专利名称：：嗜热毁丝霉菌株及其在产角蛋白酶方面的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及嗜热毁丝霉菌株及其应用。
背景技术：
：角蛋白酶(keratinase)是一种专一性很强的蛋白酶，能特异性地分解角蛋白，而角蛋白广泛存在于自然界中，主要来源于动物的外胚层细胞，包括皮肤以及皮肤的衍生物，是其结构蛋白，可分为a和|3两种类型。该类蛋白质化学结构稳定，是一种抗性很强的硬性蛋白，它的结构通过二硫键、氢键、盐键和其它交键作用使得非常稳定，不溶于水，难以被胰蛋白酶、胃蛋白酶等常见蛋白酶降解，但能被角蛋白酶所降解。角蛋白酶具有降解天然角蛋白的特性，属于碱性丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶族，被认为是一类诱导酶。由于角蛋白酶具有能特异性地分解角蛋白的特性，使其在饲料工业、肥料工业、医学领域、皮革工业、洗涤用品、美容产品、食品工业、环境治理及纺织工业等方面均有广泛的应用。因此，研究与开发产角蛋白酶意义重大。嗜热菌具有在发酵中利用其嗜热特性可以提高反应温度，以增大反应速度，提高单位时间内的产率，节约成本；减少中温型杂菌的污染几率等优势。而嗜热真菌产角蛋白酶的研究尚未见报道。毁丝霉属的其他真菌也尚未见报道可以产生角蛋白酶。
发明内容本发明的目的在于提供嗜热的、产角蛋白酶能力强且生长快速的嗜热毁丝霉菌株。本发明的另一目的是提供该嗜热毁丝霉菌株在产角蛋白酶方面的应用。本发明的再一目的是提供该嗜热毁丝霉菌株产角蛋白酶的方法。嗜热毁丝霉菌株从四川平武的土样中分离而获得，已于2009年7月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址中国武汉武汉大学)，名称为嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.l(MyceliophthorathermophilaGZUIFR-H94.1)，保藏号CCTCCNO:M209140。本发明的嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.1，具有以下形态学特征在PDA培养基上，38t:培养2.5天，菌落直径85mm，平展，褐色，边缘白色，延长培养全部变为褐色，绒状至粉状，表面有菌丝呈网状分布；正反面颜色一致。菌丝具隔膜，半透明，表面光滑，气生菌丝明显分为粗细两种类型，均可育，细菌丝宽O.9-1.8ym，粗菌丝宽3.6-6.3(8.1)ym。无球拍状菌丝。顶生和侧生分生孢子，无柄，或生在短柄或短突或侧枝上，单生或双生或3个成链，半透明，光滑或具瘤，大多椭圆形，大小4.5-7.2X2.3-4.5iim，单孢，双孢极少，基痕宽O.5-2iim，产孢丰富。无间生孢子。厚垣孢子未见。有性型未知。此菌为嗜热真菌，在2(TC时几乎不生长，25t:培养7天菌落直径为15mm，最适生长温度为35-40。C，53。C培养7天，直径达45mm。60。C下未见生长。本发明嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.1菌株产角蛋白酶的方法，是以鸡毛粉20.10g/L3为碳、氮源和诱导物、尿素0.98g/L为补充氮源、NaCl5g/L，K2HP046g/L，KH2P04lg/L为产酶培养基，产酶温度为3『C初始pH为7.9，连续培养6天，酶活测定时间为培养的第6天。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本菌株从四川平武的土样中分离而获得，为中国本土的菌株，并非从国外引进。该菌株的产角蛋白酶能力强。由于是一个嗜热菌株，因而在发酵中可以提高反应温度，以增大反应速度，提高单位时间内的产率，节约成本；而且有减少中温型杂菌的污染几率等优势。同时，由于本菌株生长快速，可以縮短发酵周期，也有提高单位时间产率，减少污染机会，节约生产成本等优势。以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的有益效果。具体实施例方式实施例1:(1)材料来源采自四川平武的土样。马丁氏培养基KH2P04lg，MgS04.7H200.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂18g，孟加拉红1/300mL。灭菌条件12rC，30min。用前待温度冷却在4(TC左右，加青霉素20/mg，链霉素40iig/mg。PDA培养基马铃薯200g切块，加水约500mL，煮沸30min，过滤，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足1000mL，pH自然。灭菌条件121°C，30min。(2)菌株的分离纯化称取2g土样加入盛有20mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡10min左右，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液。吸取lmL土壤悬液到9mL无菌水中，依次按10倍法稀释，通常稀释在10—110一3。采用混菌法接种，吸取lmL悬液于直径为9cm的灭菌培养皿中，然后倾注已熔化并冷却到45t:的双抗马丁氏培养基，充分混匀，待凝固后倒置，4(rC保温培养。待菌落长出后转移到新的培养皿进行纯化，获得GZUIFR-H94.1菌株。(3)分离株的鉴定把待鉴定菌株移入PDA培养基中，采用点中法接种，倒置放于38t:温箱中培养7天。采用胶带粘帖法进行标本片的制作并采用Motic数码显微镜进行显微摄影，描述记载待定菌株的菌落特征和微观形态特征。通过经典形态学鉴定，该分离株为嗜热毁丝霉，具体描述如下在PDA培养基上，38t:培养3天，菌落直径85mm，平展，褐色，边缘白色，延长培养全部变为褐色，绒状至粉状，表面有菌丝呈网状分布；正反面颜色一致。菌丝具隔膜，半透明，表面光滑，气生菌丝明显分为粗细两种类型，均可育，细菌丝宽0.9-1.8iim粗菌丝宽3.6-6.3(8.1)ym。无球拍状菌丝。顶生和侧生分生孢子，无柄，或生在短柄或短突或侧枝上，单生或双生或3个成链，半透明，光滑或具瘤，大多椭圆形，大小4.5-7.2X2.3-4.5iim，单孢，双孢极少，基痕宽O.5-2iim，产孢丰富。无间生孢子。厚垣孢子未见。有性型未知。此菌为嗜热真菌，在2(TC时几乎不生长，25t:培养7天菌落直径为15mm，最适生长温度为35-40。C，53。C培养7天，直径达45mm。60。C下未见生长。实施例2:嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.1菌株产角蛋白酶的方法，包括以下步骤(1)培养基摇瓶发酵培养基鸡毛粉20.10g，尿素0.98g，NaCl5g，K2HP046g，KH2P04lg，水1000m，初始pH为7.9。[OOSO](2)液体发酵培养将本发明的菌株接种在含固体PDA培养基的培养皿中，38t:培养3天，用直径7mm的打孔器打空，然后将菌丝块接种到装有50mL复筛液体培养基的250mL三角瓶中，每瓶接3孔菌丝块，每组作3个重复，放入3『C摇床中，140rpm保温静止培养，测定酶活力。(3)粗酶液的制备孢子液的制备取4t:冰箱保存的菌种，用接种环挑取少量菌丝，用划线法将其接种于PDA培养基上，38t:培养。长好后，用灭菌的0.05%的Tween-80轻轻洗出平板表面的分生孢子，并在无菌条件下用16层纱布过滤，所得孢子悬液以血球计数板计数后置于4t:保存备用。粗酶液的提取取适量的孢子液加入250mL的三角瓶中(内装50mL发酵液)，于38t:，120rpm摇床上培养。6天后取发酵液，4000rpm离心5min，然后再用快速定性滤纸过滤，取滤液既得粗酶液。(4)角蛋白酶活力的测定在9.5mL0.1M，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中加底物(鸡毛粉20mg)和酶液(0.5mL)，于38°C、120rpm的摇床中反应2h，冰浴冷却10min，先用滤纸过滤，滤液再用真空纤维微孔过滤器(0.45iim)过滤，280nm测光吸收。酶活力定义为pH8.0、38t:条件下，lh水解角蛋白使光吸收值(对对照)每增加O.Ol，所对应的酶量为l个活力单位(U)。测量3次，取平均值。则酶活力(U/L)=1000X测定所得的活力单位(即0.5mLX2X2hX(1/2)X(OD值/0.01)X1000)。嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.1菌株产角蛋白酶的方法选择实验例—、不同补充碳源对产角蛋白酶的影响在发酵基础培养基中分别加入2%的可溶性淀粉、麦芽糖、甘油、葡萄糖，发酵第6天时，测定酶活力的结果如表1。由表可知，在所试条件下，分别加入可溶性淀粉、麦芽糖和甘油时，所得到的酶活均高于用发酵基础培养基发酵时所得的酶活，即相对于发酵基础培养基，它们对产酶均有促进作用。其中，可溶性淀粉对产酶的促进作用最大，使每升溶液的酶活增加了1000个单位；而加入葡萄糖时的酶活与不加葡萄糖时的酶活相同，即在所试条件下葡萄糖对产酶没有影响表1补充C源对嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.1产角蛋白酶的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>二、不同补充氮源对产角蛋白酶的影响在发酵基础培养基中分别加入0.1%的硝酸钠、硝酸氨、氯化钠、尿素，发酵第6天时测定酶活力，结果见表2。在所试条件下，分别加入硝酸钠、硝酸氨和氯化氨时，所得到的酶活均低于用发酵基础培养基发酵时所得的酶活，即相对于发酵基础培养基，它们对产酶均有抑制作用。其中，氯化氨对产酶的抑制作用最大，使每升溶液的酶活减少了700个单位，几乎抑制了产酶；而加入尿素时使每升溶液的酶活比不加入尿素时增加了200单位，说明尿素对产酶有促进作用。表2补充N源对嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.1产角蛋白酶的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、不同补充S源对产酶活力的影响在发酵基础培养基中分别加入0.5mmol/L的亚硫酸钠、巯基乙醇、硫代硫酸钠、二硫苏糖醇、硫酸钠。发酵第6天时测定酶活力的结果见表3。由表可知，在所试条件下，分别加入硫酸钠、亚硫酸钠、巯基乙醇和二硫苏糖醇时，所得到的酶活均低于用发酵基础培养基发酵时所得的酶活，即相对于发酵基础培养基，它们对产酶均有抑制作用。其中，二硫苏糖醇对产酶的抑制作用最大，使每升溶液的酶活减少了700个单位，几乎抑制了产酶；而加入硫代硫酸钠时使每升溶液的酶活增加了600个单位，即相对于发酵基础培养基，它对产酶有较强的促进作用。表3补充S源对嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.1产角蛋白酶的影响酶活(U/L)补充S源KerationaseActivity(U/DSulfurSource加入补充S源的酶活(U/L)用发酵基础培养基的酶活(U/L)(对昭)"、、/碌K代石克酸钠1400800碌酸钠300800亚錄^酸钠300800巯基乙醇300800二碌u苏糖醇200800四、不同无机离子对产酶活力的影响在发酵基础培养基中分别加入0.01%的MgS047H20、CaCl2、CuS045H20、ZnS047H20和FeS047H20，在发酵第6天时测定酶活力。由表4可知，在所试条件下，分别加入CuS045H20和MgS047H20时，所得到的酶活均低于用发酵基础培养基发酵时所得的酶活，即相对于发酵基础培养基，它们对产酶均有抑制作用。其中，MgS047H20对产酶的抑制作用最大，使每升溶液的酶活减少了700个单位，几乎抑制了产酶；而分别加入CaCl2和ZnS047H20时，所得到的酶活均高于用发酵基础培养基发酵时所得的酶活，即相对于发酵基础培养基，它们对产酶均有促进作用。其中，CaCl2对产酶的促进作用最大，使每升溶液的酶活增加了900个单位；而加入FeS047H20时的酶活与不加FeS047H20时的酶活相同，即在所试条件下FeS0471120对产酶没有影响。表4无机离子对嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.1产角蛋白酶的影响7酶活(U/L)无机离子Keratio腦eActivity(U/Uinorganicions加入无机离子的酶活(U/L)用发酵基础培养基的酶活(U/L)(对照)氯化钓1700800硫酸锌1100800錄u酸i失800800硫酸铜500800硫酸4美100800五、培养条件对嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.1产角蛋白酶的影响实验材料与方法1.1试验用培养基摇瓶发酵培养基鸡毛粉20.10g，尿素0.98g，NaCl5g，K2HP046g，KH2P04lg，水1000m，初始pH为7.9。1.2液体发酵培养将研究菌株接种在含固体PDA培养基的培养皿中，3『C培养3天，用直径7mm的打孔器打空，然后将菌丝块接种到装有50mL复筛液体培养基的250mL三角瓶中，每瓶接3孔菌丝块，每组作3个重复，放入38t:摇床中，140rpm保温静止培养，测定酶活力。1.3粗酶液的制备孢子液的制备取4t:冰箱保存的菌种，用接种环挑取少量菌丝，用划线法将其接种于PDA培养基上，38t:培养。长好后，用灭菌的0.05%的Tween-80轻轻洗出平板表面的分生孢子，并在无菌条件下用16层纱布过滤，所得孢子悬液以血球计数板计数后置于4t:保存备用。粗酶液的提取取适量的孢子液加入250mL的三角瓶中(内装50mL发酵液)，于38t:，120rpm摇床上培养。6天后取发酵液，4000rpm离心5min，然后再用快速定性滤纸过滤，取滤液既得粗酶液。1.4角蛋白酶活力的测定在9.5mL0.1M，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中加底物(鸡毛粉20mg)和酶液(0.5mL)，于38°C、120rpm的摇床中反应2h，冰浴冷却10min，先用滤纸过滤，滤液再用真空纤维微孔过滤器(0.45iim)过滤，280nm测光吸收。酶活力定义为pH8.0、38t:条件下，lh水解角蛋白使光吸收值(对对照)每增加O.Ol，所对应的酶量为l个活力单位(U)。测量3次，取平均值。则酶活力(U/L)=1000X测定所得的活力单位(即0.5mLX2X2hX(1/2)X(OD值/0.01)X1000)。81.5对产酶重要因子的筛选及结果优化用SAS软件中的Plackett-Burman设计对产角蛋白酶重要因素进行筛选，在此基础上用RSA法优化试验结果，寻找最佳试验点。2.实验结果2.lPlackett-Burman设计对产角蛋白酶重要因素的筛选结果在单因子优化实验的基础上，分别选择可溶性淀粉、尿素、CaCl2、ZnS047H20、Na2S203作为C-源、补充N-源、补充S-源、无机离子，并对以上因素与培养温度、初始pH、摇床转速等，使用Plackett-Burman设计，考察它们对发酵产角蛋白酶的影响。本试验中Plackett-Burman试验设计如表5，各个因素的水平及其效应见表6。表5N=12的Plackett-Burman试验设计表及其响应值Table5TheresultofPlackett-Burmandesign<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表6各因素的名称、水平及其影响效应Table6Name,levelandmaineffectofeachvariabletermfactorLowlevelHighlevelestimateStderrtPr>|t|prominenceX,可溶性淀粉2%2.5%-550528.01160.5864720.5987675X2尿素0.0.125%-450528,0116-3.518830.038952X3CaCl20.01%0.0125%-716.6667528.01160.0977450.9282997X4ZnS(V7H200.01%0.0125%-283.3333528.01161.3684340.2646494X5Na&Q,0.05%0.0625%650528.0116-O.293240.7884566X6PH78.8616.66667528.01164.0075570.027871X7转速120150-250528.0116-2.932360.0608853X8温度35440528.0116t18设定t检验大于t值概率高于95%的因素为显著影响因素，由表3.5可以看出pH、尿素对产酶影响显著。由于在发酵过程中鸡毛粉起到了非常重要的作用，一方面鸡毛粉可作为C、N源，另一方面也是重要的产酶诱导物，所以在进一步的优化中选择对鸡毛粉和对产酶影响显著的PH和尿素作为优化目标，确定其最佳量。2.2RSA法优化实验结果本试验中按Box-Behenken设计法的设计，各因素所取水平见表7，实验设计的表格及结果如表8。表7三因素水平的取值Table7Levelandcodeof3keyfactorsforBox_Behenkendesign10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表8Box-Behenken实验设计与结果Table8TheresultsofBox_Behenkendesign<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>9-10-122001010-1350011-10128001210118001300053001400052001500053002.3试验结果分析表8结果经过SAS软件的分析得出二次回归方程为Y丄=5266.667-25X^162.5X2_212.5X3_1058.333X^-175X^2-575X^3-1783.333X22-1633.333X32从上面的方程的平方项的系数均为负数可知，此方程的抛物面开口向下，有极大值点。经计算该模型的决定系数R2=0.9940，离回归标准差0.172723，表明回归方程拟合程度好。由表9回归系数的估计可知WX3对酶活力影响的线性关系不显著；X/、X/、X/对酶活力影响的曲面效应显著；^、X3对产酶活力的交互影响效应显著，XpX2，X2、X3交互影响效应不显著。表9回归系数的估计Table9EstimatevalueofregressioncoefficientEstimateStderrtPr>|tlprominenceX-2561.0669-0.409390.699203x2-162.561.0669-2.661020.044829X3-212.561.0669-3.479790.017663X晶-1058.33389.88805-11.77390.0001**(非常显著)Xl*X2-17586.36164-2.026360.098567Xl*X3-57586.36164-6.658050.001153*(显著)12**(非常显0.0001著)1林(非常显0.0001_著)由表10回归方程的各项方差分析可知此模型中各因子与响应值之间的关系高度显著，其中平方项和交互相的影响显著，一次项影响不显著。失拟项很小，说明可以用此模型来解释预测试验。表10回归方程各项方差分析表TablelOAnalysisofmean叫imredeviationSourc6DFSSMSFPr〉FModel92455483272831591.451890.0001(Linear)35775001925006.4525140.035917(Quadratic)322532337510778251.75790.0001(CrossProduct)31445000481666.716.145250.00527Error5149166.729833.33(Lackoffit)31425004750014.250.066284(PureError)26666.6673333.333Tota1424704000SourceDFSSMSFPr>F分析此模型可知存在最大值点，当X:=0.010154，X2=-0.046059，X3=-0.066838时，即以羽毛粉为20.10g/L、尿素为0.9770g/L、初始PH为7.933和其他无机离子(NaCl5g/L，K2HP046g/L，KH2P04lg/L)为发酵培养基，发酵条件在所试范围之时能够得到预期最大的酶活为5277.38U/L。而验证性试验证明在优化条件下，角蛋白酶活达到了4443.55U/L，此结果是以基础培养基发酵时所得酶活800U/L的5.6倍。综上所述，嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.1菌株产角蛋白酶的最佳培养基配方和培养条件为以鸡毛粉20.10g/L为碳、氮源和诱导物，尿素0.98g/L为补充氮源，NaCl5g/L，13X2*X2-1783.333X2*X30X3*X3—1633.33389.88805-19.839586.36164089.88805-18.1708K2HP046g/L，KH2P04lg/L为产酶培养基，产酶温度为38。C初始pH为7.9，连续培养6天，酶活测定时间为培养的第6天。不同金属离子对酶活的影响差异显著。在O.lg/L的浓度和所试条件下，&2+均表现出明显的增强作用，Zn2+也有增强作用，而Mg"和Cu"表现出明显的抑制作用。Fe3+对产酶没有影响。权利要求一种嗜热毁丝霉菌株GZUIFR-H94.1(MyceliophthorathermophilaGZUIFR-H94.1)，其特征在于所属菌株保藏号为CCTCCNOM209140。2.如权利要求1所述的嗜热毁丝霉菌株在产角蛋白酶方面的应用。3.—种嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.l菌株产角蛋白酶的方法，是以鸡毛粉20.10g/L为碳、氮源和诱导物、尿素0.98g/L为补充氮源、NaCl5g/L，K2HP046g/L，KH2P04lg/L为产酶培养基，产酶温度为38t:初始pH为7.9，连续培养6天。全文摘要本发明公开了一种嗜热毁丝霉菌株及其在产角蛋白酶方面的应用，嗜热毁丝霉菌株GZUIFR-H94.1(MyceliophthorathermophilaGZUIFR-H94.1)，其菌株保藏号为CCTCCNOM209140。嗜热毁丝霉GZUIFR-H94.1菌株产角蛋白酶的方法，是以鸡毛粉20.10g/L为碳、氮源和诱导物、尿素0.98g/L为补充氮源、NaCl5g/L，K2HPO46g/L，KH2PO41g/L为产酶培养基，产酶温度为38℃初始pH为7.9，连续培养6天。本菌株是一个生长快速、嗜热的菌株，且具有较强的产角蛋白酶能力。文档编号C12N1/14GK101717727SQ200910102968公开日2010年6月2日申请日期2009年12月23日优先权日2009年12月23日发明者张继伟,杜文,梁宗琦,梁建东,韩燕峰申请人:贵州大学