一种人工设计的Bt抗虫基因及其应用的制作方法

专利名称：：一种人工设计的Bt抗虫基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因人工改造和生物防治
技术领域：
，具体涉及一种人工设计的Bt抗虫基因，及其在鳞翅目害虫防治上的应用。
背景技术：
：苏云金芽孢杆菌(Bt)的晶体蛋白可作为生物农药特异地毒杀某些昆虫。该晶体蛋白被昆虫摄取后，在昆虫肠道的碱性条件下溶解产生130KD左右的前毒素分子，经肠道蛋白酶水解前毒素的C端被降解，最后产生由N端65-70KD组成的毒蛋白。该毒蛋白的N端一段残基(就CrylA而言为28个)进一步被肠蛋白酶加工去掉才能形成完全活化的毒蛋白。活化的毒蛋白与敏感昆虫中肠上皮细胞上的受体结合，插入到中肠细胞膜上形成0.51.Onm的小空或离子通道，引起胞内离子的外渗及水的内渗，造成细胞溶胀破裂，大量细胞遭到破坏，致使幼虫停止进食而死亡。研究证明，Bt晶体蛋白对人体、哺乳动物、鸟类、鱼类以及很多有益昆虫均无毒害作用，所以Bt制剂已作为一种无公害的天然微生物杀虫剂在农业、林业及环境卫生等方面应用了近50年。但由于自然条件下Bt晶体蛋白稳定性差，杀虫效果受天气影响大，易被太阳照射降解，也不能渗透到植物组织内部，易被雨水冲刷掉；且其必须被昆虫取食到才能发挥杀虫功能，这些限制因素使该生物杀虫剂的发展一直受到很大制约，所以目前对农业害虫的防治还主要依靠化学杀虫剂。20世纪80年代中期，随着植物基因工程技术的成熟、Bt基因克隆的成功及对Bt晶体蛋白杀虫剂机制研究的深入，使人们有可能将Bt基因转入植物获得可表达杀虫蛋白的抗虫转基因植物。目前，全世界已有26种以上Bt转基因植物，包括棉花、玉米、水稻等主要农作物。野生型Bt晶体蛋白基因在转基因植物中的表达量非常低。在CaMV355启动子驱动下其表达量约占总可溶性蛋白的0.001%左右，不能使转基因植物获得毒杀多数对Bt毒蛋白不太敏感的昆虫。并且来源于Bt的杀虫基因直接转入植物中还存在表达产物不稳定的问题。1991年，Perlark等(FREDERICKJ.PERLAK等Proc.Natl.Acad.Sci.USA883324-3328,1991)根据植物基因的密码子使用频率及可能影响植物mRNA稳定性的基序在保持原Bt基因编码的氨基酸序列不变前提下，对Bt晶体蛋白基因CrylAb和CrylAc进行了改造。改造的基因在转基因烟草和番茄中表达的杀虫蛋白量比野生型基因的表达量分别提高了约10倍和100倍。然而，这种改造只是部分使用了偏好密码子，大部分氨基酸仍使用了多个密码子(表3FMCrylAb基因)。同时，不同植物的密码子使用频率存在差异，以同是高等植物的单子叶植物和双子叶植物为例，单子叶植物氨基酸密码子简并位(末位)偏向使用C或G，而双子叶植物部分氨基酸密码子的简并位却偏向使用A或U(WiIburH.Campbell等PlantPhysiol.199092,1-11)。因此，根据植物密码子的使用频率设计基因，在不同作物中表达量也会存在差异，要想在特定作物中高量表达目的基因，应根据本作物的偏好密码子来改造目的基因。水稻是我国乃至世界的最重要粮食作物之一，每年由于大螟、二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫危害，损失惨重。目前水稻田间生产，如果不使用化学农药防治鳞翅目害虫，可使产量损失达60%左右。近年来，由于水稻基因组计划的完成，大大方便了水稻基因序列和密码子信息的获得，使得分析水稻密码子使用频率成为可能。如能根据水稻的密码子使用频率，挑选偏好密码子改造现有的BT毒蛋白基因，使其在水稻中稳定高效表达，无疑具有重要意义。
发明内容发明目的转基因技术可打破生殖隔离，实现不同物种间的基因转移。但是在一个物种高效表达的基因，被转化到另一物种后，表达量不一定高，也不一定还能具有本来的功能，特别是对于差异较大的物种。物种密码子偏好性是影响外源基因表达量的诸多因素之一。不同的物种往往具有不同的偏好密码子。分析这种偏好性，在转基因之前，对需要转化的目的基因进行密码子的重新设计或改造，将对提高外源基因在受体生物中的表达量具有重要作用。CrylAb蛋白是一类由苏云金芽孢杆菌产生的对鳞翅目害虫具有毒害作用的伴胞晶体。CrylAb基因在生物防治领域具有重要的应用前景。但是CrylAb基因来源于细菌(苏云金芽孢杆菌)，直接应用到转基因植物中，表达量低，抗虫性效果差。分析苏云金芽孢杆菌和水稻的密码子使用情况，可以发现两者在密码子偏好上存在很大差异，利用水稻的偏好密码子，重新设计和改造crylAb，以实现转新CrylAb基因水稻具有较好的抗虫性。技术方案1、基因供体生物和受体生物间密码子使用频率和偏好密码子分析不同生物在密码子使用频率和偏好性方面存在差异，是影响外源基因在供体生物和受体生物间表达差异的重要因素之一。本发明正是利用物种间密码子偏好性差异来改造和设计基因的。本发明需要改造的基因为CrylAb，来源于苏云金芽孢杆菌(细菌)，转基因的受体生物为水稻(单子叶植物)。分析水稻和苏云金芽孢杆菌的密码子使用频率结果见表1。从表1中挑选出水稻和苏云金芽孢杆菌氨基酸使用频率最高的密码子(偏好密码子，表2)。由表2可知，水稻和苏云金芽孢杆菌的偏好密码子存在很大差异，苏云金芽孢杆菌的氨基酸偏好密码子第三位(末位)除亮氨酸(L)为G外，其它全部为A或T；而水稻的偏好密码子第三位全部为G或C，只有偏好的终止密码子第三位为A。水稻、苏云金芽孢杆菌密码子的使用频率和偏好性差异是本发明进行CrylAb基因设计和改造的理论基础。2、目的基因的设计和序列分析用水稻偏好的密码子(表2)依次替换CrylAb蛋白的每个氨基酸，获得一个新的基因(DNA序列)，该基因被命名为mCrylAb，序列见SEQIDNO1。分析mCrylAb与其他BT基因间的DNA序列差异，验证mCrylAb是否为一个全新的基因。分析结果是mCrylAb与CrylAb在DNA序列组成上有很大差异。CrylAb基因使用了58个密码子，而mCrylAb基因只选用了22种密码子(只有S和R两种氨基酸各选用了两个密码子，其它氨基酸都只有一个密码子)；CryIAb基因的GC含量为37.3%，而mCrylAb基因的GC含量为64.7%;同源比对结果显示，两个基因的同源性只有69.38%(图1)，总共1845个碱基，有565个碱基存在差异。GENBANK数据库中Blast结果显示无与mCryIAb基因完全一致的序列，最高同源序列为gb:AY326434.1，同源性仅为89%(1664/1852)。可见，mCrylAb为一个全新的基因。3、目的基因的人工合成由于mCrylAb基因是人为设计的，在自然界中不存在这个序列，需要全人工合成。本发明委托上海英俊公司按照mCrylAb基因序列进行全人工合成，并装载在pMD18_T载体上，形成pMD18-mCrylAb载体。4、构建目的基因的植物表达盒或表达载体把目的基因装载到植物表达盒或表达载体上，为植物转化做准备。本发明所用到的表达载体有两个，一个为PCAMBI1305.1，用mCryIAb基因替换⑶S基因，形成一个新的载体P35S-mCrylAb(见图2)，在该载体中mCrylAb基因前的启动子为CaMV35S，该启动子为组成型表达启动子；另一个为pOsTSPI-GUS载体，同样用mCrylAb基因替换掉⑶S基因，形成新的载体pOsTSPI-mCrylAb(见图3)，在该载体中mCrylAb基因前的启动子为OsTSPI，该启动子具有组织特异型表达功能，能使外源基因在水稻胚乳部分不表达，在叶片、茎等其他组织表达。并将两个新构建的载体转入农杆菌菌株EHA105中。5、目的基因转化受体生物用两个新构建的携带有mCrylAb基因的植物表达载体分别转化受体生物水稻，水稻品种为皖粳97(粳稻)。经过愈伤诱导、共培养、抗性愈伤筛选、分化成苗等过程，最终获得转基因苗。6、目的基因在受体生物中的表达和功能验证分析受体生物转基因植株中的目的基因表达情况和功能，以鉴定本发明改造的基因是否具有预期效果。p35S-mCrylAb载体转化水稻得到的转基因苗22棵，pOsTSPI-mCrylAb载体得到的转基因苗47株，PCR鉴定这些转基因苗全为阳性。用CrylAb/Ac试纸条(购自北京银土地生物技术有限公司)检测转基因植株，结果转P35S-mCrylAb基因苗有17株呈阳性，阳性率为77.3%。转pOsTSPIiCrylAb转基因有39株呈阳性，阳性率为88.6%。进一步对这些转基因水稻进行田间抗虫性鉴定，结果田间抗虫性和试纸条检测结果一致，即试纸条检测为阳性的单株，抗虫；试纸条检测为阴性的单株，不抗虫。这说明转基因植株的抗虫性是由BT毒蛋白引起的。用CrylAb/Ac试纸条检测转基因水稻各器官mCrylAb基因表达情况，结果转P35S-mCrylAb的水稻在茎、叶、颖壳和胚乳中都呈阳性，而转POsTSPI-mCrylAb的水稻在茎、叶、颖壳中呈阳性，但在胚乳中无表达。所以，35S和OsTSPI两个启动子都能驱动mCrylAb正常表达，并且表达的组织特异性与启动子特性一致，35S为组成性表达启动子，而OsTSPI为非胚乳表达启动子。用EnvirologixCrylAb/CrylAc平板试剂盒定量测量转基因株系叶片的表达量(表9)，结果P35S-mCrylAb转基因植株叶片BT毒蛋白平均表达量为6.02ng/mg，pOsTSPI-mCrylAb转基因植株叶片BT毒蛋白平均表达量为8.43ng/mg，两种启动子驱动的mCrylAb平均表达量达7.23ng/mg。采集转基因水稻和非转基因水稻叶片用于试验室稻纵卷叶螟生物测定试验，结果显示所有非转基因植株的叶片接虫4天后全部卷曲，叶片变枯白，为明显的稻纵卷叶螟取食危害状，而转基因水稻叶片无明显变化，叶绿(图6，7)；非转基因水稻叶片上的虫子明显较转基因水稻叶片上的虫子大(图7)。可见，本发明利用水稻密码子偏好性改造的mCryIAb基因能在水稻中正常表达，并且表现出良好的抗虫性，利用物种对密码子的偏好性改造或设计基因的方法可行。有益效果本发明提供了一种利用物种密码子偏好性，设计和改造基因，以增强外源基因在受体物种中功能的方法。利用水稻密码子频率表，把来源于苏云金杆菌的CrylAb蛋白每个氨基酸用水稻偏好密码子进行逐一替换，设计出一条由水稻偏好密码子组成的新的Bt基因，命名为mCryIAb。比较mCryIAb基因与CryIAb基因可以发现CryIAb基因使用了58个密码子，而mCrylAb基因只选用了22种密码子；CryIAb基因的GC含量为37.3%，而mCrylAb基因的GC含量为64.7%；同源比对结果显示两基因同源性只有69.38%。GENBANK数据库中Blast比对结果显示无与mCrylAb基因一致的序列，最高同源序列为gb:AY326434.1，同源性仅为89%(1664/1852)。所以mCryIAb为一个全新的基因。该基因应用于水稻转化表现出良好的抗虫性。这说明利用物种密码子偏好性改造或设计基因方法可行。四图1CryIAb、FMCrylAb和mCrylAb三基因比对结果a=CrylAb,b=FMCrylAb,c=HiCrylAb；标红碱基为三基因间相同的碱基，没有标红的碱基为三基因间不同的碱基。图2:p35S-mCrylAb载体图LB至RB为转移到受体生物的DNA，包括潮霉素抗性基因和35S启动子驱动的mCrylAb基因。图3:p0sTSPI-mCrylAb载体图LB至RB为转移到受体生物的DNA，包括潮霉素抗性基因(HPT)和OsTSPI启动子驱动的mCrylAb基因。图4=HiCrylAb基因电泳检测图谱1=Marker,2-8为转基因单株。图5:CrylAb/Ac试纸条检测结果1-4:P35S-mCrylAb载体转基因植株各器官检测结果，5-8:p0sTSPI-mCrylAb载体转基因植株各器官检测结果，1、5茎，2、6叶，3、7颖壳，4、8胚乳；A为试纸条的控制线(controlline)，B为CrylAb蛋白检测线。图6稻纵卷叶螟实验室抗虫性鉴定_叶片1非转基因水稻皖粳97，2转p35S-mCrylAb基因水稻，3转pOsTSPI-mCrylAb基因水稻。图7稻纵卷叶螟实验室抗虫性鉴定_虫子和叶片A非转基因水稻叶片及其饲喂的稻纵卷叶螟，B转P35S-mCrylAb基因水稻叶片及其饲喂的稻纵卷叶螟。五具体实施例方式以下叙述本发明的实施例。应该说明，本发明的实施例只对本发明起说明作用，而没有任何限制作用。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。实施例1水稻、苏云金芽孢杆菌密码子的使用频率和偏好密码子根据GENBANK数据库中的信息，收集水稻92188条⑶S序列，共计34132283个密码子，苏云金芽孢杆菌中的496条CDS序列，共计211286个密码子，分析这些密码子在水稻和苏云金芽孢杆菌中的使用情况(http://WWW.kazusa.or.jp/codon/)，结果如表1。由表1知同一物种同一氨基酸，不同密码子被使用的频率有差异，有的密码子使用频率高，有的密码子使用频率低，如在水稻中，亮氨酸(L)密码子使用频率最高的为CUC，达到28.51%，使用频率最低的为UUA，只有6.79%。不同物种间，同一氨基酸使用频率最高的密码子往往不同，如丝氨酸(S)在水稻中最高频使用的密码子为UCC(20.77%)，而在苏云金芽孢杆菌中最高频使用的密码子为AGU(27.53%)。表1水稻和苏云金芽孢杆菌的密码子使用频率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>归纳水稻和苏云金芽孢杆菌中各氨基酸最高频率使用的密码子(偏好密码子)，结果见表2。由表2知，除色氨酸(W)和甲硫氨酸(M)没有简并密码子外，其他氨基酸的偏好密码子(包括终止密码子)在水稻和苏云金芽孢杆菌间都不相同。同时，苏云金芽孢杆菌的氨基酸偏好密码子第三位(末位)除亮氨酸(L)为G外，其它全部为A或T；而水稻的偏好密码子第三位全部为G或C，只有偏好的终止密码子第三位为A。这说明，在进化过程中，苏云金芽孢杆菌和水稻在选择偏好密码子上存在很大差异。分析物种的密码子偏好性差异，对利用偏好密码子改造基因，使外源基因在不同物种中稳定高量表达提供前提依据。表2水稻和苏云金芽孢杆菌的偏好密码子<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2mCryIAb基因的设计及序列分析CrylAb蛋白是一类由苏云金芽孢杆菌产生的对鳞翅目害虫具有毒害作用的伴胞晶体。选用表2中的水稻偏好密码子，对CrylAb蛋白的氨基酸进行逐一替换，获得一条新的DNA序列，并给这个DNA序列末端加上水稻偏好的终止密码子TGA，形成一个新基因，该基因被命名为mCrylAb，序列如SEQIDNO:1。FMCrylAb基因为FREDERICKJ.PERLAK等根据植物密码子和碱基组成设计出的一个新基因，该基因已被证实在烟草和番茄中表达量大大提高。分析CrylAb、mCrylAb和FMCrylAb三个基因密码子使用情况，结果如表3。由表3知=CrylAb基因编码蛋白的20种氨基酸使用了58个密码子(共61个氨基酸密码子)；FMCrylAb使用了55个密码子，但密码子的使用频率与CrylAb基因相比，已经发生较大变化；mCrylAb只选用了22种密码子，只有S和R两种氨基酸选用了两种密码子，而有39个密码子在该基因中没有被使用一次。因此mCrylAb基因的密码子组成与CrylAb和FMCrylAb相比，已经发生很大改变。表3CrylAb、mCrylAb和FMCrylAb三个基因密码子使用情况<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>进一步分析CryIAb、FMCrylAb和mCrylAb基因的碱基组成，结果见表4。由表4知CrylAb,FMCrylAb和mCrylAb三个基因的GC含量呈明显上升趋势，mCrylAb的GC含量高达64.7%，高出CrylAb基因27.4%，高出FMCrylAb基因16.2%0表4CryIAb,FMCrylAb和mCrylAb基因碱基成分分析<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>分析CrylAb、FMCrylAb和mCrylAb基因间的序列差异，结果见表5和图1。表5显示mCrylAb与CrylAb间的序列，总碱基数为1845，不同的碱基数达565个，差异率达30.62%;mCrylAb与FMCrylAb间的不同碱基数达346个，差异率达18.75%。可见，mCrylAb与CrylAb和FMCrylAb在碱基组成上均有较大差异。表5=CrylAb,FMCrylAb和mCrylAb基因序列差异性分析基因2相同的~不同的总碱基数相似性差异性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>GENBANK数据库中Blast比对结果显示无与mCrylAb基因序列一致的记录，最高同源序列为gb:AY326434.1，同源性仅为89%(1664/1852)。可见，mCrylAb是一个全新的基因。将设计好的mCrylAb基因送上海英俊公司全基因合成后，连接于pMDIS-T载体上，形成pMD18-mCrylAb载体，并装载入大肠杆菌JMllO菌株中。实施例3含有mCrylAb基因表达载体的构建(l)p35s_mCrylAb载体的构建用Axygen质粒提取试剂盒提取pMD18_mCrylAb载体(大肠杆菌JMllO菌株中)DNA。PCR扩增mCryIAb基因，引物序列35S-newBTPGATAACCTGAAGACTCCATGGACAACAACCCGAACATCAACG,35S-newBTRCCAGCATTGAAGACTCGTCACCTCAGTACTCGGCCTCGAAGGTCACC,扩增体系<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>扩增条件为94°C5min；94°C30s60°C30s72°C30s共30个循环，72°C7min。取5uLPCR产物琼脂糖电泳，检测目的片段，对剩下的PCR产物进行回收，超纯水溶解，用BclI酶(购自上海生工，按说明书进行)切PCR片段，琼脂糖电泳，胶回收目的片段(Axygen胶回收试剂盒)。Axygen质粒提取试剂盒提取pCAMBIA1305.1质粒(大肠杆菌JMllO菌株中)DNA，用NcoI和BstEII双酶切载体PCAMBIA1305.1，胶回收载体片段(Axygen胶回收试剂盒)。T4连接酶连接上述的两个回收DNA片段，T4连接酶购子(大连宝生物公司)，具体操作按照T4连接酶说明书进行。大肠杆菌JMl10感受态细胞制备如下①挑取单菌落于IOOmLLB培养液中，37°C，200rpm振荡培养过夜；②按110接种量接种于IOOmLLB液体培养液上，37°C，200rpm培养2_3hr至0D600为0.30.4；③菌液置冰浴20min，4°C下4000Xg离心5min，弃上清；④菌体重悬于30mL冰预冷的0.IMCaCl2中，冰浴30min；⑤4°C下4000Xg离心5min收集菌体；⑥重悬于3mL0.lmol/LCaCl2中，冰浴4_10h，分装成200μL，_70°C保存备用或4°C一周内用完。连接产物转化JMllO感受态细胞的步骤如下①取100μL感受态细胞悬液加10μL连接反应产物，混勻，冰上放置30min；②42°C水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟；③向管中加入ImlLB液体培养基(不含Kan)，混勻后37°C振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Kanr)；④将上述菌液10000Xg离心Imin后，弃上清，留100μL涂布于含Kan(50μg/mL)的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养16-24小时；菌落PCR检测转化的单菌落，取0.2mLPCR薄壁管，按照上述扩增PCR反应体系配制混合液(不加模板DNA)，用无菌牙签分别挑取单菌落混合到PCR反应液中，PCR扩增和电泳同前述。挑取菌落PCR检测为阳性的单菌落，IOmLLB培养基过夜摇菌培养，送上海英俊公司测序，检测mCrylAb基因序列的正确性。对测序正确的单菌落，提取质粒DNA(Axygen质粒提取试剂盒)，冻融发转化农杆菌EHA105，最终获得含有P35S-mCrylAb载体(图2)的农杆菌菌株。(2)p0sTSPI-mCrylAb载体的构建pOsTSPI-Gus载体是pCAMBIA1305.1质粒中GUS基因前的35S启动子为水稻非胚乳表达启动子OsTSPI所取代，形成的载体。利用上述p35S-mCrylAb载体构建的方法，用mCrylAbDNA分子取代pOsTSPI_Gus载体中的GUS基因，最终形成pOsTSPI-mCrylAb载体(图3)，用于转基因。实施例4转基因水稻的获得1愈伤组织的诱导取无菌斑饱满的水稻成熟种子，用70%酒精浸泡1.5min，再用加有一滴Tween-20的2.5%次氯酸钠于28°C振荡培养箱消毒45min，然后用无菌水洗至澄清。将经彻底消毒的种子置于诱导培养基上(培养基成分见表6)，32°C连续光照培养1周。取质地松脆、颜色鲜黄的35mm的胚性愈伤用于共培养。表6水稻遗传转化所用培养基培养基成分(mg/L)NB(N6macro,B5micro,B5vitamine)+CH300+Pro500+Gln500+2,4-D2.0+Sucrose3%+agar诱导培养基0.8%,pH5.8共培养培养基NB+2’4-D2.0+CH300+Pro500+Gln500+As39.6+sucrose3%+agar0.8%,pH5.8NB+CH300+Pro500+GIn500+2,4-D2.0+Hyg4.0+Carbicillin250+Sucrose3%+Agar0.8%,pH筛选培养基5.8分化培养基NB十CH300+Pro500+GIn500+6-BA2.0+KT0.5+Hyg2.0+Sucrose3%+Agar0.8%,pH5.8生根培养基1/2N6+NAA0.5+sucrose3%+agar0.8%,pH5.82根癌农杆菌的培养从平板上挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28°C振荡培养过夜，再按比例的接种量转接入50ml相同培养基中(含相应抗生素)培养8h左右(至0D_为0.5左右)。于4°C，5000rpm离心5min，收集菌体。后用5ml含100μmol/LAS的AAM液体培养基重新悬浮，将菌液转入50mL的含100μmol/LAS的AAM液培中，28°C摇床上培养至菌液OD6tlO至0.5。3.共培养取生长旺盛的水稻胚性愈伤组织置于无菌培养皿中，加入新鲜的农杆菌菌液(OD600=0.5)，其间轻缓晃动数次，Ih后将愈伤组织取出，置于无菌滤纸上以吸除残余菌液，随即转移至共培养基上，于25°C暗培养23天。4洗菌共培养后，挑取共培养的愈伤置于无菌三角瓶中，用含有250mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗多次，每次摇动数次，直至水中看不到丝状菌体。最后一次清洗时静止lh，让黏附于愈伤上的农杆菌充分扩散到水中。最后，加入含500mg/L的羧苄青霉素的无菌水于25°C的摇床上120rpm摇2h，之后倒掉液体，置愈伤于无菌滤纸上吸干多余水分。5抗性愈伤的筛选将愈伤转移到筛选培养基上，置25°C培养箱内暗培养，其间注意定时检查是否有农杆菌污染。每两周转接ι次。培养48周，多数愈伤褐化死亡，有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。挑选这些抗性愈伤继续在筛选培养基上继代生长，然后转移到分化培养基上。6抗性愈伤的分化培养将抗性愈伤转入分化培养基上，26°C暗培养1周，然后转入25°C光照培养(16h光照，8h黑暗)。7转基因植株的再生及幼苗移栽转移到分化培养基上的愈伤组织，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。再生的小苗长至23cm左右时，转移至生根培养基，继续光照培养至待苗高710cm，打开瓶盖于温室中炼苗57天。后移温室(注意保湿，以提高移栽成活率)。实施例5转基因植株的分子检测1)PCR检测采用SDS法提取再生水稻植株叶片DNA，具体步骤如下①取8cm左右的叶片放入2.OmL的离心管中，加入液氮用玻璃棒研磨成粉末②加入700μLSDS提取缓冲液，60°C水浴Ihr；③加入等体积的氯仿/异戊醇(241)，室温静置30min；④4°C12000Xg离心IOmin；⑤将上清转移到1.5mL干净的离心管中，加0.6倍体积的异丙醇，混勻后静置30min；⑥4°C12000Xg离心lOmin，弃上清；⑦加70%乙醇，洗涤沉淀，4°CIOOOOXg离心5min，；⑨加IOOulLH2O溶解DNA用提取的DNA作为模板进行PCR鉴定，检测的引物序列为Primer-F5'TGTCCCTCTTCCCGAACTACG3，Primer-R5'GAGGTGCGGGCTCCTGATGG3’片段大小为158bp。反应体系参见表，<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>扩增条件为94°C5min-MV30s58°C30s72°C30s共35个循环，72°C7min。琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为2.0%(图4)。由电泳结果知所有的转基因水稻苗DNA均能扩增出158bp的目的条带，即获得的转基因苗均整合了mCrylAb基因。2)CrylAb/Ac试纸条鉴定CrylAb/Ac试纸条能灵敏检出植株体内的CrylAb和CrylAc两类蛋白。取水稻叶片约5cm，装入1.5mL离心管，加入50mL纯水，用Tip头捣碎叶片至液体呈现绿色，放入试纸条，并保证液面不超过试纸条的Max线，放置1分钟，取出后再放置1分钟，观察试纸条结果。所有的转基因单株试纸条检测结果见表6和表7，汇总结果见表8。共检测转P35S-mCrylAb转基因苗22株，有17株呈阳性，阳性率为77.3%。共检测转pOsTSPI-mCrylAb转基因苗47株，有39株呈阳性，阳性率为88.6%。随机挑选试纸条检测叶片为阳性的转基因单株，分别检测其茎、颖壳、种子和胚乳中的CrylAb蛋白表达情况，结果由P35S-mCrylAb载体获得转基因苗在叶片、茎、颖壳、和胚乳中都能检测到CrylAb蛋白，而由pOsTSPI-mCrylAb载体获得转基因苗在叶片、茎、颖壳、都能检测到CrylAb蛋白，而在胚乳中未能检测到CrylAb蛋白(图5)。这与35S和OsTSPI启动子的特性是一致的，35S为组成性启动子，而OsTSPI为组织特异性启动子，在水稻胚乳中不表达。表6p35S_mCrylAb转基因植株试纸条和田间抗虫性鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注“+”表检测为阳性，“_”表示检测为阴性；“有虫”指在植株上能看到大螟、二化螟、稻纵卷叶螟的危害状，如白穗、卷叶、虫口取食痕迹等。“无虫”指植株无螟虫的危害症状。表7p0sTSPI-mCrylAb转基因植株试纸条和田间抗虫性鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注“+”表检测为阳性，“_”表示检测为阴性；“有虫”指在植株上能看到大螟、二化螟、稻纵卷叶螟的危害状，如白穗、卷叶、虫口取食痕迹等。“无虫”指植株无螟虫的危害症状。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>随机挑选CrylAb/Ac试纸条检测为阳性两个载体的转基因单株各5株，用CrylAb/CrylAc平板试剂盒(购自Envirologix公司)进行定量分析。取转基因单株的叶片用液氮磨成粉末，称取0.02g左右粉末于1.5ml离心管中，加入500ul提取缓冲液，剧烈振荡后稀释400倍，取50ul用于测量，测量方法依照试剂盒说明书进行，以非转基因单株叶片为阴性对照。以标准品的浓度梯度(0.02ng、0.016ng、0.008ng和Ong)绘制标准曲线，用于样品的定量分析。测量结果见表9，由表9知p35S-mCrylAb转基因植株叶片BT毒蛋白平均表达量为6.02ng/mg,p0sTSPI-mCrylAb转基因植株叶片BT毒蛋白平均表达量为8.43ng/mg。PEPC-CrylAb转基因株系(由新加坡淡马锡研究院惠赠，CrylAb基因前的启动子为绿色组织特异表达启动子PEPC，纯系)叶片平均BT毒蛋白表达量为2.02ng/mg。2001年，舒庆尧等用EnvirologixCrylAb/CrylAc平板试剂盒测量克螟稻1、克螟稻2(CrylAb基因由35s启动子驱动)的米样，表达量在1.5ng/mg-3.lng/mg之间。表9转基因植株ELISA检测p35S-mCrylAb转基因植株pOsTSPI-mCrylAb转基因植株取样号粉末重量(g)OD值浓度(ng/mg)取样号粉末重量(g)OD值浓度(ng/mg)‘20.02091.0666.333834260.01920.979<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例6转基因植株的抗虫性鉴定1)田间抗虫性观察将获得的转基因苗种植于网室，并且全生育期不施农药，花后15天观察植株抗虫性，以非转基因的皖粳97作为阴性对照。田间观察时，只要植株上出现卷叶、白穗、驻洞、缺口，均认为不抗虫。植株无明显虫害，植株健壮，认为抗虫。花后15天，阴性对照已表现出严重的螟虫危害状，所有单株叶片全卷(2009年试验地合肥大螟和二化螟发生不严重，没有见到明显的白穗，但稻纵卷叶螟发生严重)。转基因植株田间抗虫鉴定统计结果见表6和表7。由表6知22株P35S-mCrylAb转基因苗中抗虫单株为18株，抗虫率为81.8%;47株P35S-mCrylAb转基因苗中抗虫单株为38株，抗虫率为80.9%。需要说明的是试纸条检测结果与田间抗虫性观察结果基本一致，即试纸条检测为阳性的单株，一般都具有抗虫性，试纸条检测为阴性的单株，一般都不抗虫。这说明转基因植株的抗虫性是由BT毒蛋白引起的。但是也有个别单株例外，如转P35S-mCrylAb的25号单株，转pOsTSPI-mCrylAb的1号、15号单株，试纸条检测为阴性，但是却未有发现螟虫危害，可能是由于为抗性单株包围，而避免了螟虫危害。而转pOsTSPI-mCrylAb的17号、29号和39号单株，试纸条检测为阳性，但是却发现有虫危害，分析可能的原因，其一，与BT毒蛋白表达量有关，不同的转基因单株表达量不同，虽呈阳性，但是表达量偏低导致抗虫性不明显；其二，与抗虫性调查尺度有关，本试验调查植株受害情况，有螟虫危害计为不抗虫，被虫少量取食后，虫子死亡或逃脱，实为抗虫单株，可能被计为不抗虫单株。2)试验室抗虫性鉴定随机抽取CrylAb/Ac试纸条检测为阳性的转基因水稻和非转基因水稻单株各五株，每株采集12cm长的叶子各5片，置于底部装有琼脂的大试管中。从田间收集稻纵卷叶螟的幼虫(约3龄)，每个试管中接虫5头，用保鲜膜覆盖试管，并用针在保险膜上刺出透气孔，至于28°C光照培养箱中，4天后调查结果。试验结果显示所有非转基因植株的叶片接虫4天后全部卷曲，叶片变枯白，为明显的稻纵卷叶螟取食危害状。而转基因水稻叶片无明显变化，叶绿(图6)。打开试管，取出叶片和虫子，发现非转基因水稻叶片上的虫子明显比转基因水稻的叶片上的虫子大；被取食的叶片量也明显不同，非转基因水稻被吃成白色网状，而转基因水稻却很少被取食(图7)。序列表OrganizationApplicant----------------------Street农科南路40号City:合肥市State:安徽省Country:中国PostalCode230031PhoneNumber:0551_5160535FaxNumber:0551_5160535EmailAddress:sfsl08il63.com<110>0rgmizationName安徽省农业科学院水稻研究所ApplicationProject-------------------<120>Title一种人工设计的Bt抗虫基因及其应用<130>AppFileReference一种人工设计的Bt抗虫基因及其应用<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate—____Sequence--------<213>0rganismName人工合成<400>PreSequenceStringatggacaacaacccgaacatcaacgagtgcatcccgtacaactgcctctccaacccggag60gtggaggtgctcggcggcgagcgcatcgagaccggctacaccccgatcgacatctccctc120tccctcacccagttcctcctctccgagttcgtgccgggcgccggcttcgtgctcggcctc180gtggacatcatctggggcatcttcggcccgtcccagtgggacgccttcctcgtgcagatc240gagcagctcatcaaccagaggatcgaggagttcgccaggaaccaggccatctccaggctc300gagggcctctccaacctctaccagatctacgccgagtccttcagggagtgggaggccgac360ccgaccaacccggccctccgcgaggagatgcgcatccagttcaacgacatgaactccgcc420ctcaccaccgccatcccgctcttcgccgtgcagaactaccaggtgccgctcctctccgtg480tacgtgcaggccgccaacctccacctcagcgtgctccgcgacgtgagcgtgttcggccag540aggtggggcttcgacgccgccaccatcaacagccgctacaacgacctcaccaggctcatc600ggcaactacaccgaccacgccgtgcgctggtacaacaccggcctcgagcgcgtgtggggc660ccggactccagggactggatcaggtacaaccagttcaggagggagctcaccctcaccgtg720ctcgacatcgtgtccctcttcccgaactacgactccaggacctacccgatccgcaccgtg780tcccagctcaccagggagatctacaccaacccggtgctcgagaacttcgacggcagcttc840cgcggctccgcccagggcatcgagggctccatcaggagcccgcacctcatggacatcctc900aacagcatcaccatctacaccgacgcccacaggggcgagtactactggtccggccaccag960atcatggcctccccggtgggcttcagcggcccggagttcaccttcccgctctacggcacc1020atgggcaacgccgccccgcagcagcgcatcgtggcccagctcggccagggcgtgtacagg1080accctctcctccaccctctacaggaggccgttcaacatcggcatcaacaaccagcagctc1140tccgtgctcgacggcaccgagttcgcctacggcacctcctccaacctcccgtccgccgtg1200tacaggaagagcggcaccgtggactccctcgacgagatcccgccgcagaacaacaacgtg1260ccgccgaggcagggcttctcccacaggctcagccacgtgtccatgttccgctccggcttc1320agcaacagctccgtgagcatcatcagggccccgatgttctcctggatccaccgcagcgcc1380gagttcaacaacatcatcccgtcctcccagatcacccagatcccgctcaccaagtccacc1440aacctcggctccggcacctccgtggtgaagggcccgggcttcaccggcggcgacatcctc1500aggaggacctccccgggccagatcagcaccctcagggtgaacatcaccgccccgctctcc1560cagaggtaccgcgtgaggatccgctacgcctccaccaccaacctccagttccacacctcc1620atcgacggcaggccgatcaaccagggcaacttctccgccaccatgtccagcggcagcaac1680ctccagtccggcagcttcaggaccgtgggcttcaccaccccgttcaacttctccaacggc1740tccagcgtgttcaccctcagcgcccacgtgttcaactccggcaacgaggtgtacatcgac1800cgcatcgagttcgtgccggccgaggtgaccttcgaggccgagtactga1848<212>Type:DNA<211>Length1848SequenceName:1SequenceDescription权利要求一种人工设计的Bt抗虫基因，该基因核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2.一种表达盒，其特征在于引入了权利要求1描述的基因或DNA分子。3.—种表达载体，其特征在于包含权利要求2所述的表达盒。4.一种获得转基因植物或植物部分的方法，其特征是该方法应用了权利要求1-3所述的基因、DNA分子、表达盒或载体。5.根据权利要求4所述的植物包括粮食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物。6.根据权利要求4所述的植物部分包括细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。7.一种防治害虫的方法，其特征是该方法应用权利要求4-6的转基因植物或植物部分防治昆虫，所述害虫是二化螟、三化螟、大螟、稻纵卷叶螟、玉米螟、棉铃虫、棉红铃虫、粘虫、甜菜夜蛾。8.一种利用物种密码子偏好性设计和改造基因的方法，该方法使改造后基因每个氨基酸密码子为1-2种。全文摘要本发明人工设计出一条全新的Bt基因，命名为mCry1Ab，同时构建了mCry1Ab基因的表达盒和表达载体，并转化水稻。Cry1Ab/Ac试纸条检测结果显示，转基因植株体内存在BT毒蛋白，且BT毒蛋白的平均表达量达7.23ng/mg。室内和田间抗虫性鉴定都显示转基因植株具有明显的抗虫效果。文档编号C12N5/10GK101818157SQ20091018577公开日2010年9月1日申请日期2009年12月2日优先权日2009年12月2日发明者倪大虎,吕玉萍,宋丰顺,尚玉花,张毅,李浩,李笑寒,李莉,杨剑波,段永波,汪秀峰,陆徐忠申请人:安徽省农业科学院水稻研究所