酶(PuUulanase, EC 3.2丄41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中 的01-1,6-糖苷键,从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶在以淀 粉为原料的食品加工业中有着重要的用途，是由于其能将最小单位的支链分解, 最大限度的利用淀粉原料。
聚苹果酸的合成方法主要有化学法和微生物发酵法两种。化学合成法又分为 直接聚合和开环聚合(内酯开环和交酯开环)两种。直接聚合法是在催化剂的 条件下以L-苹果酸为单体直接脱水酯化可得。虽然此法直接简单，产物分离提 纯容易，产率较高，只是聚苹果酸分子量低，反应温度较高，多为rPMLA，实 际应用价值较低，而且催化剂有毒；开环聚合法合成聚苹果酸分子量较直接聚合高，产物以/ -聚苹果酸为主，反应温度较低，但该合成过程步骤较多产率低， 中间产物分离提纯繁琐，产率低；生物途径制备的聚苹果酸主要是通过微生物 发酵合成，目前研究发现粘菌(p/zy犯mm戶/》'cep/w/"m)和出芽短梗霉 (:/^m06a^//Mm /V/zJ朋)具有较高的聚苹果酸合成能力。生物合成PMLA具 有突出的优点，通过微生物发酵，产物均为(3型、产物分子量高、生产条件温 和、生成产物纯度较高，微生物发酵得到的PMLA分子量可达200 760kDa， 而化学法合成的分子量最多为174 kDa，但微生物发酵生产PMLA产量不高，
分离纯化困难，特别是在采用出芽短梗霉",60/7頻^膽////^朋)发酵生产聚
苹果酸过程中，发酵副产物普鲁兰多糖的去除一直是PMLA提取中不容忽视的 重要问题，也是造成PMLA生产成本巨大的重要原因。因此，副产物普鲁兰多 糖的去除一直是困扰出芽短梗霉(Jw o6wWwm /^//m/朋)发酵制备PMLA的 主要问题之一，需高度重视。
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用出芽短梗霉G4ww6wW/w附 P"/^/朋)发酵生产P—聚苹果酸过程中有效降解去除副产物普鲁兰多糖的方法， 实现(3—聚苹果酸的快速、高效提取和纯化，提高p—聚苹果酸产率，减少生产 成本。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是 第 -歩培养基的配制
(1) 菌种活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA): 土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20g/L， pH4.0 4.5， 121。C高压蒸汽灭菌15 min;
(2) 种子培养基葡萄糖8%， 丁二酸铵0.3%, 丁二酸0.2%， K2CO30.04 %, KH2P04 0.01 %， MgS04-7H20 0.01 %， ZnS04'7H20 5X10_4%,玉米浸出液
发明内容0.05%， CaC03 2%(单独灭菌)，pH4.5， 121。C高压蒸汽灭菌]5 min;
(3)发酵培养基葡萄糖12%, 丁二酸铵0.3%， 丁二酸0.2°/。， K2C03 0.04%， KH2P04 0.01 %， MgS04'7H2 O 0.01 %, ZnS04'7H20 5X〗0-4 %,干.米浸出液 0.05%， CaC03 3。/。(单独灭菌)，pH4.5' 121°C高压蒸汽灭菌15 min;
第二歩菌种活化
将斜面菌种——出芽短梗霉""reo^wWww尸w〃w/朋)转接PDA培养基，25 °C 活化培养3 5 d;
第三步种子培养将第二步活化的斜面菌种接种于装有100 mL第一步制得的 种子培养基的500 mL三角瓶中，在24 30°C ， 120 180 r/m下培养48 90 h;
第四歩发酵培养
将第三步制得的种子培养液以8 1.0 %接种量接种于发酵培养基中，在24 30。C, 200r/m卜培养7 12d;
第五歩分离提取
(1) 普鲁兰多糖的降解在第四歩发酵结束后取发酵液，离心或过滤除去菌体，
发酵过滤液(上清液)pH调节至pH 5 pH 7，添加普鲁兰酶6 11 plu/mL，在 30。C 6(TC下，缓慢搅拌，反应60min 卯min;
(2) p —聚苹果酸的初步提取将第五步(l)中的发酵液冷却至室温，缓慢搅拌，
加入无水甲醇使上清液中甲醇终浓度为40% 60% (v/v)，混合液于室温下缓 慢搅拌放置过夜，获得的沉淀为(3 —聚苹果酸，将离心获得的沉淀，按1 : 10 (m:v)溶于蒸馏水中，再次离心除去小分T不溶物，上清液经冷冻千燥，得 白色粉末状P —聚苹果酸。
本发明与现有技术相比，有益效果是第一，使用该制备方法以出芽短梗霉菌种进行发酵可获得高度纯化的P —聚苹果酸；第二，使用该方法可有效去除副产 物普鲁兰多糖，提高(3 —聚苹果酸的提取收率；第三，由于副产物普鲁兰多糖的 一歩去除，既提高了生产效率，降低)3 —聚苹果酸的生产成本，又避免丫提取操 作过程中由于使用大量有机溶剂而造成的环境问题，减少环境污染。
具体实施例方式
实施例一
按如下步骤去除发酵液中的副产物普鲁兰制备(3 —聚苹果酸 第一歩培养基的配制
(1) 菌种活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA): 土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20g/L， pH4.0 4.5， 121 。C高压蒸汽灭菌15 min:
(2) 种子培养基葡萄糖8%， 丁二酸铵0.3%， 丁二酸0.2%， K2CO30.04 %, KH2PO40.01 %， MgS04-7H20 0.01 %， ZnS04-7H20 5X 10-4 %,玉米浸出液 0.05°/。， CaC03 2%(单独灭菌)，pH4.5， 121。C高压蒸汽灭菌15 min;
(3) 发酵培养基葡萄糖L2%， 丁一酸铵0.3%， 丁二酸0.2%， K2C03 0.04%， KH2P04 0.01 %， MgS04.7H20 0.01 %, ZnS〇4'7H20 5X 10—4 %,玉米浸出液 0.05%, CaC03 3%(单独灭菌)，pH4.5， 121。C高压蒸汽灭菌15 min;
第二歩菌种活化
将斜面菌种-出芽短梗霉"wreokmW"w Pm〃m/"")转接PDA培养基，25°C
活化培养3 d 5 d;
第三步种子培养将第二歩活化的斜面菌种接种于装有100 mL第一步制得的 种子培养基的500 mL三角瓶中，在24 30°C， 120 180 r/m下培养48 h 90 h:
第四歩发酵培养将第三步制得的种子培养液以8 10 %接种量接种于发酵培养基中，在24 30°C ， 200 r/m下培养7 d 12 d;
第五步聚苹果酸分离提取
(1) 普鲁兰多糖的降解在第四歩发酵结束后取发酵液，离心或过滤除去菌体， 发酵过滤液(上清液)pH调节至pH 5，添加6 plu/mL的普鲁兰酶，在60 °。下， 缓慢搅拌，反应90min以降解去除普鲁兰多糖；
(2) P —聚苹果酸的提取将第五步(l)中得到的液体冷却至室温，缓慢搅拌，逐 歩加入无水甲醇使其终浓度为40% (v/v)，混合液于室温下缓慢搅拌放置过夜。 5000 r/m离心10 min得)3 —聚苹果酸沉淀，将沉淀按1 : ]0 (m : v)溶于蒸馏 水屮，冉次经5000r/m离心10min除去小分子不溶物，上清液冷冻千燥，得白 色粉末状(3 —聚苹果酸；
在本实施例中，按照实施例一的方法在第五歩发酵过滤液(上.清液)pH调至pH 6，添加8plu/mL的普鲁兰酶，在4(TC下，缓慢搅拌，反应60 min,以降解普 鲁兰多糖；将该液体缓慢搅拌，逐滴加入无水甲醇至其终浓皮达到50%;其它 同实施例1。
在本实施例中，按照实施例一的方法在第五步发酵过滤液(上清液)pH调至pH 7，添加]lplu/mL的普鲁兰酶，在30。C下，缓慢搅拌，反应90min，降解普鲁 兰多糖；将该液体缓慢搅拌，逐滴加入无水甲醇至其终浓度达到60%;其它同 实施例1。
实施例
实施例
权利要求
1.利用酶法去除普鲁兰糖获得β-聚苹果酸的制备方法，包括以下步骤第一步培养基的配制(1)菌种活化培养基土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH 4.0～4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；(2)种子培养基葡萄糖8％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K2CO30.04％，KH2PO40.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O5×10-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO3 2％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；(3)发酵培养基葡萄糖12％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K2CO30.04％，KH2PO40.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O 5×10-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO33％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；第二步菌种活化将斜面菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)转接PDA培养基，25℃活化培养3d～5d；第三步种子培养将第二步活化的斜面菌种接种于装有100mL第一步制得的种子培养基的500mL三角瓶中，在24～30℃，120～180r/m下培养48～90h；第四步发酵培养将第三步制得的种子培养液以8％～10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，在24℃～30℃，200r/m下培养7d～12d；第五步分离提取(1)普鲁兰多糖的降解在第四步发酵结束后取发酵液，离心或过滤除去菌体，发酵过滤液(上清液)调节pH 5～7，添加普鲁兰酶6～11plu/mL，在30℃～60℃下，缓慢搅拌，反应60min～90min；(2)β-聚苹果酸的提取将第五步(1)中的发酵液冷却至室温，缓慢搅拌，加入无水甲醇使酶解后的发酵过滤液中甲醇终浓度为40％～60％(v/v)，将该混合液于室温下缓慢搅拌后放置过夜，获得的沉淀即为β-聚苹果酸粗品，将β-聚苹果酸粗品按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，经5000r/m离心，除去小分子不溶物，真空浓缩后冷冻干燥得β-聚苹果酸。
2. 根据权利要求1所述的降解普鲁兰多糖获得P—聚苹果酸方法，其特征在于， 在13 —聚苹果酸的提取过程中，发酵过滤液添加普鲁兰酶降解发酵过程中的副 产物普鲁兰多糖，提取获得e—聚苹果酸。
3. 根据权利要求1所述的降解普鲁兰多糖后提取获得I3—聚苹果酸的方法，其 特征在于，发酵过滤液调pH 5 pH 7后添加普鲁兰酶。
4. 根据权利要求1所述的降解普鲁兰多糖后提取获得3—聚苹果酸的方法，具 特征在于，发酵过滤液添加6 llplu/mL的普鲁兰酶，提取获得P—聚苹果酸。
5. 根据权利要求1所述的降解普鲁兰多糖后提取获得P—聚苹果酸的方法，其 特征在于，发酵过滤液在3CTC 5(TC下，添加普鲁兰酶，提取获得P—聚苹果 酸。
6. 根据权利要求l所述的降解普鲁兰多糖后提取f3—聚苹果酸的方法，其特征 在于，发酵过滤液添加普鲁兰酶，缓慢搅拌，反应30 min 90 min后，提取获得I3—聚苹果酸。
7. 根据权利要求1所述的降解普鲁兰糖后提取获得P—聚苹果酸的方法，其特 征在于发酵过滤液降解普鲁兰糖后添加甲醇使甲醇终浓度为40% 60% (Wv) 以获得I3—聚苹果酸。
全文摘要
本发明公开了一种利用普鲁兰酶有效降解去除出芽短梗霉发酵液中普鲁兰多糖，以利于提取获得β-聚苹果酸的方法。利用本方法能够有效降解去除出芽短梗霉发酵液中的普鲁兰多糖，提高产物产率和纯度，避免由于普鲁兰多糖的干扰而造成的一系列繁琐操作，提高了工作效率，降低产物生产成本。本发明通过下述方案予以实现将出芽短梗霉菌种经活化和种子培养后接种于发酵培养基中；在24～30℃和120～200r/m条件下培养7d～12d，发酵结束后，取发酵液经5000r/m离心或过滤，除去菌体。发酵过滤液(上清液)调节pH至pH5～pH 7，添加普鲁兰酶6～11plu/mL上清液，在30℃～50℃条件下，反应30min～90min，随后添加无水甲醇至甲醇终浓度为40％～60％，缓慢搅拌后静置过夜，获得的沉淀即为β-聚苹果酸粗品，将β-聚苹果酸粗品按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，经5000r/m离心，除去小分子不溶物，真空浓缩后冷冻干燥得β-聚苹果酸。
文档编号C12P7/62GK101560528SQ20091006895
公开日2009年10月21日 申请日期2009年5月21日 优先权日2009年5月21日
发明者乔长晟, 徐勇虎, 王凤荣, 磊 蒋, 贾士儒 申请人:天津科技大学