专利名称：适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种康乃馨的内标准基因、制备方法以及应用，具体涉及一种适合转
基因康乃馨中外源基因定性、定量检测及拷贝数检测的内标准基因，属生物工程技术领域。
背景技术：
所谓的内标准基因，是某种植物中具有种间特异性，种内非特异性，低拷贝数特征 的一类基因。种间特异性指的是选定的基因对于此物种是特异的，而在其他物种中具有很 低的同源性。可以通过网络数据库的生物信息分析获得初步的资料，选择候选基因，然后 通过实验的方法对候选基因进行筛选，最后选定合适的种间特异的基因作为植物内标准基 因。种内非特异性指的是内标准基因在同一物种的不同栽培种中具有很高的同源性和相似 性。另外，在植物转基因产品的定量检测中，内标准基因被用来作为定量检测的内对照，这 就要求内标准基因不仅在不同栽培种中具有种内特异性的特点，还要求其在不同的栽培种 中具有恒定的拷贝数。在对转基因产品进行定量检测中，定量检测的外源基因一般是低拷 贝的，如果使用的是品系特异性检测方法，那外源基因检测片段往往是单拷贝的，因此也要 求内标准基因具有低拷贝数的特点，一般内标准基因为1 3个拷贝，最理想的情况是1个 拷贝。 植物内标准基因因其种间特异性、种内非特异性和恒定拷贝数的特点，在转基因 植物及其加工产品的定性、定量PCR检测和转基因植物生产过程中外源基因拷贝数的测定 方面发挥着极其重要的作用。 在植物转基因及其加工产品的检测中，内标准基因的首要作用是确定检测样品的 物种来源。在转基因检测中，如果待检测的样品是植物原料，那产品的植物来源是可以很容 易从外观知道。但是对于植物加工产品，如面粉，食品，植物油等等产品，是很难从外观上分 清植物材料的来源。这时就需要内标准基因来对植物产品的来源进行鉴定。内标准基因是 物种特异性的，可以用来将这一物种与其他的物种以至近源种区别开来。因此通过建立内 标准基因的PCR检测系统可以准确的判断检测样品中的植物成分来源，为进一步分析奠定
^石出。 植物内标准基因可以对核酸提取的效果进行评价。在转基因产品检测过程中，核 酸提取的质量对于PCR结果有非常大的影响。由于植物材料之间有很大的差异，加工程度 也不尽相同，因此核酸提取方法也应根据不同的需要进行改进。在对样品提取的核酸进行 PCR分析之前，有必要对DNA提取的效果进行充分合理的评价，以保证PCR分析的准确性。 对于DNA质量的评定可以通过分光光度计法、琼脂糖凝胶电泳检测和荧光测定法进行。但 是这些方法只能对所抽提的核酸进行数量或质量上的粗略估计，并不能判断抽提的DNA溶 液中是否含有PCR反应的抑止因子。设立内标准基因作为实验的一个对照是解决这一问题 的有效方法。作为对照的内标准基因PCR体系的正常工作与否，可以指示抽提的样品DNA 能否用于进行PCR检测分析。因此，内标准基因是排除假阴性结果的有效手段。
内标准基因在植物转基因产品定量PCR检测中起到内参照的作用。转基因植物及 其产品的定量PCR检测可以分为两种方法，即绝对定量法和相对定量法。简单来说，绝对定 量法获的结果，是检测样品中的植物基因组或外源目的基因的绝对质量或拷贝数。相对定 量法获的结果，是检测样品中外源目的基因在样品基因组DNA中的百分含量，结果用外源 目的基因的拷贝数和植物基因组拷贝数的比值表示。在实际转基因检测和各国标签制度实 施时，依据的标准是样品中的具体转基因相对含量，其必须通过相对定量法分析获得，而绝 对定量在实际检测中则只能作为相对定量方法的一个过程。内标准基因用于植物基因组 DNA的质量或者拷贝数的定量分析。而且内标准基因对于转基因的定量检测起着决定性的 作用，没有合适的内标准基因是不可能对于转基因植物及其加工产品进行定量分析的，也 不能确定转基因植物及其加工产品的准确的转基因含量。 内标准基因在植物转基因产品的定性和定量PCR检测中都有非常重要的作用，国 际上对于植物内标准基因的研究也发展的非常快。到目前为止，具文献报道的用于转基因 检测中的内标准基因共有27个。其中大豆的Lectin基因是最早用于转基因抗草苷膦大豆 GTS40-3-2检测的内标准基因，Lectin基因是大豆中特有的凝集素基因，通过对Lectin基 因的检测，确定检测样品中是否含有大豆来源和判断检测样品DNA的质量，并在转基因大 豆定量检测中作为定量内参照。玉米的Zein、 zssllb、 hmgA、 Invertase和Adhl基因都曾 被用作内标准基因进行转基因玉米PCR检测，也有文章对玉米的这几个内标准基因进行了 比较，发现上述几个基因都适合于转基因玉米的定性PCR检测。 康乃馨花朵雍容富丽，姿态高雅别致，色彩绚丽娇艳，有着浓郁的香气，甜醇幽雅， 素有母亲之花的美誉，是一种重要的节日花卉，在国内外的需求量都很高。2003年，中国花 卉产量约67亿支，其中康乃馨的产量为14亿支，是中国产量最大的一种花卉。日本的三得 利公司和澳大利亚的Florigene公司的科学家们把从矮牵牛中克隆的DFR基因和F3' 5' H 基因通过农杆菌介导法转化入白色的康乃馨FE123，获得了花色呈蓝紫色的康乃馨。该种 康乃馨在日本已经获得开放系利用指针适合确认(9农会第784号、平成9年4月21日)； 在澳大利亚于1995年9月25日得到一般释放的承认；在荷兰于1997年12月得到欧盟的 市场认可。早在10年前，这几种转基因康乃馨在澳大利亚、日本、荷兰、欧盟就已经进入市 场化生产阶段。目前该种转基因康乃馨在中国已经进入环境释放阶段，在不久的将来将会 进入中国的市场。但是目前国际上尚未有康乃馨定性、定量检测的内标准基因的报道。为 了响应国际和国家对转基因植物管理政策，便于政府对转基因康乃馨进行监管，保护中国
在世界贸易活动中的经济利益不受侵害，加强对转基因康乃馨检测技术的研究是必不可少 的。因此筛选康乃馨的内标准基因的意义十分重大。
发明内容
本发明就是为了解决上述问题，克服尚未有康乃馨定性、定量检测的内标准基因
的情况，提供一种适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因。该发明适用于转基因康
乃馨外源基因定性、定量PCR检测及拷贝数分析的内标准基因。 本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现 作为本发明的第一方面，适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因，其特征
在于，康乃馨内源基因ANS(anthocyanidin synthase) (GeneBank NO. AX023246. 1)，并根据该内标准基因设计定性、定量PCR检测的外源基因的引物和探针，其中所述ANS基因的长度 为420个bp的DNA片段。 ANS(anthocyanidin synthase) (GeneBank NO. AX023246. 1)是康乃馨内源基因。 将该基因在GENEBANK上分析结果表明找不到连续50bp与其同源的DNA片段。图1显示 定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。 所述ANS基因的核苷酸序列具备一致性，即所有的康乃馨品种含有ANS基因。
所述ANS基因的核苷酸序列具备种间特异性，即在其他物种里没有该基因过该 DNA片段。 所述ANS基因在康乃馨基因组中的拷贝数是1。 本发明的第二方面，一种适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因的制备方 法，其特征在于，包括以下步骤 (1)本利用生物信息学手段对康乃馨序列进行分析，获取了康乃馨的内源基因 ANS序列(参见图1); (2)设计PCR引物和探针，通过利用PCR法，定量PCR法分别对14种不同品种的康 乃馨和15种其它物种进行检测，表明康乃馨ANS基因种间特异性，种内非特异性的特点；
(3)通过利用Southern杂交的方法对10种不同品种康乃馨进行ANS基因拷贝数 分析，结果表明IO种不同品种康乃馨中ANS基因都是I个拷贝。通过这些实验结果表明 ANS基因符合内标准基因的特点。 所述PCR引物包括定性PCR引物和定量PCR引物，定性PCR引物为ANS-F1/ANS-R1 ， 定量PCR引物为ANS-F2/ANS-R2，(参见图1)。所述定性PCR引物ANS-F1的核苷酸序列为CTAAAGC CCAGTTGTCGTCT ;所述定性PCR引物ANS-R1的核苷酸序列为ACCTTGTATGTCGCCATC。所述定量PCR引物ANS-F2的核苷酸序列为CCTAA ATGTAAGAACAACGCAATCA ;所述定量PCR弓I物ANS-R2的核苷酸序列为GCGTAGCGCTGAACATCGT。所述定量PCR探针为ANS-probe，所述探针的序列为TATAAGACCAATAA ATGGTTGATG
GATGGAG。(参见图1) 作为本发明的第三方面，一种适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因的应
用，其特征在于，利用ANS基因，并根据该基因设计定性、定量PCR检测的外源基因的引物和
探针，用于定性、定量检测转基因康乃馨转基因成分。 利用参照ANS基因分析外源基因在转基因康乃馨中的拷贝数。 本发明的有益效果 本发明依据内标准基因的种内非特异性、种间特异性、单拷贝或低拷贝数三个标 准，通过生物信息学分析和分子生物学实验验证，在康乃馨中寻找到了符合上述标准ANS 基因作为转基因康乃馨定性、定量PCR检测的内标准基因。 本发明适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因，是康乃馨内标准基因ANS
基因，并根据ANS基因序列设计定性定量PCR检测的外源基因的引物和探针。 ANS基因作为转基因康乃馨定性、定量PCR检测及拷贝数分析的内标准基因。
以下结合附图和具体实施方式
来进一步说明本发明。 附图1. ANS片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。 附图2、ANS基因种内非特异性鉴定结果照片。 附图3、 ANS基因种间特异性鉴定结果照片。 附图4、ANS基因种内非特异性定量鉴定。 附图5、 ANS基因种间特异性定量鉴定。 附图6、 ANS基因定性PCR检测灵敏度照片。 附图7、 ANS基因定量PCR检测灵敏度照片。 附图8、 Southern-Blot分析内标准基因的拷贝数照片。
具体实施例方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具
体图示，进一步阐述本发明。 实验过程( — )实验材料 1、植物材料 康乃馨非转基因品种桑巴、卡曼、笑颜、田园、媚娘、樱花、马斯特、红袖、白雪、幻 想、火焰、自由、兰贵人、粉黛品种(上海振东园艺提供)。 其他常见作物月季、矮牵牛、菊花、百合、唐菖蒲、非洲菊、金鱼草，常见的其他植 物油菜、玉米、水稻、大豆、小麦、大麦、拟南芥等植物(月季、矮牵牛、菊花、百合、唐菖蒲、 非洲菊、金鱼草购于上海花卉市场，油菜、玉米、水稻、大豆、小麦、大麦、拟南芥本实验室提 供)。 2、酶与试剂 限制性内切酶、dNTPs、 DL2000Markers、 Taq DNA聚合酶及其缓冲液购自Takara。
T叫Man探针及引物由生物工程公司合成。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
3、实验仪器 DY-501型核酸电泳仪(上海精密科学仪器有限公司)
PTC-100型PCR扩增仪(Corbett Research, Australia)
BECKMAN公司的DUK640核酸和蛋白分析仪
ABI 7500定量PCR仪 其他仪器包括离心机、恒温水浴锅、培养箱、天平等。
( 二 )实验方法及过程
1.候选内标准基因的查找 转基因植物PCR检测中需要使用的内标准基因必须符合3个条件种内非特异性、 种间特异性、定拷贝性；为提高检测灵敏度，最好为单拷贝基因。 首先通过查阅文献来选取相应的单拷贝基因，其次通过网上BLAST来确定该基因 与其他作物的同源性，最后通过定量与定性PCR检测和Southern检测来确定该内标准基因的可用性。 2.植物DNA的提取与检测
1)植物DNA的提取 a)取适量的康乃馨样品放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取约 70mg-100mg磨碎的样品转入1. 5ml的Eppendorf管中； b)视材料量的多少，加入600-700ul已预热的CTAB缓冲液，轻轻混匀后，65。C水浴 保温1小时，期间间或振荡混匀； c)在管中加入等体积酚/氯仿(600-700ul)，上下颠倒充分混匀，静置抽提 lOmin j d) 12000rpmX 10分钟离心，吸取上清到一新的Eppendorf管中； e)加入与上清等体积的异丙醇(约600ul)，混匀，常温放置10min后，12000Xg离
心10min，去上清，保留沉淀； f)在沉淀中加入60ulTER， 37。C放置2min后用枪头将其充分混匀后，于37。C放置 约1小时； g)取出后补加140iU TE，再加入200iil酚/氯仿，混匀，静置片刻:h) 12000rpmgX 5min离心，取上清(约180 ii 1)，加入1/10体积3M NaAc和2倍体
积无水乙醇，_201:放置30min : i) 12000rpmX10min离心，去上清，加75%乙醇200 ii 1， 12000rpmX 5min离心，弃 上清，室温晾干，溶于50 iil无菌ddH20中。 2) DNA检测取3 iU提取的DNA溶液电泳，选用的电泳胶为1 %的琼脂糖凝胶，根 据其亮度和扩散程度来判断DNA的质量。利用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度与纯度。
3.内标准基因引物、探针的设计 利用Primer Primier5. 0禾P Beacon Designer2. 0软件设计针对康乃馨内标准基 因的特异性引物和探针。引物和探针设计时尽量使他们的动力学性质相似，采取的原则是 不发生错配、尽可能的减少引物自身及相互间形成引物二聚体的可能，选择3'端稳定性较 5'端稳定性低的引物，引物的GC%为40% 65% ， Tm值在50°C 65°C ，此外探针的Tm值 应高于引物的Tm值约l(TC。根据上述原则选择合适的引物和探针，必要时适当地进行修 改，见表l。 表1.定性和定量PCR反应引物及探针
PCR名称 名称 核苷酸序列(5'-3') 长度(bp)
ANS-F15' CTAAAGCCCAGTTGTCGTCT3'
定丝尸C7 ANS-R15' ACCTTGTATGTCGCCATC3'356 bp
ANS-F25' CCTAAATGTAAGAACAACGCAATCA3'91bp
ANS-R25' GCGTAGCGCTGAACATCGT3'
ANS5'HEX-TATAAGACCAATAAATGGTTGATGGATGGAG-TA
-probeMRA3' 4.内标准基因的定性检测鉴定
1)内标准基因种内非特异性鉴定 ANS基因种内非特异性鉴定以非转基因品种桑巴、卡曼、笑颜、田园、媚娘、樱花、 马斯特、红袖、白雪、幻想、火焰、自由、兰贵人、粉黛基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的 ANS-F1/ANS-R1引物对进行PCR扩增反应，其PCR反应条件为94°C预变性5分钟后，进入PCR 反应循环94。C变性30秒，56。C退火45秒，72。C延伸45秒共进行35个循环最后，72。C 延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10 ii 1产物在2%的琼脂糖上进行电泳检测。
2)内标准基因种间特异性鉴定 ANS基因种间特异性鉴定取常见的切花月季、矮牵牛、菊花、百合、唐菖蒲、非洲 菊、金鱼草，常见的其他植物油菜、玉米、水稻、大豆、小麦、大麦、拟南芥等植物的基因组DNA 为PCR反应模板，选用相应的ANS-F1/ANS-R1引物对进行PCR扩增反应.其PCR反应条件为 94预变性5分钟后，进入PCR反应循环94。C变性30秒，56。C退火45秒，72。C延伸45秒 共进行35个循环最后，72t:延伸5分钟后结束，反应结束后吸取10 iU产物在2%的琼脂 糖上进行电泳检测。 5.内标准基因的定量检测鉴定
1)定量反应体系的优化建立 为了获得高效灵敏的定量PCR反应系统，我们设计了不同引物探针浓度(弓|物初 始浓度为25pM，探针初始浓度为10pM)比例的定量PCR反应体系，通过相同的定量PCR反应 条件，筛选荧光值上升较快，荧光信号强并且反应重复性好的体系作为定量检测的反应体 系。 2)ANS种内非特异性鉴定以非转基因品种桑巴、卡曼、笑颜、田园、媚娘、樱花、马 斯特、红袖、白雪、幻想、火焰、自由、兰贵人、粉黛基因组DNA为PCR反应模板，选用相应的ANS-F2/ANS-R2引物对和ANS-Probe按照优化的反应体系进行定量PCR扩增反应进行PCR 扩增反应。其PCR反应条件为94t:预变性5分钟后，进入两步法PCR反应循环94°C 15秒， 60°C 45秒共进行45个循环。
3)内标准基因种间特异性鉴定 ANS基因种间特异性鉴定取常见的切花月季、矮牵牛、菊花、百合、唐菖蒲、非洲 菊、金鱼草，常见的其他植物油菜、玉米、水稻、大豆、小麦、大麦、拟南芥等植物的基因组DNA 为PCR反应模板，选用相应的ANS-F2/ANS-R2引物对和ANS-Probe按照优化的反应体系进 行定量PCR扩增反应进行PCR扩增反应。其PCR反应条件为94t:预变性5分钟后，进入两 步法PCR反应循环94°C 15秒，6(TC 45秒共进行45个循环。
6.内标准基因定性、定量检测灵敏度和精确度实验
1)内标准基因定性检测灵敏度 ANS定性PCR检测灵敏度非转基因康乃馨DNA以TE稀释为下列浓度，50， 5，
0.5，0. 05，0. 005，0. 0005ng/ii l，每个定性PCR反应取1 y 1，使反应中的DNA含量分别为
50， 5， 0. 5，0. 05， 0. 005， 0. 0005ng。利用相应的ANS-F1/ANS-R1引物对和定性鉴定的反应条
件进行PCR反应，反应结束后吸取10 1产物在2%的琼脂糖上进行电泳检测。 2)ANS定量检测灵敏度非转基因康乃馨DNA以TE稀释为下列浓度50， 5， 0.5，
0. 05， 0. 005， 0. 0005ng/ii l，每个定量PCR反应取1 y 1，使反应中的DNA含量分别为50， 5，
0. 5，0. 05， 0. 005， 0. 0005ng。利用相应的ANS-F2/ANS-R2引物对和ANS-Probe探针利用定
量鉴定的反应条件和体系进行定量PCR反应。 3)内标准基因定量检测重复性和重演性实验 上述康乃馨ANS内标准基因定量灵敏度检测实验进行三次重复实验。
7. Southern杂交
l)DNA探针标记 每次标准的反应可标记10ng至3ug线性的DNA，也可标记更大量的DNA，但所有的 成分和体积要相应增加。 DNA探针热变性，煮沸10分钟，迅速冷却于冰上5分钟，待用。取E卯endorf管
(1. 5ml)置于冰上，加下列试剂: 新鲜变性的DNA l-3ug 5ul ; 六聚核苷酸混合物(随机引物)2ul ; dNTP标记用混合底物 2ul ; 加无菌重蒸水至 19ul ; DNA聚合酶I大片段(Klenow) lul ; 在37。C保温至少60分钟，可到20h ; 煮沸5分钟，终止反应； 15000rpm离心30s，置于冰上待用。注标记好的探针也可放在-201:冰箱备用，用前要先进行变性处理。
2)植物基因组DNA酶切 取不同品种康乃馨卡曼、笑颜、田园、媚娘、樱花、马斯特、火焰、自由、兰贵人、粉黛 基因组DNA用BamHl进行酶切。
DNA 25ul(约10ug); ddH20 17ul ; 限制性内切酶(MBI，10u/ul)3ul ; 10*Buffer 5ul。 3)转膜 (1)利用lv/cm进行电泳，电泳完毕后，将凝胶移至一个玻璃干烤皿中，用锋利刀 片修去凝胶的无用部分，在凝胶左上角(以加样孔一端为上)切去一角，作为标记。
(2)将凝胶置于数倍体积的1. 5mol/LNaC1、0. 5mol/L NaOH中浸泡45分钟并且温 和的不断振摇，使DNA发生变形。 (3)将凝胶置于去离子水中稍事漂洗，随后浸泡于数倍体积的lmol/ LTris-HCl (PH7. 4) 1. 5mol/L NaCl中，于室温下温和地不断振摇，使之中和。更换中和液，使 凝胶继续浸泡15分钟。 (4)当凝胶仍处于中和液中时，用一张Whatman 3匪滤纸包裹一块玻璃板，做成一 个凝胶平台。将平台放入一个大干烤皿内，倒入转移缓冲液(ioxssc)，使液面略低于平台 表面。当平台上方的3匪滤纸湿透后，用玻璃棒赶出所有的气泡。(转移片段小于500bp， 使用20XSSC转移缓冲液)。 (5)用新的剪刀裁一张硝酸纤维素滤膜。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大lmm， 接触滤膜时需戴手套或用平头镊子，不能用有油腻的手接触滤膜。 (6)将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面浸湿为止，随后用20XSSC浸泡滤膜至 少5分钟，减去滤膜一角，使其与凝胶的切角相对应。 (7)从中和液中取出凝胶，将凝胶翻转使其背面向上。把凝胶放于平台上湿润的
3匪滤纸中央，滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。 (8)用Parafilm膜围绕凝胶周边，以此作为屏障。 (9)在凝胶上方放置湿润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。滤膜与凝胶 之间不应留有气泡。 (10)用2XSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3匪滤纸，湿润的滤纸放置在湿润 的硝酸纤维素滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。切一叠略小于3匪滤纸的纸巾， 将其放置在3匪滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃板，然后用一 500g的重物压实。
(11)使上述DNA转移持续进行8-24小时，每当纸巾浸湿后，应换新的纸巾。
(12)转移后，揭去凝胶上方的纸巾和滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的 一面在上，置于一张干的3匪滤纸上，用一支极软的铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样 孔的位置。 (13)从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶。以6XSSC溶液于室温浸泡滤膜5分钟。
(14)从6XSSC溶液中取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。于室 温晾干30分钟以上。 (15)将晾干的滤膜放在两张3匪滤纸中间，用真空炉与8(TC干烤30分钟至2小 时。 4)预杂交 用剪刀将膜溴酚蓝以下的部分剪去。放入杂交袋中，封口。加入65t:预热的Hyb高效杂交液5ml，排尽气泡，封口 。放入65t:水浴振荡杂交1-2小时。
5)杂交 (1)将标记好的探针放IO(TC煮10分钟，立即冰浴冷却。 (2)将杂交袋从水浴中取出，剪去一角并尽可能排尽袋中的预杂交液，取5mlHyb 高效杂交液，加入变性的探针，混匀。加入到杂交袋中，小心排尽气泡，65t:水浴振荡杂交过 夜。 6)洗膜 (1)剪开杂交袋，用镊子取出膜，放入装有20ml的2XSSC 0. 1% SDS溶液的平皿 中，在室温下振荡洗涤两次，每次5分钟。 (2)用镊子将膜转入0. 1XSSC、0. 1% SDS溶液(先放5(TC水浴预热)中，5(TC水 浴振荡洗涤两次，每次15分钟。 (3)用镊子将膜取出转入装有20ml洗涤缓冲液的平皿中振荡洗涤5分钟。
7)信号检测 (1)在杂交和严谨洗涤后，在洗涤缓冲液中浸润1-5分钟。
(2)在30ml阻断液中孵育30分钟。
(3)在10ml抗体液中孵育30分钟。 [OH2] (4)用30ml洗涤液洗涤2X 15分钟。
(5)在15ml检测缓冲液中平衡2_5分钟。 (6)在避光条件下，于10ml新鲜制备的显色底物液中反应显色。在显色过程中勿 摇动。
注意在几分钟内即有颜色开始沉淀，并在16h后完成 (7)当达到所需的点或带强度后，用50ml双蒸水或TE-缓冲液将膜漂洗5分钟终 止反应。结果可照相或复印备存。
(三).实验结果 1.候选内标准基因的查找及网上Blast结果ANS(anthocyanidin synthase) (GeneBank NO. AX023246. 1)是康乃馨内源基因。 将该基因在GENEBANK上分析结果表明找不到连续50bp与其同源的DNA片段。图1显示定 性定量PCR引物和探针核苷酸序列和位置。其中，ANS-F1/ANS-R1为定性PCR引物，ANS-F2/ ANS-R2为定量PCR引物，ANS-probe为定量PCR探针。
2.内标准基因的定性检测鉴定 ANS基因种内非特异性鉴定不同品种的康乃馨在设计的特异性引物的PCR扩增 反应中，PCR反应产物电泳显示在14个不同品种中都能扩增出大小为355bp、专一的条带， 条带大小与预期的一致。说明在康乃馨的不同品种中都含有候选基因ANS:从而说明康 乃馨ANS基因具有种内的非特异性。如图2，图2ANS种内非特异性鉴定结果照片。其中， M. marker (DL-2000) :1.桑巴2.卡曼3.笑颜4.田园5.媚娘6.樱花7.马斯特8.红
袖9.白雪IO.幻想ll.火焰12.自由13.兰贵人14粉黛15.无模板对照。
3.内标准基因种间特异性鉴定 ANS种间特异性鉴定常见的切花植物和其他植物在特异性引物的PCR扩增反应 中，PCR产物电泳分析显示在常见的切花植物和其他植物中没有扩增出特异性的条带，而阳性样品中有大小为356bp、专一的条带，说明在常见的切花植物和其他植物中不含有康乃馨 的ANS基因和与ANS基因同源性较高的基因。证明康乃馨ANS基因具有种间的特异性。见 图3，图3ANS种间特异性鉴定结果，M表示Marker (DL-2000) :1.康乃馨；2.月季；3.矮牵
牛；4.菊花；5.百合；6.唐菖蒲；7.非洲菊；8.金鱼草；9.油菜；10.玉米；11.水稻；12.大 豆；13.小麦；14.大麦；15拟南芥。 4.内标准基因的定量检测鉴定
1)定量反应体系的优化建立 为了获得高效灵敏的定量PCR反应系统，我们设计了不同引物探针浓度(弓|物初 始浓度为25pM，探针初始浓度为10pM)比例的定量PCR反应体系，通过相同的定量PCR反应 条件，筛选荧光值上升较快，荧光信号强并且反应重复性好的体系作为定量检测的反应体 系。优化体系见表2
表2 优化定量PCR反应体系
试剂 每反应中加入体积&1)
PCR缓冲液(10x,无镁离子)2.5
镁离子(25 mM)4
dNTPs (2 mM)2.5
正向引物(20nM)0.4
反向引物(20nM)0.4
探针(IO nM)0.5
热启动TaqDNA
聚合酶(5 U/pl)0.3
DNA模板(10ng4d)
双蒸水补足25jil 2)内标准基因种内非特异性定量鉴定 分别选用14个不同品种的的康乃馨DNA作为模板，选用相对应的引物，探针，反应 体系和反应条件进行定量PCR反应，结果显示康乃馨的内标准基因特异性的引物和探针在 不同品种的康乃馨中均能分别检测到相似的荧光信号，由此可以说明ANS基因在康乃馨品 种中均具有种内的非特异性。参见图4。
3)内标准基因种间特异性定量鉴定 分别选用康乃馨和月季、矮牵牛、菊花、百合、唐菖蒲、非洲菊、金鱼草、油菜、玉米、 水稻、大豆、小麦、大麦、拟南芥的DNA作为模板，选用相对应的引物，探针，反应体系和反应 条件进行定量PCR反应，结果显示针对康乃馨ANS设计的引物探针只能扩增康乃馨基因组 DNA，由此说明，康乃馨ANS基因具有种间的特异性。参见图5。
4).内标准基因定性、定量PCR检测灵敏度和精确度实验
(1)内标准基因定性检测灵敏度
ANS定性检测灵敏度以非转基因康乃馨DNA作为模板，非转基因康乃馨DNA以TE 稀释为下列浓度:，50，5，0. 5， 0.05， 0.005， 0.0005ng/iil，每个定性PCR反应取liil，使反 应中的DNA含量分别为50， 5， 0. 5，0. 05， 0. 005， 0. 0005ng。利用相应的ANS-F1/ANS-R1引物 对和定性鉴定的反应条件进行PCR反应，反应结束后吸取lOiU产物在2%的琼脂糖上进 行电泳检测。其中，M表示marker (DL-2000);其余各泳道为1 :50ng ;2 :5ng ;3 :0. 5ng ;4 : 0. 05ng ;5 :0. 005ng，6 :0. 0005ng ;7为无模板对照。电泳结果显示该定性PCR反应系统的检 测灵敏度为0.05ng。参见图6。
(2)内标准基因定量检测灵敏度 ANS定量检测灵敏度以非转基因康乃馨DNA作为模板，非转基因康乃馨DNA以TE 稀释为下列浓度:，50，5，0. 5，0. 05，0. 005，0. 0005ng/ii l，每个定量PCR反应取1 y l，使反 应中的DNA含量分别为50， 5， 0. 5，0. 05， 0. 005， 0. 0005ng。定量检测结果显示该定量PCR反 应系统的检测灵敏度为0. 005ng。结果参见图7。
5. Southern检测结果 Southern杂交结果显示我们所选用的康乃馨ANS基因为单一拷贝的内源基因。参 见图8。 1.卡曼、2.笑颜、3.田园、4.媚娘、5.樱花、6.马斯特、7.火焰、8.自由、9.兰贵人、 10.粉黛。 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
权利要求
适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因，其特征在于，康乃馨内源基因ANS(anthocyanidin synthase)(GeneBank N0.AX023246.1)，并根据该内标准基因设计定性、定量PCR检测的外源基因的引物和探针，其中所述ANS基因的长度为420个bp的DNA片段。
2. 根据权利要求1所述的适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因，其特征在于，所述ANS基因的核苷酸序列具备一致性，即所有的康乃馨品种含有ANS基因。
3. 根据权利要求1所述的适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因，其特征在于，所述ANS基因的核苷酸序列具备种间特异性，即在其他物种里没有该基因的该DNA片段。
4. 根据权利要求1所述的适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因，其特征在于，所述ANS基因在康乃馨基因组中的拷贝数是l。
5. —种如权利要求1所述的适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1) 本利用生物信息学手段对康乃馨序列进行分析，获取了康乃馨的内源基因ANS序列；(2) 设计PCR引物和探针，通过利用PCR法，定量PCR法分别对14种不同品种的康乃馨和15种其它物种进行检测，表明康乃馨ANS基因种间特异性，种内非特异性的特点；(3) 通过利用Southern杂交的方法对10种不同品种康乃馨进行ANS基因拷贝数分析，结果表明10种不同品种康乃馨中ANS基因都是1个拷贝。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述PCR引物包括定性PCR引物和定量PCR引物。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述定性PCR引物为ANS-F1/ANS-R1 ;所述定性PCR引物ANS-F1的核苷酸序列为CTAAAGC CCAGTTGTCGTCT ;所述定性PCR引物ANS-R1的核苷酸序列为ACCTTGTATGTCGCCATC。
8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述定量PCR引物为ANS-F2/ANS-R2 ;所述定量PCR引物ANS-F2的核苷酸序列为CCTAA ATGTAAGAACAACGCAATCA ;所述定量PCR引物ANS-R2的核苷酸序列为GCGTAGCGCTGAACATCGT。
9. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述定量PCR探针为ANS-probe，所述探针的序列为TATA AGACCAATAA ATGGTTGATGGATGGAG。
10. —种如权利要求l-9所述的适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因的应用，其特征在于，利用ANS基因，并根据该基因设计定性、定量PCR检测的外源基因的引物和探针，用于定性、定量检测转基因康乃馨转基因成分。
11. 根据权利要求10所述的应用，其特征在于，利用参照ANS基因分析外源基因在转基因康乃馨中的拷贝数。
全文摘要
适合转基因康乃馨外源基因检测的内标准基因，本发明依据内标准基因的种内非特异性、种间特异性、单拷贝或低拷贝数三个标准，通过生物信息学分析和分子生物学实验验证，在康乃馨中寻找到了符合上述标准ANS基因作为转基因康乃馨定性、定量PCR检测的内标准基因。定性PCR引物为ANS-F1/ANS-R1，定量PCR引物为ANS-F2/ANS-R2，定量PCR探针为ANS-probe。ANS基因作为转基因康乃馨定性、定量PCR检测及拷贝数分析的内标准基因。
文档编号C12Q1/68GK101705304SQ200910250218
公开日2010年5月12日 申请日期2009年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者吴潇, 唐雪明, 朱宏, 王金斌, 蒋玲曦, 谭芙蓉, 赵凯, 陶世如 申请人:上海市农业科学院