专利名称：一种用细胞工程培养繁殖泛生墙藓原丝体的方法
技术领域：
本发明涉及一种用细胞工程培养繁殖泛生墙藓原丝体的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
在植物界，苔藓植物是由一类水生生活转为陆生生活过渡型的植物类群，是地球上 陆生植物中最古老的种群之一。目前地球上包括南极在内除5000米以上高山及海洋外， 在不同的生态系统中均有苔藓植物的足迹。苔藓植物隶属于高等植物中的孢子植物，全 世界约有23000种，种数仅次于被子植物，是植物界中的一个重要门类。
苔藓植物的生活史以配子体为主，人们常见的绿色苔藓植物体属于配子体世代。苔 藓植物的孢子体附生在配子体上，有时孢子体不发育，而配子体通常达到高度的分化。 苔藓植物的生活史具有明显的世代交替，它的生活史经历了早期陆生植物进化的三个阶 段幼小配子体时的丝状体，成年配子体的茎叶体以及二倍体的孢子体。由于苔藓植物 具有相对简单的发育模式，形态分化的样式比较单纯，染色体数目较少(一般11=6-10)，
他们适合于细胞分化分析和形态学的研究，苔藓植物生活史以配子体为主，比较容易进 行遗传学研究。
苔藓植物分布很广，生活于淡水中，不能脱离水的环境，但也有不少种类能够忍耐 极度的干旱环境，生长在完全裸露的岩石上面，它对干旱的环境的忍受能力仅次于地衣， 因此苔藓植物和地衣常被生态学家誉为大自然的拓荒者。
由于分布广，生境多样化以及对恶劣环境的特殊适应机制，多数的苔藓植物能产生 特别丰富的次生代谢物质，苔藓植物被认为是生物活性物质的源泉。在民间，苔藓植物 被广泛用于治疗创伤、烧伤、感染、肺结核、神经衰弱、惊厥、烫伤和肺炎等症。另外， 几乎所有的苔藓植物都不被各种动物所采食，也不被细菌、真菌或病毒所感染，所有这 些都表明苔藓中存在着一些活性物质作为自身保护剂，来抵御外界的有害刺激，例如， 德国农场主曾用田边采集到的苔藓用水匀浆后喷洒在巻心菜上防止虫害；娄红祥等发现 苔藓的某些成分可以有效抵抗HIV病毒等。由于苔藓植物含有多种类型化合物，而且许 多化合物表现出良好的生物活性，因此苔藓植物有可能成为前景广阔的农用、药用植物 资源，造福人类。然而，苔藓植物形体小，混杂丛生，种间不易区别和分离，单独一种
3苔藓的人工培养繁殖还没有成熟体系，某些种类采集足够量的样品又比较困难，导致了 苔藓植物相关产品的研究开发面临原料困境。植物的组织培养技术恰恰可以解决这一难 题，利用快速繁殖技术，能在相对较短的时间内，获得大量单一种类的纯净的材料，即
可用于研究，又可为利用苔藓制备各种活性制剂提供大量原材料。 参考文献 Stefan A. Rensing， Daniel Lang, Andreas D. Zimmer， et al. The Physcomitrella Genome Reveals
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发明内容:
4本发明的目的在于将通过细胞工程的方法获得大量发育程度一致的泛生墙藓原丝 体，为发育生物学、提取物功效研究、生态恢复提供大量可用材料。
本发明是这样实现的
一、 泛生墙藓成熟孢子的无菌萌发获得初生原丝体
泛生墙藓成熟孢子的无菌初生原丝体的获得经由成熟孢子的灭菌、固体培养基上的 萌发得到，具体步骤如下
1. 成熟孢子的灭菌
挑选泛生墙藓成熟饱满的孢蒴，从孢蒴以下l一2cm，蒴柄中间部分剪断，用清水洗 净孢蒴表面，然后用75%的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面0. 5-1分钟；而后用含1. 0g/L 的氯化汞和1.0%餐洗剂的溶液对孢蒴表面进行消毒，处理时间为3-5分钟；再用灭菌水 反复浸泡清洗孢蒴4次，洗净材料孢蒴表面的氯化汞和洗涤剂残留；然后用无菌镊子固
定蒴柄，以无菌眼科剪刀横向切断孢蒴顶部，暴露出内部的孢子，用镊子挤出孢子到盛
有无菌水的离心管中，使孢子分散悬浮起来；将盛有孢子的离心管密封好，在4(TC的水 浴中剌激40-50秒；
2. 固体培养基上的萌发
在无菌条件下，取密度为104-106/ml的孢子，接种到改良的MS培养基(添加了 2,4-二氯苯氧基乙酸(2， 4-Dichlorophenoxyacetic acid，简称2， 4-D) 2-5mg/L，硅酸钠 2.0g/L，蔗糖2.0%、 pH5.8的MS培养基)中。培养温度为25°C±3°C，光照度为40001x， 10-20天后获得由孢子萌发的初生原丝体。
二、 原丝体的大量繁殖及收集 L原丝体的大量繁殖及收集
原丝体的大量繁殖及收集由摇瓶培养后离心纯化的工序得到。具体如下 (1)原丝体的大量繁殖
用镊子轻轻夹取体积为10-1000mmS萌发的原丝体，接种到添加了 2， 4-D 2-5mg/L, 硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0%、 pH5.8的MS液体培养基的体积为50-1000ml三角瓶中，每 个三角瓶中加入的培养液为三角瓶容积的1/3-1/2， 120rpm摇床培养7-10天，环境温 度控制在25土3t:，光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养7-15
5后获得大量原丝体。如需要更大的量，则在无菌条件下，将培养得到的原丝体连同培养 液倒入玻璃发酵罐中，加入3 — 10倍体积的新鲜培养液，底部通入无菌空气(200L/小
时)，使得培养液中的原丝体不断翻腾，以发酵罐底部无永久沉积的原丝体为标准，培
养7—15天后，停止进气，待原丝体沉入罐底后，用蠕动泵在无菌条件下缓慢将处于罐 体上部的培养液抽出2/3，再加入新鲜无菌培养液至原初体积的5倍，继续重复扩大培 养，如此反复至罐体最大容积为止，即获得更大量的原丝体。 (2)原丝体的收集
根据需要，能将三角瓶中培养的原丝体用来传代扩大培养，也能将培养瓶中的全部 混悬液倒入离心管中，在800rpm/min (转/分)离心2分钟，弃去上清液，回收得到原 丝体；发酵罐中的大量原丝体用4一8层纱布过滤收集获得。
本发明具有制备方法简便、成本低、得到的原丝体发育程度一致等优点。
具体实施方式
-
以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1:
1.成熟孢子的灭菌
挑选泛生墙藓成熟饱满的孢蒴，从孢蒴以下lcm，蒴柄中间部分剪断，用清水洗净 孢蒴表面，然后用75%的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面0.5分钟；而后用浓度为1.0g/L
的氯化汞和含有1.0%餐洗剂的溶液对材料孢蒴表面进行消毒，处理时间为3分钟；再用 灭菌水反复浸泡清洗孢蒴4次，洗净材料孢蒴表面的氯化汞和洗涤剂残留；然后用无菌
镊子固定蒴柄，以无菌眼科剪刀横向切断孢蒴顶部，暴露出内部的孢子，用镊子挤出孢
子到盛有无菌水的离心管中，使孢子分散悬浮起来;将盛有孢子的离心管密封好，在4(TC 的水浴中刺激40秒；
2.固体培养基上的萌发-在无菌条件下，取密度107ml的孢子，接种到添加了 2,4-二氯苯氧基乙酸2mg/L， 硅酸钠2. 0g/L，蔗糖2. 0%、pH5. 8的MS培养基中，培养温度为25土3"C，光照度为40001x，
610天后获得由孢子萌发的初生原生体。 3.原丝体的大量繁殖及收集
原丝体的大量繁殖及收集由摇瓶培养后离心纯化的工序得到。具体如下
(1) 原丝体的大量繁殖
用镊子轻轻夹取体积为10mn^萌发的原丝体，接种到添加了2， 4-D 2mg/L，硅酸 钠2.0g/L，蔗糖2.0%、 pH5.8的MS液体培养基的体积为50ml三角瓶中，每个三角瓶 中加入的培养液为三角瓶容积的1/3， 120rpm摇床培养7天，环境温度控制在25±3 'C，光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养，7天后获得大量原 丝体。
(2) 原丝体的收集
培养瓶中的全部混悬液倒入离心管中，800rpm/min (转/分)离心2分钟，弃去上 清液，即回收得到大量原丝体。
将上述离心收集的原丝体用蒸馏水清洗，制备成苔藓原丝体简易水装片，用于学生教 学观察。
实施例2:
基本同实施例l，不同之处在于
1. 成熟孢子的灭菌时，75%的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面l分钟，氯化汞消毒
5分钟，水浴刺激时间为50秒。
2. 固体培养基上的萌发时，孢子密度为107ml， 2， 4-D浓度为5mg/L。
3. 原丝体的大量繁殖及收集中-
用镊子轻轻夹取体积为200mm3原丝体，接种到添加了 2， 4-D2.5mg/L,硅酸钠2.0g/L， 蔗糖2.0%、 pH5.8的MS液体培养基的体积为500ml三角瓶中，每个三角瓶中加入的培 养液为三角瓶容积的1/3， 120rpm摇床培养7天，环境温度控制在24。C，光源为漫射 光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养，12天后获得大量原丝体。
这些培养瓶中的原丝体全部用于转瓶扩大繁殖，在无菌条件下，将500ml三角培养 瓶中的原丝体及其培养液全部倒入玻璃发酵罐，加入1000ml新鲜培养液，底部通入无菌空气(300L/小时)，使得培养液中的原丝体不断翻腾，培养15天后停止进气，待原 丝体沉入罐底后，用蠕动泵在无菌条件下缓慢将处于罐体上部的培养液抽出2/3，再加 入新鲜无菌培养液5000ml，继续重复扩大培养，15天后重复上述步骤，加入新鲜无菌 培养液至罐体最大有效容积10L为止，8大后将罐内物体全部倒出，用纯6层纱布过滤 清洗后得到大量的原丝体，将其用20倍体积的75%酒精研磨提取后，用于制备抗病毒 及动物拒食制剂。
实施例3:
基本同实施例l，不同之处在于
1. 成熟孢子的灭菌时，75%的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面1.5分钟，氯化汞消 毒3分钟，水浴刺激时间为45秒。
2. 固体培养基上的萌发时，孢子密度为107ml， 2， 4-D浓度为5mg/L。
3. 原丝体的大量繁殖及收集中
用镊子轻轻夹取体积为1000mm3原丝体，接种到添加了 2， 4-D3mg/L,硅酸钠2.0g/L， 蔗糖2.0%、 pH5.8的MS液体培养基的体积为1000ml三角瓶中，每个三角瓶中加入的 培养液为三角瓶容积的1/3， 120rpm摇床培养7天，环境温度控制在24'C，光源为漫 射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养，12后获得大量原丝体，可作为苔 藓发育的研究材料。
权利要求
1、一种用细胞工程培养繁殖泛生墙藓原丝体的方法，其特征在于繁殖泛生墙藓原丝体的具体步骤如下a. 成熟孢子的灭菌挑选泛生墙藓成熟饱满的孢蒴，从孢蒴以下1—2cm，蒴柄中间部分剪断，用清水洗净孢蒴表面，然后用75％的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面0.5-1分钟；而后用含1.0g/L的氯化汞和1.0％餐洗剂的溶液对孢蒴表面进行消毒，处理时间为3-5分钟；再用灭菌水反复浸泡清洗孢蒴4次，洗净材料孢蒴表面的氯化汞和洗涤剂残留；然后用无菌镊子固定蒴柄，以无菌眼科剪刀横向切断孢蒴顶部，暴露出内部的孢子，用镊子挤出孢子到盛有无菌水的离心管中，使孢子分散悬浮起来；将盛有孢子的离心管密封好，在40℃的水浴中刺激40-50秒；b. 固体培养基上的萌发在无菌条件下，取密度为104-106/ml的孢子，接种到添加了2，4-二氯苯氧基乙酸2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS培养基中，培养温度为25℃±3℃，光照度为40001 x，10-20天后获得由孢子萌发的初生原丝体；c. 原丝体的大量繁殖及收集用镊子夹取体积为10-1000mm3萌发的原丝体，接种到添加了2，4-D2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS液体培养基的体积为50-1000ml三角瓶中，每个三角瓶中加入的培养液为三角瓶容积的1/3-1/2，120rpm摇床培养7-10天，环境温度控制在25±3℃，光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养7-15天后获得大量原丝体；如需要更大量的原丝体，则在无菌条件下，将培养得到的原丝体连同培养液倒入玻璃发酵罐中，加入3—10倍体积的新鲜培养液，底部按200L/小时通入无菌空气，使得培养液中的原丝体不断翻腾，以发酵罐底部无永久沉积的原丝体为标准，培养7—15天后停止进气，待原丝体沉入罐底后，用蠕动泵在无菌条件下缓慢将处于罐体上部的培养液抽出2/3，再加入新鲜无菌培养液至原初体积的5倍，继续重复扩大培养，如此反复至罐体最大容积为止，即获得更大量的原丝体；收集原丝体时，将三角瓶中培养的原丝体全部混悬液倒入离心管中，用800rpm/min离心2分钟，弃去上清液后得到原丝体；发酵罐中的大量原丝体用4—8层纱布过滤收集获得。
全文摘要
本发明涉及一种用细胞工程培养繁殖泛生墙藓原丝体的方法，属生物技术领域。本发明的繁殖泛生墙藓原丝体的具体步骤为a.成熟孢子的灭菌，以含1.0的氯化汞和1.0％洗涤剂的溶液对孢蒴表面消毒0.5-1分钟；b.固体培养基上的萌发取孢子接种到添加了2，4-D 2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS培养基中25±3℃培养10-20天，光照度为4000lx；c.原丝体的大量繁殖是经添加2，4-D 2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS孢子萌发液体培养基中在25±3℃下，120rpm摇床培养7-10天，光源为漫射光后得到，也能用发酵罐通无菌空气200L/小时扩大培养，少量原丝体用800rpm离心收集，大量原丝体用4-8层纱布过滤收集。本发明具有制备方法简便、成本低、得到的原丝体发育程度一致的优点。
文档编号C12N5/04GK101486991SQ20091009414
公开日2009年7月22日 申请日期2009年3月2日 优先权日2009年3月2日
发明者鸽 张, 李育中, 汪家乐, 霏 沈, 静 范, 陈正贵, 陈穗云, 黎兴江 申请人:云南大学