专利名称：一株高生物量富锌酵母及其选育方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物的品种，这种微生物的选育方法及其应用，确切讲 本发明涉及的微生物是一种高生物量富锌酵母。
技术背景近年来，己有一些称为"富锌酵母"的产品问世，如李文珍等以啤酒酵母OSflccfera^yc" cewv"^ )为出发菌种，利用玉米糖化渡加入适当的营养元素及 锌离子，经发酵试验获得产品，微生物学杂志1994年第14巻1期；胡振英 等将啤酒酵母茵株在高锌条件下进行50代的适应性培养，获得了富锌酵母菌株， 中兽医医药杂志1997年第6期；陈佩林以酵母菌IF02346菌株为菌种，培养 基中加入适量的锌离子，经发酵试验获得高锌酵母产品，动物医学进展2003， 24(3)62-64;郭雪娜等对不同种属的酵母菌株运用了杂交育种技术，出筛、复筛、 单倍体分离、亚硝基胍(NTG)诱变，选育到一株富锌酵母菌株(编号为ZGH. 374， 微生物学报2004年4月44巻2期。中国发明专利申请93119253.6公开了一种药用富锌酵母、生产工艺及其制 品，它采用在菌株培养过程选用含锌量高的啤酒酵母菌株，在种子罐或者商品 罐接种培养过程，分别在培养基中添加硫酸锌，经相应的工艺过程，获得富锌 酵母；富锌酵母和配料，经过药用颗粒剂或药用片剂的生产工艺制成药用富锌 酵母制品。中国发明专利03119428.1公开了一株富锌酵母及其选育方法与应用，本发 明提供的菌株为高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC W0896。其选育方法包括l)分别筛选生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞 含锌量高的酵母菌种；2)筛选生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞含锌量高 的酵母菌种的单倍体突变菌株；3)生物量高的酵母菌单倍体突变菌株与抗锌能力 强及细胞含锌量高的酵母菌单倍体突变菌株进行原生质体融合；4)在选择培养基上筛选高生物量和高含锌量的融合二倍体优良菌株，即富锌酵母菌种。但这些产品存在明显的缺陷和不足国内外有关富锌酵母的研究主要侧重 于酵母细胞对锌离子的传递和调控或对菌种进行亚硝基胍(NTG)、钴60、紫外等方法诱变，其主要缺陷在于不同酵母菌种对锌的抗性能力有较大差异，从 而对锌离子的吸收转化能力差异较大；而且其酵母细胞内的锌含量较低，产品 缺乏稳定性，不利于工业化生产，参见孔林等，食品与生物技术学报2006年 ll月第25巻第6期。发明内容本发明提供一株高生物量的含锌量高的酵母菌株，同时本发明提供这种酵母 的选育方法、培养方法及其用途。本发明提供的高生物量富锌酵母菌株(5^c/wram;;cey cerev/s/"^ F-090428X。 该菌株于2009年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.3156。本发明的高生物量的富锌酵母菌株的选育方法是以在2000pg/l 1000(^g/1 锌离子浓度的的麦芽汁固体培养基中驯化的啤酒酵母菌中筛选出生物量高、耐 锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种作为诱变出发菌株，取一接种环的发菌株 接入盛有30ml液体培养基制备成菌悬液，在29t:，摇床振摇24h，再取2ml菌 液转入盛有18ml带玻珠的无菌生理盐水中，再将菌悬液用不高于900W的微波 辐照，照射时间不大于65分钟，将经微波辐照的酵母锌菌悬液涂在硫酸锌浓度 不高于15000吗/ml的麦芽汁固体培养基平板，经过多次复筛和传代试验，得 到所要的高生物量的富锌酵母菌株，以上所用的麦芽汁固体培养基为8Bx麦芽 汁、容积重量比为0.3%的尿素和1.2%琼脂、pH5.0，所用的液体培养基为8Bx 麦芽汁、容积重量比为0.3%的尿素、pH5.0。。本发明的高生物量的富锌酵母菌株的选育中所用的微波频率为2450MHz。本发明的高生物量的富锌酵母菌株的培养条件是在麦芽汁培养基上接种高 生物量富锌酵母(&cc/2arawwes ceww'w'ae) F-090428X，接种量为体积比10%-30 %，在28。C 30。C搅拌培养16 48小时，所用的培养基为8Bx麦芽汁、容积重 量比为0.3%的尿素的麦芽汁-尿素培养基，总糖含量为5% 20%，培养基中锌 盐浓度为10000 15000pg/ml，培养基的pH为4.5 5.5。本发明的高生物量的富锌酵母菌株在制备人类高含锌食品或高含锌食品添 加剂或高含锌药物中的应用。本发明的高生物量的富锌酵母菌株在制备动物高含锌饲料或高含锌饲料添 加剂中的应用。本发明使用的高生物量富锌酵母(Sacc/mYw^cas cem^'ae) F-090428X不仅生物量高，而且细胞的有机锌含量较高，检测表明，其每克干细胞含有机锌量 高达50mg，生物量12g/L，而现有的高生物量富锌酵母ZGH-374菌株每克干细 胞含有机锌量仅为14.3mg，生物量9.2g/L，参见2004年微生物学报《富锌酵母 的选育及培养条件研究》 一文。本发明生产富锌酵母产品的方法以普通的麦芽汁、0.3%尿素培养基为发酵底 物，只需调节其总糖含量，添加锌盐量(如硫酸锌)等即可进行生产，方法简单，4成本低廉。其选育中所使用的最佳微波辐射频率为2450MHz，可采用普通的家 用微波炉实现对被选育菌种的辐照诱变；本发明给出的高生物量的富锌酵母菌 株的优选培养条件可以使其有最大的产率；因此本发明的方法实用性强，操作 简便，对发酵设备及生产条件没有特殊要求，利用一般发酵厂的设备和生产条 件即可生产，投资少、见效快、效益高，不但适合于大规模的生产还适合于小 批量的生产，具有广阔的实际应用前景。
图1为富锌酵母产品的生产工艺流程示意图。
具体实施方式
实施例1、高生物量富锌酵母CSacc/^rawycay ce"v/Wae> F-0卯428X的选育 高生物量富锌酵母(Sacc/^raw，ycesce v^ae) (F-090428X)的选育分为以下 几个步骤l)根据酵母菌对硫酸锌的耐性测定进行初筛，测定了啤酒酵母菌在含有 5000|ig/ml、 6000pg/ml、 8000pg/ml、 10000pg/ml的梯度锌离子浓度的麦芽汁固 体培养基上的生长情况，从中选出2株在含有1000(Vg/ml锌离子的麦芽汁固体 培养基上生长好的菌株。2)测定初筛得到的1株菌株在含有10000]ig/ml锌离子的麦芽汁液体培养基中 培养的细胞生物量和细胞含锌量。通过驯化、筛选，获得1株(F-0卯415)干细 胞锌含量35.5mg/g，细胞干重9.2g/L的菌株。3) 诱变剂量的考察以筛选得到的高产菌株F-090415 (锌10000叱/ml)作 为出发菌株，取制备好的菌悬液于一三角瓶内，将装有菌悬液的的三角瓶放入 2450MHz900W家用微波炉进行不同时间的照射。照射时间分别累计为0、 10、 20、 30 、 40、 60和80s，在照射80s时，致死率已达100%。4) 诱变菌种筛选根据微波照射剂量与死亡率的关系，从Os、 10s、 20s、 30s、 40s、60s的酵母锌菌悬液涂在硫酸锌浓度为10000(ig / ml、 12000吗/ ml、 15000|ig /ml的培养基平板。待菌落长出后，将各剂量组分别挑出单菌落转接斜面培养。 用长好的菌斜面，以出发菌株F-090415为对照进行发酵筛选试验，测定各菌株 锌含量和细胞干重。结果相对于出发菌株，40s剂量组中生产能力超出20X以上 的菌株百分率显著提高。说明微波诱变照射40s对酵母锌产生菌的菌种具有正效 应。从各组挑出超过出发菌株生产能力20%的菌株进行复筛。经过多次复筛和 传代试验，得到40s剂量组F-090428X菌株，在摇瓶中的酵母锌生产能力(细 胞干重12g/L)较出发菌株F-0卯415提高30X，含锌量50.0mg/g,较出发菌株提 高40.8%。实施例2、高生物量富锌酵母(S"cc/^romyc^ cewv/w'ae) F-090428X的优化培 养条件1) 采用单因子发酵实验和多因子正交实验进行高生物量富锌酵母 (Sacc/^ramyces cewWw》e) F-090428X的培养条件(包括培养基组分、锌盐浓度、 培养基的pH值、通气量、接种量及发酵时间等)实验，通过培养条件实验，确 定了优化培养条件麦芽汁+0.3%尿素培养基，总糖含量为5%-20%，培养基中 锌盐(如硫酸锌)浓度为10000-15000叫/ml，培养基的pH为4.5-5.5，接种量为10 %陽30%， 28。C-30。C搅拌培养16-48h。2) 在优化的发酵培养条件下发酵培养高生物量和高含锌量的富锌酵母在优 化培养条件下，每升培养液的细胞干重达12g以上，每克干细胞的锌含量达50mg 以上。实施例3、高生物量富锌酵母的生产 高生物量和高锌含量的富锌酵母产品的生产工艺包括斜面菌种—一级摇瓶菌种培养—二级摇瓶种子培养—种子罐—二级液体种 子罐—发酵罐4储罐—固液分离—冻干或喷雾干燥—(或采用板框压榨或离心收 集富锌酵母细胞—粉碎)—高生物量、高富锌含量的富锌—分装—制剂(饲料添加剂、或胶囊、片剂等)—包装。 下面对生产工艺进一步说明如下 (l)斜面菌种培养高生物量富锌酵母CSflccAaramyc^ cerev/s/ae) F-090428X接种于含有总糖含 量为16%、锌盐(如硫酸锌)浓度为15000pg/ml的麦芽汁固体斜面上，在28-30。C 培养三天后，放入4'C冰箱保存(2) —级摇瓶菌种培养 将保存的高生物量富锌酵母OSacc/^ramycas ce^vWae) F-090428X菌种活化 后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为10%、锌盐(如硫酸锌)浓度为 12000吗/ml的麦芽汁培养基的1-3x500 ml锥形瓶中，于28-30。C搅拌培养18h即为液体菌种；(3) 二级摇瓶种子培养按10%的接种量将液体菌种接入装有150毫升总糖含量为12%、锌盐(如硫 酸锌)浓度为12000吗/ml的麦芽汁培养基的20-30x500 ml锥形瓶个中，在28-3(TC 搅拌培养20h，即为一级液体种子培养物(4) 种子罐培养按15%的接种量将一级种子培养液接入装有IOO立升总糖含量为12%、锌盐(硫酸锌)浓度为12000ng/ml的麦芽汁培养基的发酵罐，在28-3(TC搅拌培养 18h，即为二级液体种子培养物；(5) 二级液体种子培养按20%的接种量将二级种子培养液接入装有500立升总糖含量为16。％、锌 盐(硫酸锌)浓度为15000pg/ml的麦芽汁培养基的发酵罐，在28-3(TC搅拌培养 20h，即为三级液体种子培养物(6) 发酵罐发酵培养按30%的接种量将三级种子培养液接入装有30000立升总糖含量为14°%、 锌盐(硫酸锌)浓度为15000pg/ml的麦芽汁培养基的发酵罐，在28-3(TC搅拌培养 24h;C7)收集酵母细胞及干燥采用冷冻干燥或喷雾干燥(或板框压榨或离心收集富锌酵母细胞，在45-85°C 风干使其含水量小于5%);。(8) 制剂饲料添加剂、或胶囊、片剂等。(9) 包装用不透气的包装袋包装，即为高生物量、高富锌含量的富锌酵母，每克干 富锌酵母细胞含有机锌高于50mg)。本发明的高生物量的富锌酵母菌株可在制备人类高含锌食品或高含锌食品 添加剂或高含锌药物中的应用；貤可在制备动物高含锌饲料或高含锌饲料添加 剂中的应用。
权利要求
1、-株高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X，菌株于2009年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3156。
2、 权利要求1所述的高生物量的富锌酵母菌株的选育方法，其特征是以从 在2000pg/l 1000(^g/l锌离子浓度的的麦芽汁固体培养基中驯化的啤酒酵母菌 中筛选出生物量高、耐锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种作为诱变出发菌株， 取一接种环的发菌株接入盛有30ml液体培养基制备成菌悬液，在29"C，摇床 振摇24h，再取2ml菌液转入盛有18ml带玻珠的无菌生理盐水中，再将菌悬 液用不高于900W的微波辐照，照射时间不大于65分钟，将经微波辐照的酵母 锌菌悬液涂在硫酸锌浓度不高于15000吗/ml的麦芽汁固体培养基平板，经过 多次复筛和传代试验，得到所要的高生物量的富锌酵母菌株，以上所用的麦芽 汁固体培养基为8Bx麦芽汁、容积重量比为0.3%的尿素和1.2%琼脂、pH5.0， 所用的液体培养基为8Bx麦芽汁、容积重量比为0.3%的尿素、pH5.0。
3、 权利要求1所述的高生物量的富锌酵母菌株的选育方法，其特征是所用 的微波频率为2450MHz。
4、 权利要求l所述的高生物量的富锌酵母菌株的培养条件，其特征是在麦 芽汁培养基上接种高生物量富锌酵母CSacc/wramj;c" cewv^/ae) F-090428X，接 种量为体积比10%-30%，在28。C 30。C搅拌培养16 48小时，所用的培养基 为8Bx麦芽汁、容积重量比为0.3%的尿素的麦芽汁-尿素培养基，总糖含量为5 % 20%，培养基中锌盐浓度为10000 15000ng/ml，培养基的pH为4.5 5.5。
5、 权利要求1所述的高生物量的富锌酵母菌株在制备人类高含锌食品或高 含锌食品添加剂或高含锌药物中的应用。
6、 权利要求1所述的高生物量的富锌酵母菌株在制备动物高含锌词料或高 含锌饲料添加剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种高生物量富锌酵母及其选育方法和应用。本发明提供的高生物量富锌酵母菌株是(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X。该菌株于2009年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.3156。本发明的高生物量富锌酵母选育方法采用了微波辐照。本发明的高生物量富锌酵母可用于制备人类高含锌食品或高含锌食品添加剂或高含锌药物，也可用于制备动物高含锌饲料或高含锌饲料添加剂。
文档编号C12N1/18GK101629146SQ20091016386
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者李建喜, 程富胜, 罗永江, 罗超应, 胡振英, 辛蕊华, 郑继芳 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所