专利名称：永生的单能的猪picm-19h和picm-19b干细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及永生化的衍生的猪干细胞系PICM-19H，其能排它地分化成表达肝细胞 功能的肝细胞，所述肝细胞功能例如，可诱导的酶活性，诸如细胞色素P450(CYP450)活性； 还涉及永生化的衍生的猪干细胞系PICM-19B，其能排它地分化成表达胆管细胞功能的胆管 细胞并形成底外侧极化的细胞的完整的(汇合的)细胞单层；还涉及包含PICM-19H细胞 或PICM-19B细胞或二者的生物人工肝装置，在生物人工肝装置或支持物中使用PICM-19H 和/或PICM-19B干细胞系来减轻肝功能障碍的方法，在筛选实验中使用PICM-19H和/或 PICM-19B干细胞系来检测抑制或促进肝中外源物代谢所涉及的酶活性的化合物或新化学 实体和/或来检测由于肝中外源物和/或内源底物的代谢而产生细胞毒性、肝毒性或肝功 能障碍的化合物或新化学实体的方法；和包含PICM-19H细胞和/或PICM-19B细胞的筛选 实验试剂盒。
背景技术：
目前处于开发中的生物人工肝装置的生物组分需要具有体内样的肝细胞功能 的细胞系(Strain 和 Neuberger. 2002. Science 295 1005-1009 ；ChamuIeau 等人，2005. Metab. Brain Dis. 20 :327-335)。人或动物起源的肿瘤衍生的细胞系的肝功能毫无例外 地在它们的肝脏功能上有所缺陷，据推测是因为它们缺少正常的分化和不受控的生长特 征(Nyberg 等人，1994. Ann. Surg. 220(1) :59-67 ；Wang 等人，1998. Cell Transplant 7 459-468 ；Kobayashi 等 A, 2003a. J. Artif. Organs. 6 :236-244 ；Kobayashi 等人，2003b. Keio J. Med. 52 :151-157 ；Rodriguez-Antona φ A,2002. Xenobiotica 32 :505-520 ； Filippi等人，2004. J. Hepatol. 41 :599-605)。尽管用永生化的转基因转染的新细胞系正 处于开发和试验中，并不能确保这些细胞系不会遭受类似原因产生的类似问题(Hoekstra 禾口 Chamuleau. 2002. Int. J. Artif. Organs. 25 :182-191 ；Kobayashi 等人，2003b，同 上)。迄今为止，大部分临床上试验的生物人工肝装置已经使用新鲜的或冷冻的猪肝细 胞作为该装置中的细胞组分(Hoekstra和Chamuleau，同上；Demetriou等人，2004. Ann. Surg. 239(5) :660-670)。尽管使用这些“肝-采集的”肝细胞已经在患者支持物中取得 了一些功效(Demetriou等人，同上)，它们作为生物人工肝装置的细胞组分也有所缺陷， 这是因为采集的肝细胞在生物人工肝装置中迅速死亡，另外，所述细胞会受到患者的形成 的抗体和补体因子的攻击，且另外，这样的细胞制备物是可变的，因此，是潜在地不安全的 细胞来源(Rodriguez-Antona等人，同上；Filippi等人，同上；Di Nicuolo等人2005. Xenotransplantation 2 :286-292)。现在，为了研究肝细胞和肝细胞功能的任何不良反应而在体外进行的新的药理学 和化学药剂的大部分试验，是用原代肝细胞培养物、肝细胞细胞系或从肝组织或细胞衍生 出的微粒体制备物来进行的(Bertz 和 Granneman. 1997. Clin. Pharmaokinet. 32 :210-258 ；Yan 禾口 Caldwell. 2001. Curr. Top. Med. Chem. 1 :403-425 ；Vermeir 等人 2005. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 1 :75-90)。微粒体制备物尽管可用于有些评估，但是不能用于评估和 预测细胞酶诱导或转运过程(Shimada 等人，1994. J. Pharmacol. Exp. Ther. 270 :414-423 ； Gomez-Lechon等人，2004. Curr. Drug Metab. 5 :443-462)。新鲜的原代肝细胞培养物可以 提供肝细胞功能的体外模型，且可以从多个物种制备，包括从特定疾病状态动物模型制备 (Guillouzo, Α. 1998.Environ. Health Perspect. 106(Suppl. 2) :511-532 ；Ulrichova 等 Λ, 2001. Toxicol. Lett. 125 :125-132 ；Gomez-Lechon 等人，同上)。但是，即使优良品质的 肝细胞制备物在它们的体外生长和存活也受到限制，因此需要从来源肝组织连续获取新的 月干细胞(Guillouzo,同上；Hoekstra 禾口 Chamuleau，同上；Rodri guez—Antona 等人，同上)。 优良品质的人肝组织经常短缺，且必须总要经过处理，如同潜在地感染性的(Guillouzo， 同上；Hoekstra和Chamuleau，同上)。动物源肝组织可以以稳定的量得到，且通常没有 传染病危险，但是尽管如此，由于动物至动物遗传变异、动物健康、营养状况和应激水平 和可能最重要的细胞培养人员的制备肝细胞细胞悬浮液的技能，仍可能存在再现性问题 (Guillouzo,同上；DiNicuolo 等人，同上)。为了解决这些问题，已经使用了基于连续生长的(即，在功能上是永生的)肝细 胞细胞系的肝细胞模型。不幸的是，人或其它动物的永生的肝细胞细胞系在功能上有所 缺陷，这是由于它们固有的不衰退生长特性和缺乏正常分化，因此它们是测量正常肝细 胞代谢(尤其是I和II期酶反应和细胞运输性质，它们被用作估计体内毒物动力学和 药代动力学的基础)的差的模型系统(Guillouzo,同上；Hoekstra和Chamuleau,同上； Wilkening等人，2003. Drug Metab. Dispos. 31 :1035-1042 ；Yan和Caldwell，同上；Chandra 和Brouwer. 2004. Pharm. Res. (NY) 21 :719-735)。因而，需要用于预测体内肝生物转化和毒 性的改良的体外模型，以实现新化学实体的更快的生物学评估，并减少有争论的且昂贵的 云力物试验(Bertz 禾口 Granneman，同上；Guillouzo,同上；Yan 禾口 Caldwell，同上；Chandra 禾口 Brouwer,同上)。鉴于上面讨论的体外肝细胞模型的限制，普遍接受的是，表现出无限生长且仍然 正常分化的细胞系(例如，肝干细胞系)会为基于细胞的体外生物人工肝辅助装置提供最 好的生物组分。出于类似的原因，具有这些特征的肝干细胞系也是进行新化学实体的药理 学和毒理学评估并实现标准化的且可重复的评估的最好体外模型。在本文中，我们描述了满足这些要求的本发明的猪肝干细胞系PICM-19H和 PICM-19B,即ARS-PICM-19细胞系的2种衍生细胞系。ARS-PICM-19亲代细胞系和包含它 们的人工肝装置已经分别在美国专利号5，532，156和美国专利号5，866，420中受到专利保 护，它们通过引用以其整体并入本文。一种衍生的细胞系PICM-19H细胞系能分化成肝细 胞，且不再表现出分化并自我构成多细胞胆小管的能力。另一种细胞系PICM-19B看起来自 发地源自胆管分化细胞，但是产生在亲代ARS-PICM-19细胞系群体中未看到的独特的细胞 表型，即形成穹顶的极化的上皮。
发明内容
我们已经衍生出了 (1)仅分化成功能性肝细胞的单能猪肝干细胞系PICM-19H细 胞系，其源自能分化成肝细胞和胆管细胞的双能干细胞系，并将PICM-19H细胞确定为细胞系，且通过下述项目证实它分化成肝细胞它的形态学、可诱导的CYP450活性、血清蛋白生 成、低Y-谷氨酰基转肽酶(GGT)活性、氨清除能力和尿素生成能力，和(2)仅分化成功能 性胆管细胞(胆管上皮细胞)的单能猪肝干细胞系PICM-19B细胞系，其源自能分化成肝细 胞和胆管细胞的双能干细胞系，并将PICM-19B细胞确定为细胞系，并表明，所述细胞在培 养物中形成汇合的(完整的)细胞单层，是表现出基底膜流体运输的底外侧极化的细胞，具 有高GGT活性且具有极大减少的血清蛋白生成。根据该发现，本发明的一个目的是提供永生化的衍生的猪干细胞系，其能排它地 分化成表达肝细胞功能(即参与外源物代谢的可诱导的酶活性)的肝细胞。本发明的另一个目的是提供单能的PICM-19H干细胞系，其中主要酶活性是 CYP450活性，包括CYP1A1、CYP1A2或CYP3A活性。PICM-19H细胞的其它特征是低水平的 GGT活性、血清蛋白生产、尿素生产和清除氨的能力。本发明的再一个目的是提供单能的PICM-19H干细胞系，其中所述细胞系保藏为 ATCC PTA-9174。本发明的还一个目的是提供单能的猪干细胞系，其仅分化成表达胆管功能(即向 量流体运输)的胆管上皮细胞。本发明的又一个目的是提供PICM-19B干细胞系，其形成表现出基底膜流体运输 的底外侧极化的细胞的汇合细胞单层，且具有高GGT活性、低CYP450活性且无血清蛋白生 成。本发明的又再一个目的是提供单能的PICM-19B干细胞系，其中所述细胞系保藏 为 ATCC PTA-9173,本发明的一个目的是提供培养PICM-19H和PICM-19B干细胞的方法，其中使用或 不使用饲养细胞。本发明的一个目的是提供在无血清条件下培养PICM-19H和PICM-19B干细胞的方法。本发明的另一个目的是提供在筛选实验中使用单能的PICM-19H和PICM-19B干细 胞系来检测化合物的方法，所述化合物抑制或促进肝中外源物代谢所涉及的酶活性，或者 抑制或促进编码肝中外源物代谢所涉及的酶的基因的表达。本发明的另一个目的是提供在筛选实验中使用单能的PICM-19H和PICM-19B干细 胞系来检测由于外源物和/或内源底物的代谢而产生细胞毒性的化合物的方法。本发明的另一个目的是提供在筛选实验中使用单能的PICM-19H和PICM-19B干细 胞系来检测由于外源物和/或内源底物的代谢而产生致癌力的化合物的方法。本发明的又一个目的是提供在筛选实验中使用单能的PICM-19H和PICM-19B干细 胞系来检测由于外源物和/或内源底物的代谢而产生致突变性的化合物的方法。本发明的另一个目的是提供在筛选实验中使用单能的PICM-19H和PICM-19B干细 胞系来检测由于外源物和/或内源底物的代谢而产生肝毒性的化合物的方法。本发明的还一个目的是提供在筛选实验中使用单能的PICM-19H和PICM-19B干细 胞系来检测产生肝功能障碍的化合物的方法。本发明的又一个目的是提供在生物人工肝装置(诸如中空纤维生物反应器)中使 用单能的PICM-19H和PICM-19B干细胞系来体外处理需要这种处理的个体的体液(诸如全血、血浆和等渗灌洗-腹膜液)以减轻肝功能障碍的方法。本发明的再又一个目的是提供使用单能的PICM-19H和PICM-19B干细胞系培养物 来处理需要这种处理的个体的体液(诸如全血、血浆和腹膜液)以减轻肝功能障碍的方法， 所述培养物粘附在微珠上、粘附在无机或有机多孔支持物上、粘附在中空纤维上或包裹在 基于水凝胶的支持物中。从下面的描述将容易地明白本发明的其它目的和优点。
本美国专利或申请文件含有至少一幅彩色绘制的图。在请求并支付必要的费用 后，含有彩图的该专利或专利申请公开文本的复制件将由美国专利和商标局提供。图1显示了在200X放大率时与传代后3周后的PICM-19H细胞培养物(图1B)相 比较的传代后3-4周后的亲代ARS-PICM-19细胞培养物(图1A)的相位差显微照片。图2描述了由1 6分流比传代的第66代的PICM-19H生长曲线。图3A-F显示了独立PICM肝干细胞系(B、D和F)和经历向形成穹顶的上皮细胞的 表型转化的亲代ARS-PICM-19 (A、C和E)猪肝干细胞系的相位差显微照片QOOx)。在A-C 和B-D中显示了原代事件。注意到，PICM细胞沿着轴线(B中的箭头)对称地排列成致密 填充的圆柱形态，所述轴线是细胞之间的腔空隙(lumenal space)。所述腔空隙装满了黑色 物质，其在A中具有黄色(箭头)。图C和D描述了早期扩增，弯曲的箭头指示早期穹顶形 成，且C中的箭头指示集落扩增(colonial expansion)的边缘。在图E中，PICM-19B细胞 已经扁平化并扩散，小穹顶正在开始(双箭头)。在图F中，PICM变体细胞已经充分繁殖， 正在扁平化，且大穹顶已经出现在单层中(箭头)。条棒 50 μ m。图4描述了由1 12分流比传代的第64代的PICM-19B生长曲线。图5A显示了在6000X放大率的PICM-19H细胞的透射电子显微照片，所述细胞排 列成单层，位于大STO饲养细胞的上面。图5B显示了出现在PICM-19H细胞之间的胆小管 (c)，其具有有关的紧密连接部(箭头)。另外，注意到STO饲养细胞在PICM-19H细胞的上 面和下面(放大率33，800X)。图5C表明，在PICM-19H细胞中出现了一些液体空泡(L)(放 大率60, 000X)。图6显示了 PICM-19H细胞的透射电子显微照片，其突出了在细胞内存在的广泛的 高尔基复合体(G)、糙面内质网(RER)和许多线粒体(M)(放大率60，000X)。图7显示了 PICM-19H细胞的透射电子显微照片，它显示了什么作为糖原玫板 (GLY)的较差固定的区域的残留物而出现。另外，注意到胶原纤维(Col)层(推测由邻 近的STO饲养细胞生成)和板层状嵴特有地穿过PICM-19H细胞的线粒体(M)(放大率 94，500X)。图8A显示了 PICM-19B样细胞的透射电子显微照片，图8A显示出由紧密连接部 ⑴和有关的桥粒样连接部(d)连接到一起的2个细胞的顶(面向培养基)表面。另外，在 图8A中注意到刚好低于顶膜的分泌小泡(箭头)，它们是含有粘蛋白的小泡的特征，其具有 离心地定位的凝结的小球(双箭头)(放大率48，000X)。图8B显示了生长在STO饲养层 和它的胶原纤维基质上面的2个PICM-19B细胞。注意到在细胞顶膜处的微绒毛、侧向细胞 膜指状突起和典型的齿状的或少见地钝齿形的细胞核(放大率6，000X)。图8C表明粘着带型连接部可以在细胞之间变得稳健，尤其是在单层区域，在这里通过在它们的基底膜下 的流体运输和积累而形成穹顶(放大率60，000X)。图9显示了 PICM-19B样细胞的透射电子显微照片。具有微绒毛(箭头)和纤毛 基体(双箭头)的细胞的顶表面。注意到多糖包被的染色，其也保留有沉淀的染色剂(箭 头)(放大率:120, 000X) ο图10显示了 PICM-19B样细胞的底部的透射电子显微照片，显示出含有许多平行 的棱晶形板的微体(箭头)。所述微体看起来具有具有双膜样线粒体。类晶体阵列可以是 过氧化物酶体的拟核，或可能是溶酶体内的凝结。注意到低于细胞底部的稀疏的基板(双 箭头)(N =细胞核；放大率J40，000X)。图11显示了 PICM-19B样细胞的透射电子显微照片。注意到具有基质颗粒(箭头) 的长线粒体和发育良好的高尔基体(G)，它们常见于细胞核(N)周围(放大率48，000X)。图12显示了针对GGT活性的组织化学染色的PICM-19H细胞单层的相位差显微照 片。箭头指示PICM-19H细胞之间的胆小管，显示了 GGT活性的阳性染色(红色)。图13显示了针对GGT活性的组织化学染色的亲代ARS_PICM_19肝干细胞培养物 的明视野(图13A)和相位差(图13B)显微照片。图13A显示了 PICM-19B样变体细胞的单 层扩增(大箭头)，因为它们长出并超过胆管上皮细胞(形成胆管的；小箭头)和肝细胞样 细胞(具有小管的立方细胞的单层片；箭头)的亲代表型。注意到这2种亲代的或常见的 分化表型从未接近汇合，如本文指出的，这是因为它们在发生该现象之前在末端分化良好。 相反，变体PICM-19B样细胞会继续生长，直到达到如图1 所示的汇合。(A)中的条棒是 95 μ m, (B)中的条棒是 50 μ m。图14描述了通过EROD试验测得的PICM-19细胞系中的3-甲基胆蒽诱导的CYP450 活性。未诱导的CYP450值低于检测限，未显示。ND=不可测出。图15显示了培养几乎汇合的PICM-19H细胞(图15A)或PICM-19B细胞(图15B) 单层48h的无血清培养基样品的二维聚丙烯酰胺凝胶。用胶态考马斯蓝将凝胶染色，并指 出一些血清蛋白，它们通过MALDI-T0F和LC-MS来鉴别(也参见表2)。图16描述了向测试的3种PICM-19细胞系的培养物的细胞培养基中不加入(对 照)和加入12μπι01 NH4Cl时的氨清除和尿素生成。在每个条棒上面的值是被细胞转化成 尿素氮的加入的NH4Cl氮的百分比。图17描述了用苯巴比妥、利福平和3-甲基胆蒽(3-MC)在PICM-19H细胞中诱导多 个CYP450亚型。将培养物暴露于等效体积的PBS、在完全培养基中的DMSO (0. 1 %终浓度)、 ImM苯已比妥(ΡΗΒ)、50μΜ利福平(Rif)或5μΜ 3_MC。4 后，将培养基替换为特异性的 酶底物培养基，测定特异性的CYP(ER0D、MROD, MFCD和BFCD)的活性。将新鲜的培养物(η =3)用于每个CYP450分析，值是3个独立试验的平均值士SEM。图18描述了在对照和利福平-诱导的PICM-19H细胞中的睾酮代谢物的测定。将 培养物暴露于50μΜ Rif或0. 1%DMS0 48小时，然后与睾酮一起温育lh。通过定量LC-MS， 测定6-β羟基-睾酮(6 β ΟΗΤ)、2_ α羟基睾酮QaOH Τ)和2_β羟基睾酮O β OH Τ)的 浓度。值是在一式三份培养物中进行的3个独立实验的平均值士SEM。图19显示了 STO(小鼠胚胎成纤维细胞细胞系)细胞、成年猪肝细胞(ΑΡΗ)、 PICM-19H细胞和人肝细胞瘤衍生的!fepG2-C3A细胞中CYP450活性的对比。将一式三份培养物暴露于0. 1 % DMSO (对照)禾Π 50 μ M Rif或5 μ M 3-MC 48小时，并分别测定BFCD和 EROD活性。值是3个独立实验的平均值士SEM。ND ；不可测出。图20显示了成年猪肝细胞(APH)、PICM_19H细胞和H印G2C3A细胞中II期代谢的 分析。用和不用葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶混合液温育培养基样品，测定诱导的 EROD和BFCD活性。测定了荧光产物(试卤灵或7-HCF)，并将混合液释放的产物的量报告 为总量的百分比。值是在一式三份培养物中进行的3个独立实验的平均值士SEM。ND;不 可测出。图21描述了 PICM-19H细胞中黄曲霉毒素Bl的生物活化。在96-孔微量培养板 中培养的0. 1% DMSO处理过的(对照)和3-MC诱导的PICM-19H细胞中，测定黄曲霉毒素 Bl的毒性。加入黄曲霉毒素Bl后，通过每个孔中的WST-I活性测定生存力。对于每种条 件，将每种浓度的黄曲霉毒素加入10个孔中。通过非线性回归分析合并的响应曲线；DMSO 和3-MC处理过的培养物的指数模型R2值分别是0. 967和0. 998。图22显示了在PICM-19H细胞中醋氨酚的毒性测定。通过在96-孔微量培养板中 培养的PICM-19H细胞中的WST-I活性，测定醋氨酚的毒性。制备9个独立的剂量响应曲线， 并使用S形响应曲线模型通过非线性回归进行分析。图23Α和2!3Β显示了在3D-中空纤维生物反应器中培养的PICM-19H细胞。图23Α 显示了单个中空纤维，其在灌注培养14天后用4%多聚甲醛固定化，然后用Hoechst核特异 性的荧光染料染色；放大率100Χ。图2 显示了单个中空纤维(正如在图23A中)，其具 有分离的PICM-19H单层部分(箭头)，且STO饲养细胞位于PICM-19H细胞下面，并粘附到 中空纤维表面上(单个STO细胞核用箭头指示)，放大率100X。图24A和24B显示了在有STO-GFP细胞(表达绿荧光蛋白GFP的STO饲养细胞)存 在下在微珠上生长的PICM-19H细胞。首先使STO-GFP细胞粘附到珠子上；然后将PICM-19H 细胞加入培养物。图24A描述了被蓝光(用于激发GFP荧光)激发的STO细胞。图24B显 示了所有细胞(ST0和PICM-19H)的荧光细胞核，因为紫外光会激发培养物染上的Hoescht 核染剂(浅蓝色核荧光)。对比图24B和24A可以鉴别出STO和PICM-19H细胞。图25显示了在球状体培养物中生长的PICM-19H细胞，即培养原代猪肝细胞的普 通方法。在悬浮培养物中培养PICM-19H球状体2周，然后如显示的重新附着到STO饲养细 胞的单层上。
具体实施例方式本发明的目的是提供会表现出无限生长但是仍然正常分化的单能猪肝干细胞 系PICM-19H，和提供会形成具有底外侧细胞极化和基底膜流体运输活性的完整单层的 PICM-19B ；提供含有PICM-19H细胞系、PICM-19B细胞系或二者的生物人工肝装置，和提供 用于估测体内毒物动力学和药代动力学的包含所述细胞系的快速筛选实验。已经表征了 PICM-19H和PICM-19B细胞系的I期和II期代谢功能；PICM-19H和PICM-19B细胞系可以 用于评估细胞酶诱导和转运过程。已经从植入前猪胚泡的全能胚胎干细胞(即上胚层细胞)的体外培养物衍生出了 ARS-PICM-19细胞系，即本发明的单能的PICM-19H和PICM-19B细胞系的双能亲代系，且刚 好是从猪胚胎干细胞自发分化的特异性细胞类型的许多细胞系之一(Talbot等人，1993. InVitroCell. Dev. Biol. 29A :543-554 ；Talbot 等人，1994a. In Vitro Cell. Dev. Biol. 30A 843-850)。在它们的传代史的早期，观察到亲代ARS-PICM-19细胞会形成胎儿肝细胞样 细胞的单层以及细胞自我构造成由胆管上皮细胞样细胞组成的多细胞管状结构的区域。 ARS-PICM-19肝细胞具有胎猪肝细胞的特有形态，即立方细胞，其具有通过紧密连接部和桥 粒连接到一起的位于中央的细胞核，以在细胞之间形成小管结构(Talbot等人，1994b. In Vitro Cell. Dev. Biol. 30A :851-858)。ARS_PICM_19细胞可以单细胞克隆，而不丧失分化和 分裂潜力。发现了 ARS-PICM-19培养物具有可诱导的CYP450活性(肝细胞的标志)和高 GGT活性(胆管上皮细胞的标志)(Talbot等人，1996a. Exp. Cell Res. 225-22-34)。它们也 与白蛋白和其它肝特异性的蛋白一起表达甲胎蛋白(Talbot等人，1994a, 1996a,同上)。胎 猪肝组织(Talbot等人，1994b，同上)和成年猪肝组织(Talbot和Caperna. 1998. In Vitro Cell. Dev. Biol. 34A :785-798 ；未公开的数据)的培养产生了在它们的分化潜力、形态学和 蛋白/酶表达方面非常类似于ARS-PICM-19细胞的细胞培养物。也证实了 ARS-PICM-19 小管对分泌素和cAMP诱导物的体内样响应，即以体内样动力学从底外侧向顶运输培养液 (Talbot 等人，2002. Cells Tissues Organs 171:99-116)。ARS-PICM-19 向胆管上皮分化 的标志是独特的体外细胞间和细胞内变化，即自我构造成柱状上皮的有功能的多细胞管状 结构(Talbot等人，199 ，1996a，2002，同上)。这些体外生产的胆小管非常类似于从胎儿 和成年猪肝组织的培养物体外生产的相似胆小管(Talbot等人，1994b，1998，同上)。因而， 已经证实ARS-PICM-19细胞在功能上是永生的(Talbot等人，1994a,同上)，且具有实质肝 细胞和胆管上皮细胞的特征CTalbot等人，1994a，1996a，同上)。这是ARS-PICM-19细胞中 最直接的表现，所述细胞自发地停止细胞分裂(每次传代后约10天)，并分化成至少2个显 著不同的形态学表型，一个类似于肝细胞，另一个自我构成多细胞的有功能的小管，其行为 象体内胆管(Talbot等人，1994a, 1996a, 2002，同上)。PICM-19H和PICM-19B是从上述ARS-PICM-19细胞系衍生出的2种不同的单能细 胞系。PICM-19H单能细胞系能分化成肝细胞，且不再表现出分化和自我构成多细胞胆小管 的能力。另一种细胞系PICM-19B看起来已经自发地源自亲代ARS-PICM-19细胞的胆管分 化细胞组分，且是在亲代ARS-PICM-19细胞群体中通常未看到的独特的分化的表型，即形 成穹顶的底外侧极化的上皮。描述了这些形态学上不同的细胞系的分离(参见实施例1)。 评价了衍生的细胞系，以评估它们保留肝细胞或胆管上皮细胞细胞功能的程度。具体地，由 于亲代ARS-PICM-19细胞系的细胞可以分化成肝细胞或胆管细胞(胆管上皮细胞)，评价了 这些具体衍生细胞系的细胞的性质，以确定它们在其细胞功能上是否或多或少地是肝细胞 样的，以及它们中的任一种是否具有新的独特的细胞特征，所述特征会增强它们在生物人 工肝装置和/或体外快速肝毒性试验中的实用性。如上所述，肝细胞系的一种具体用途是用作体外生物人工肝装置的生物组分。生 物人工肝在离体“生物反应器”中含有活细胞(通常是肝细胞或肝细胞和非实质的佐细胞 的某种组合)，患者的血液或血浆被泵入所述“生物反应器”，以在体外循环环路中与细胞相 互作用(Sussman 禾口 Kelly. 1995. Scientific American 2 :68-77 ；Strain 禾口 Neuberger, 同上；Sen 和 Williams. 2003. kminars in Liver Disease23(3) :283-294)。急性肝衰竭 的治疗需要这样的装置，这是因为除了肝移植以外，目前没有可利用的降低与该病症有关 的高死亡率的有效治疗选择(Sussman和Kelly，同上；Strain和Neuberger，同上；Sen和Williams，同上)。因而，本发明的PICM-19H和PICM-19B衍生的肝细胞系是用于生物人工肝装置的 候选物，因为它们具有永生的单能干细胞的特别特性。也就是说，PICM-19H细胞仅分化成 肝细胞，且不分化成胆小管。因而，在肝细胞功能是第一需要且不需要胆汁运输和调节功 能的那些情况下，与亲代ARS-PICM-19细胞可以提供的肝细胞功能相比，PICM-19H可以为 急性肝衰竭的治疗提供更好的肝细胞功能(Sussman和Kelly，同上Jtrain和Neuberger， 同上；Sen和Williams，同上)。类似地，PICM-19H细胞系为进行新化学实体的生物学评估 的筛选实验提供了优良模型。可诱导的CYP450活性是肝细胞的标志。所示的数据解释了 PICM-19H细胞系的可诱导的CYP450活性的特异性，且包括与以前关于亲代ARS-PICM-19细 胞系描述的数据(Talbot等人，1996a，同上)的对比，从而证实了 PICM-19H细胞系用于体 外毒性试验的实用性。也阐述了 PICM-19H用于生物人工肝装置的潜在用途。使PICM-19H细胞比亲代ARS_PICM_19细胞系更有利地用于生物人工肝装置的特 性是，PICM-19H细胞保留了关键的肝细胞功能，它们是非致瘤性的，且在体外表现出正常的 分化，它们可以维持在生物人工肝装置的生物反应器中相对长的时间段，它们的表型稳定 性(即，在约450次群体倍增的多代培养后不会自发出现PICM-19B样细胞)，从而可以确定 并常规地评估无病原体状态，且可以为了增强功能而将它们遗传工程化。2种PICM-19衍生物具有对比特征，以不同的方式使各自更适合用作生物人工肝 装置的细胞组分。PICM-19H细胞在所有度量中表现得更加“肝细胞样”；包括细胞和集落形 态学、超微结构特征、血清蛋白生成和代谢酶功能。数据表明，PICM-19H细胞在CYP450活 性、尿素生成和氨清除的关键肝功能方面是优越的。但是，因为PICM-19B细胞会生长至更 大的细胞密度，且也表现出这些关键的代谢功能(尽管在较低的水平)，PICM-19B细胞也 是用于生物人工肝装置的良好选择，特别在向量(即，底外侧的)运输是生物人工肝装置的 生物反应器的设计特性的情况下。另外，PICM-19B相对缺少血清蛋白分泌也是有益的，因 为人类患者的血液不会暴露于如此多的外来抗原(取决于生物人工肝装置中的透析膜的 分子量截止值)。PICM-19B的顶至基底细胞膜极化会提供一个优点，因为它证实了定向运 输(即，穹顶形成)可以潜在地将毒素从人类患者的血浆运出到外部废物流环路中，只要 PICM-19B细胞适当地构建在生物人工肝装置的透析膜上。在任意情况下且作为总结，本文 所示的数据指示用于生物人工肝装置的PICM-19H和PICM-19B细胞系的增强的功能。2种单能细胞系的可用性会提供设计和靶向生物反应器的内容物以适合患者的特 定功能需要的独特机会。细胞系PICM-19H和PICM-19B中的每一种都可以在生物反应器中 单独培养，或它们二者可以一起接种进生物反应器中，产生操纵各自的细胞数的机会，即根 据患者需要的功能以不同比例接种。已经提出，猪细胞可用于肝代谢功能的体外建模，并用作生物人工肝装置的细胞 组分，这是由于它们的人肝细胞代谢相似性(Donato等人，1999. J. Hepatol. 31 =542-549)。 在本研究中，我们关于重要的CYP450活性(CYP1A、2和3A)的存在和诱导已经表征了 PICM-19H细胞系。另外，使用试验底物证实了 II期缀合的程度是显著的，且与成年猪肝细 胞相当。证实了已知的肝毒素醋氨酚和黄曲霉毒素Bl以剂量依赖性的方式被代谢。这些数 据，与PICM-19H细胞系的其它被证实的肝分化功能和稳健的培养特征一起，指示PICM-19H 细胞可以提供生物人工肝装置的细胞组分，并也为肝细胞体外毒理学试验提供了改良的模型系统。CYP450包括具有外来物(即活有机体的身体以外的化学物质)的肝特异性代谢 所涉及的关键酶活性的细胞酶家族。外来物包括天然存在的化合物、药物、环境因素、致癌 物、杀虫剂等。从外源物的代谢所涉及的分布和功能的观点看，CYP450代表最重要的一类 酶。CYP450 是大量酶蛋白的通用名；CYPlAl、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、 CYP2C19、CYP3A(尤其是CYP3A4)是人肝中外源物的代谢所涉及的CYP450酶家族的已知成 员O另外，已知大量外来物代谢酶在特定条件下被诱导。众所周知的诱导物的实例包 括多环芳族化合物，诸如诱导CYPlAl和CYP1A2表达的苯并[A]芘、苯并蒽、3-甲基胆蒽 和二噁英；诱导CYP2B(例如，CYP2B6)的苯巴比妥和苯巴比通；和诱导CYP3A的利福平、 地塞米松、苯妥英和保泰松(C. G. Gibson 等人，1995. New Metabolomics ofXenobiotics, Kodansha Ltd. , Tokyo, Japan)。试验化合物(新的化学实体和外来物)包括，例如，肽、蛋白、非肽化合物、合成的 化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物和血浆。因而，它们包括天然 存在的化合物、药物、环境因素(environmental agent)、致癌物、杀虫剂、除草剂等。这些化 合物可以是新的化合物或普遍已知的化合物。具体地，可以用试验化合物处理本发明的PICM-19H或PICM-19B细胞，并与未处理 的对照PICM-19培养物进行对比，从而用永生的PICM-19H或PICM-19B细胞中的诸如下述 项中的变化来评价试验化合物的治疗/预防效应(1)肝中外源物的代谢所涉及的酶活性， 或⑵编码肝中外源物的代谢所涉及的酶的基因的表达(活化)。使用本发明的筛选方法鉴别为安全的试验治疗化合物可以用作与肝中外源物的 代谢异常有关的疾病(例如，肝功能不全)的低毒性的安全的治疗剂/预防剂或其它药物， 这是因为它对这些疾病的治疗/预防效应。通过所述筛选方法得到的化合物可以已经形成盐。所述盐可以用生理上可接受的 酸(例如，无机酸、有机酸)、碱(例如，碱金属)等形成的盐来例证，优选生理上可接受的酸 加成盐。这样的盐包括，例如，与无机酸(例如，氢氯酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，和 与有机酸(例如，醋酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、 苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐。可以如下分析代谢外源物和/或内源底物的酶的活性的增进例如，通过将试验 物暴露于细胞，并检测代谢外源物和/或内源底物的酶的活性的增加、所述酶的量的增加 和/或编码所述酶的基因的转录量的增加。具体地，这可能通过检测PICM-19H或PICM-19B 细胞中CYP450酶活性的升高、CYP450蛋白含量的增加或CYP450mRNA的增加来实现。有用 的检测方法包括普遍已知的技术，诸如与不同类型的CYP450相对应的酶活性的测定、与不 同的CYP450蛋白相对应的蛋白印迹技术、与不同类型的CYP450mRNA相对应的RNA杂交技 术和CYP450特异性的RT-PCR方法。可以如下测定由于外源物和/或内源底物的代谢引起的肝毒性通过将试验物暴 露于PICM-19H或PICM-19B细胞，并观察或测量得到的细胞毒性，或通过将试验物暴露于 PICM-19细胞，并随后将被细胞改变的试验物施用给另一种肝细胞或其它靶细胞类型，并观 察由此在靶细胞中造成的变化。
在布达佩斯条约下，于2008年4月24日，已经将在实施例2和3中得到的 PICM-19H和PICM-19B单能细胞系分别保藏为细胞系ATCC PTA-9174和ATCC PTA-9173，保 藏在位于 10801 UniversityBoulevard, Manassas, VA 20110，USA 的美国典型培养物保藏 中心(American Type Culture Collection) (ATCC)。已经在确保在本专利申请未决期间可由专利和商标局的官员在37 CFR 1.14和35 USC 122下决定批准的人员得到培养物的条件下，保藏主题培养物。在提交主题申请的副本 或它的子申请的国家，根据外国专利法的要求可得到保藏物。但是，应当理解保藏物的可用 性并不构成实践主题发明的许可，所述实践会破坏政府行为授予的专利权。此外，根据微生物保藏布达佩斯条约的条款，保存主题培养物保藏物并可由公众 得到，即，在最近一次请求提供保藏物样品后至少5年的时间段内尽一切必要小心地保藏 它们，且在任何情况下，在保藏日之后至少30 (三十)年的时间段或可能造成公开所述培养 物的任何专利的可实施期间，保持它们存活且不受污染。保藏人承担下述责任由于保藏物 的条件，当保藏机构不能应请求提供样品时，更换保藏物。在公开它们的专利授权后，将不 可取消地去除对主题培养物保藏物的公众可用性的所有限制。实施例现在已经一般地描述了本发明，参考某些具体实施例将更好地理解本发明，所述 实施例包括在本文中，仅用于进一步解释本发明，且无意限制由权利要求书界定的本发明 的范围。实施例1用于干细胞培养和筛选实验的试剂在25cm2组织培养瓶(T25 ；Greiner，Frickenhausen，德国)中培养所有细胞。胎牛 血清(FBS)和添加铁的小牛血清购自Hyclone，LoganUT。包括不含Ca++和Mg++的Dulbecco 氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)、培养基、胰蛋白酶-EDTA(0.025%胰蛋白酶、0.43mM EDTA)、抗生 素、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺的细胞培养试剂购自InVitrogen，Gaithersburg, MD。在 受辐照的STO小鼠成纤维细胞O^RL 1503，美国典型培养物保藏中心，R0ckville，MD)饲养 细胞层上培养PICM-19H细胞。通过将STO细胞悬浮液暴露于8千拉德、辐射，并以6xl04 细胞/cm2涂布细胞，制备饲养层。通过每6-7天重新添加10 % DMEM维持STO饲养层。 PICM-19培养物的生长和分化培养基是如Talbot和Paape (1996. Methods in Cell Science 18 :315-327)所述的低葡萄糖DMEM和添加了 10% FBS、2_巯基乙醇和核苷的199培养基的 50 50混合物。传代后，每2-3天用新鲜培养基重新饲养PICM-19培养物。培养物常规地 维持在37°C和3-4% CO2气氛中。从ATCC (马纳萨斯，VA ；CRL-10741)得到H印G2C3A人肝胚细胞瘤细胞。在添加了 10% FBSUmM丙酮酸钠、非必需氨基酸和抗生素的最低必需培养基(MEM)中亚汇合地传代 细胞，并在37°C、5% CO2中培养。在第3至12代之间，进行使用H印G2C3A细胞的所有实验。除非指出，包括黄曲霉毒素Bl、3-甲基胆蒽(3-MC)、利福平(rif)、试卤灵、苯巴比 妥(PHB)、7_甲氧基试卤灵(7-MRF)、7_乙氧基试卤灵(7ERF)和二甲基亚砜(DMSO)在内的 所有化学试剂都从Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO得到。7_甲氧基_4_(三氟甲基) 香豆素(7MFC)和7-苄氧基-4-(三氟甲基)香豆素(7BFC)来自BD Gentest,ffoburn,MA0在该研究中对猪(n = 3)的管理和处理得到了美国农业部动物管理和使用委员 会(Institutional Animal Care and Use Committee of theU. S. Department of Agriculture)的批准。通过电击，将杂交猪( 45kg)震晕，并放血。通过以前所述的2 步胶原酶消化操作(Caperna 等人，1985. J. Anim. Sci. 61 :1576-1586 ；Fernandez-Fi gares 等人，2004. Domest. Anim. Endocrinol. 27 125-140)，从左侧肝叶的一部分制备成年猪肝细 胞。将肝细胞G.5xl06细胞)接种进用猪尾胶原预包被的T25烧瓶，并如前所述进行培养 (Caperna 等人，2005. Domest. Anim. Endocrinol. 29 :582-592)。简而言之，最初将细胞维持 在含有胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS ；Sigma)和10% FBS的William氏E培养基中。3h粘 附阶段后，洗涤烧瓶以取出未粘附的和未存活的细胞，并将含有5% FBS和ITS的William 氏E培养基加入每个烧瓶。次日，洗涤烧瓶2次，并将培养基更换为10%DMEM/199。在细 胞分离和开始培养后约72h，结束所有实验。实施例2PICM-19H干细胞系的建立从亲代ARS-PICM-19细胞的T25大量培养物(即约100万细胞)建立PICM-19H 细胞系，在第37代对其进行低体温选择(33-34°C )约3周。从度过温度选择的约50-100 个细胞衍生出PICM-19H细胞系。扩增成大量培养物后，通过在37_38°C培养，观察到PICM-19H细胞系在标准的或 升高的PH培养条件下不会自我构成多细胞胆小管，后者是亲代ARS-PICM-19群体的特性 (图IA和B ；Talbot等人，2002，同上)。相位差显微镜检查显示，PICM-19H细胞通常是立 方细胞，具有清楚的位于中央的细胞核(图1B)。象亲代ARS-PICM-19细胞一样，胎儿肝细 胞样的PICM-19H细胞生长成一片小单层集落，其位于ST0(小鼠胚胎成纤维细胞细胞系) 饲养细胞之中，但是不象仅达到约50%汇合的亲代细胞那样，PICM-19H细胞在终末分化之 前达到约85%汇合，且接触抑制显著减慢了它们的生长(图IB和图2)。为了保持大多数培养物的细胞周期，至少每2周传代PICM-19H培养物是必要的， 亲代ARS-PICM-19细胞也是如此。以1 3至1 10分流比将PICM-19H亚群传代几年， 至约P175的目前传代水平。在它们的传代历史中，在不同的时间冷冻保藏PICM-19H细胞。实施例3PICM-19B干细胞系的建立从亲代PICM-19细胞的自发产生的形态学变体开发出了 PICM-19B细胞系，所述变 体以低频率在约第35代培养物中出现(图3 ；Talbot等人，1994a,同上)。通过该变体细胞 类型的单个集落的微量移液管介导的集落克隆建立PICM-19B细胞系。当从细胞的冷冻原 种开始时，在亲代PICM-19细胞的不同传代水平出现了独立的、自发形成的“PICM-19B样” 生长晕。PICM-19B细胞的出现和许多类似的独立出现的发现，表明该形态学变体看起来源 自分化并形成胆小管的PICM-19细胞，而不是源自形成肝细胞样细胞的单层片的PICM-19 细胞(Talbot等人，1994a,同上)。为了更清楚地解释这一点，图3B、C和D说明了该变体 从另一个独立的、上胚层-衍生的猪肝细胞系的起源。首先在亲代PICM-19培养物中将“ 19B”表型的出现鉴别为紧密堆积出现的且绕着 中心点或线对称地堆成柱状细胞的细胞集落(图3A和B)。所述中心点或线是3维空间，其 通常充满了在相位差显微镜观察下经常具有微黄色的物质(图3A)。随着细胞继续它们的 生长晕几周，它们形成细胞单层，其生长在STO饲养细胞的上面，或随着集落扩大而“压倒(bull-doze) ”在集落周围的饲养细胞(图3C和D)。不象亲代ARS-PICM-19肝细胞样单层， 19B变体细胞单层不具有在细胞之间的小管连接。相反，PICM-19B细胞通过紧密连接部相 连，并显示出顶的/底外侧的形态学极性(图8)。所述单层经常形成穹顶(图3E和F)，指 示顶至基底的流体运输。另外，在19B变体细胞单层的某些区域，特别是存在穹顶的地方， 细胞至细胞的联合具有典型的“棘细胞”形态学(图3F)，类似于其中大量桥粒连接将邻近 细胞联接起来的皮肤上皮(Alberts等人，1994. Molecular Biology of the Cell，第二版， GarlandPublishing，纽约，第 789 和 954-955 页)。不同于亲代ARS-PICM-19细胞系的终末分化且自我构建胆小管细胞，19B变体细 胞生长至100%汇合，导致约2. 61xl05细胞/cm2的终细胞密度(图4)。亲代ARS-PICM-19 细胞在终末分化之前从未达到超过60-75%汇合(Talbot等人，199 ，2002，同上)。另外， 尽管它们具有底外侧极化的单层特征，发现在胰蛋白酶-EDTA处理后，19B变体细胞比亲代 ARS-PICM-19细胞更容易彼此离解。以1 5至1 10分流比传代PICM-19B细胞系直到 第89代，大于1年的时间段。在它们的传代历史中，在不同的时间冷冻保藏PICM-19B细胞。实施例4细胞生长试验通过在传代后3周时间内以2-4天间隔计数每个T25烧瓶的总细胞的增加，测定 了分别在第66和64代的PICM-19H和PICM-19B细胞生长。在每个时间间隔计数一式两份 T25烧瓶。通过胰蛋白酶-EDTA离解，产生每个烧瓶的内容物的单细胞悬浮液。将细胞悬 浮于10% DMEM中至2ml总体积，用于细胞计数。通过平均16个血球计数器正方形(Imm2) 的计数，确定每个T25烧瓶的细胞总数。在生长试验开始时PICM-19H和PICM-19B细胞的 数目的输入未确定，但是PICM-19H是1 6分流比，PICM-19B是1 12分流比，各自来自 几乎汇合的储用培养物。类似地，从没有接受任何PICM细胞输入的饲养细胞T25烧瓶平行 组，计数度过胰蛋白酶/EDTA离解的STO饲养细胞。PICM-19H细胞的生长曲线指示传代后3_5天的延迟期、具有约4 倍增时间的对 数生长期和分化驱动的平台期，在所述平台期中，每个T25烧瓶达到的最终细胞数是几乎 400万细胞或约1. 49xl05细胞/cm2 (图2)。PICM-19B变体细胞生长至100%汇合，导致约2. 61xl05细胞/cm2的最终细胞密 度。对数生长期中的19B的倍增时间是约48-7池(图4)。实施例5超微结构分析；透射电子显微镜检查如前所述(Talbot等人，1998，同上；Talbot 等人，2000. Tissue andCell 32 9-27)，在JFE Enterprises，Brookeville，MD的辅助下，进行透射电子显微镜检查(TEM)样 品制备和显微照相术。在从传代后6周(对于PICM-19H)和传代后8周(对于已经在亲代 ARS-PICM-19培养物中自发形成的PICM-19B样细胞)的T25烧瓶培养物加工成的样品上进 行超微结构分析。PICM-19H细胞的超微结构特征类似于在亲代ARS_PICM_19培养物的肝细胞样细 胞中观察到的那些(Talbot等人，1996a,同上)。可能是肝细胞的主要定义的超微结构特征 是，专门的细胞至细胞联合，其发生在肝细胞之间以形成胆小管(Wanson等人，1977. J. Cell Biol. 74 :858-877)。PICM-19H细胞通过广泛的质膜折叠彼此紧密结合，所述质膜折叠沿着它们的侧表面互相交叉(图5A)，且经常发现夹在STO饲养细胞之间(图5B)。在邻近的 PICM-19H细胞的侧顶表面处(即，面向胆小管空间的腔)发现了极化的上皮细胞的典型的 连接结构(图5B)。这些紧密连接样的联合建立了胆小管的不可渗透的边界，其存在于邻 近的PICM-19H细胞之间，如以前已经通过钌红染色所证实的(Talbot等人，1996a,同上)。 胆小管表面具有许多微绒毛，它们伸出到小管空间中(图5B)。由PICM-19H形成的胆小管类似于在人胚胎、小猪和啮齿动物肝的薄切片 中体内发现的那些(Enzan 等人，1974. Acta Pathol. Jap. 24 :427-447 ;Singh 和 Shahidi. 1987. Ultrastructure of Piglet Liver 见Swine in Biomedical Research, ME. Tumbleson(Ed)，Volume 1，PlenumPress，纽约，第 84 页；Wanson 等人，同上)，并且，与 亲代细胞一样，对加入的分泌素或胰高血糖素是有响应的，即它们表现出流体进入小管的 穿过细胞的运动(未显示；Talbot等人，2002，同上)。细胞的核是椭圆形的，且经常表现出单个的深内陷(图5A)。糙面内质网(RER)在 细胞中尤其好地呈现，且常见于广泛的堆叠中，后者围绕着细胞的一些线粒体(图6)。但 是，RER潴泡相对塌陷，指示它们含有相对微小的分泌物。尽管其它PICM-19H和PICM-19B 超微结构特征是肝细胞或胆管上皮所特有的，在两种细胞系中发现的以长板状潴泡排列的 广泛的RER却不是。该特征最象在人胎儿肝的成肝细胞中报道的特征，在后者中，存在具有 长潴泡的RER的广泛的多个带状(multi-zonal)集中区。相反，发现胎儿和成年胆管上皮细 胞具有非常少的且短的管状 RER(Enzan 等人，1974. Acta Pathol. Jap. 24 :427-447. ；Ishii 等人，1989. Physiol. Rev. 69 :708-764 ；Phillips等人，1987.见:The Liver :An Atlas and Text of Ultrastructural Pathology，Phillips 等人，编，Raven Press，纽约，第 1_；35 页。 在PICM-19H和PICM-19B细胞的对比中，该特征不明显，因此，象亲代ARS-PICM-19细胞一 样，它可能指示衍生的细胞系都根本不同于体内胎儿肝细胞(因为体外环境)，或它们仍然 显示出与成肝细胞(其在合适的环境下可以“成熟”)类似的过渡形态学。光滑内质网看起来也存在于所述细胞中，但是难以确定地与高尔基复合体区分 开。常见于核上位置的高尔基复合体发育良好且众多(图6)。线粒体在纵切面中伸长 (2-3 μ m长)，且在横切面中是椭圆形(0. 2-0. 3 μ m直径)(图6)。它们的板层状嵴特征性 地横贯线粒体，且密电子颗粒有时存在于它们的基质中。许多过氧化物酶体样细胞器也遍 布于细胞的细胞质中，尽管没有证实它们作为过氧化物酶体的鉴别。在PICM-19H细胞中经 常观察到细胞质的相对“空的”区域，其中存在残余的糖原样颗粒(图7)。推测它们是糖原 储存的区域，不充分的糖原玫板固定作用会导致它们大部分消失。最后，在检查的PICM-19H 细胞中没有观察到单纤毛。PICM-19B细胞的超微结构显示了肝胆上皮(胆管上皮细胞)或胆囊上皮的更典 型的特征。不同于PICM-19H细胞，PICM-19B细胞形互相交叉细胞的单层，其具有清楚的基 底/顶极化，但是没有小管形成，即细胞以具有紧密连接部的连续上皮片层排列，如通过穹 顶形成所证实的(图1和8B)。中等的、均勻高度(0. 4-0. 6 μ m)的微绒毛存在于细胞的顶 表面上(图8A和8C)。微绒毛具有特别清楚的内部肌动蛋白丝，它们深入到下面的细胞质 中，然后连接粘着带肌动蛋白丝，后者与顶细胞质表面平行。紧密连接部元件和桥粒将细胞 在它们的顶和侧联合处连接到一起，且指间隙细胞质折叠也是侧细胞表面所常见的(图8A 和8C)。所述细胞也具有众多且发育良好的核周高尔基体，且在细胞核和顶细胞膜之间的细胞质中经常观察到分泌小泡(图9和8A)。在电子密度方面，分泌小泡的内容物通常类似 于周围细胞质的内容物或比后者更深，且是胆囊上皮的含有粘蛋白(muscin)的小泡的特 征(Gilloteaux 等人，1997. Microsc. Res. Tech. 38 :643-659)，它们经常含有离心地定位的 稠密小球(图8A)。所述细胞显示出纤毛，尽管罕见，而因此所述细胞可能是单纤毛的(图 9)。在PICM-19H超薄切片的电子显微镜检查中没有观察到纤毛，但是在PICM-19B细 胞的顶表面上观察到，大部分可能是单纤毛。在人成肝细胞或小猪肝细胞中尚未发现纤毛 (Enzan等人，同上；Singh和Siahidi，同上)。相反，证实了单纤毛的存在是胎儿人、新生猪 和成年大鼠胆管上皮细胞(Enzan等人，同上；Ishii等人，同上；Singh和Siahidi，同上) 或胆囊上皮细胞(Nakanuma等人，1997. Microsc. Res. Tech. 39 :71-84)的特有特征。因此， 在PICM-19H细胞和PICM-19B细胞上分别缺少和存在单纤毛，与PICM-19H细胞在表型上更 是肝细胞样和PICM-19B细胞更是胆管样或胆囊上皮样相一致。类似于过氧化物酶体的膜结合的小体在PICM-19B细胞中为数众多，且有些在它 们的内部具有棱晶形平行板样的结构(图10)。另外，具有板层状嵴的线粒体为数众多，且 有时被发现含有一个或多个颗粒，所述颗粒明显地随机分布于它们的基质中(图11)。在 细胞中发现了光滑和糙面内质网(RER)，尽管前者难以与存在的许多高尔基复合体区分开 (图11)。RER有时出现在广泛的堆叠中，尽管它们的潴泡相对塌陷，指示它们含有相对微小 的分泌物。如在PICM-19H培养物中发现的，在STO饲养细胞和PICM-19B细胞之间明显存 在胶原纤维基质，推测已经由STO成纤维细胞生成。但是，不同于PICM-19H培养物，STO饲 养细胞大部分位于PICM-19B细胞单层的下面(图8B)。最后，在PICM-19B细胞的基底膜的 下面可以辨别出薄的基板(图10)。实施例6γ -谷氨酰基转肽酶(GGT)活性和CYP450含量的测定将PICM-19H和PICM-19B细胞的T25培养物在传代后培养约3周，刮下并收获培养 物，用于全细胞勻浆和微粒体。在收获之前2天，将培养物暴露于美替拉酮，以刺激CYP450 表达。如前所述(Talbot等人，1996，同上)，从一组3个烧瓶测定CYP450含量和GGT活性。在测定之前已经暴露于美替拉酮48h的PICM-19H和PICM-19B细胞的微粒体级 分中存在CYP450(表1)。相反，在没有暴露于美替拉酮的PICM-19细胞培养物勻浆中不可 检出CYP450(数据未显示)。在相同条件下培养的并用美替拉酮处理过的STO饲养细胞的 粗勻浆和微粒体级分不具有可检测的CYP450含量。因为与STO细胞有关的微粒体蛋白代 表收获的总微粒体蛋白中的超过1/3，PICM-19H和PICM-19B细胞中CYP450的实际比含量 (nmol/mg/蛋白)大于报道值。还将PICM-19B CYP450含量与新鲜收获的猪肝细胞进行对 比(表1)，结果表明，该细胞系含有新鲜收获的成年猪肝细胞的CYP450的约1/6。通过组织化学染色，在PICM-19H和PICM-19B细胞中发现了 GGT活性。PICM-19H GGT活性在PICM-19H单层中可见的胆小管中特异性地表达(图12)，而在PICM-19B细胞 中，GGT染色扩散，且与所有细胞结合(图13)。还在培养了 3-4周的PICM-19H和-19B细 胞的勻浆中测量了 GGT活性(表1)。在PICM-19B细胞中的总GGT活性明显高于在新鲜收 获的猪肝细胞或PICM-19H细胞的勻浆中发现的活性(表1)。当在与PICM-19细胞相同的 条件下单独培养时，STO饲养细胞勻浆表现出非常低的或没有GGT活性(未报道)。报道的PICM-19中的GGT特异性活性、总GGT因此被低估，因为约2/5的细胞培养物勻浆蛋白是 源自STO饲养细胞的。PICM-19B细胞的GGT活性是新鲜收获的猪肝细胞制备物的84倍。 PICM-19B细胞的GGT活性是PICM-19H细胞的约6倍(表1)。
表1. PICM-19H、PICM-19B和成年猪肝细胞中的CYP450水平和GGT活性
CYP450GGT
细胞类型(pmol/mg ■体蛋白)(m单位/mg蛋白) PICM-19H PICM-19B 成年猪肝细胞 (新鲜制备的)
*136 土 35 (n=3) *#BD (n=2) 617 ± 47 (n=4)
51.2 士 1.7 (n=9) 311.9 土 9·4 (η=9) 3.7 土 0.4 (η=4)*加入美替拉酮后48小时#BD:低于检测GGT在胆管上皮中高表达，且被视作该细胞类型的良好标志物(Tanaka，Μ. 1974. Acta. Path. Jpn. M :651-665 ; Ishi i等人，同上)。以前，通过组织化学染色证实了亲代 ARS-PICM-19细胞具有GGT活性，其局限在它们的胆小管的质膜中，如已经在原代肝细胞 培养物中所发现的(Meister 等人，1976.见The Enzymes of BiologicalMembranes, Martinosi, Α.(编)，Plenum，纽约，第 315-347 页；Talbot 等人，1996a，同上)。如本文所 证实的，PICM-19H细胞具有类似的表达模式(图12)。相对比，PICM-19B细胞具有更稳健的GGT表达(表1)和当用显微镜观察时看起 来到处存在的GGT表达。这种全细胞表面组织化学GGT染色可能源自与PICM-19B细胞的 顶膜有关的GGT表达，后者在方向上与显微图像的焦面平行。大多数PICM-19H细胞看起来 缺少GGT染色，因为局限在胆小管，且可能它不局限在所有胆小管，也因为小管在PICM-19H 单层内构成离散的侧面至侧面的极化。GGT的这种极性分布指示了肝细胞和胆管上皮细胞 的专门化顶区域中酶的运输功能(Meister等人，同上)。PICM-19B的增强的GGT表达和相 反地在PICM-19H中发现的相对低的表达，也是更胆管样或胆囊上皮样表型(对于PICM-19B 细胞)和更肝细胞样表型(对于PICM-19H细胞)的指示。实施例7CYP450ER0D 活性试验用在培养基中的5μ M 3-甲基胆蒽(3-MC)预温育PICM-19H和PICM-19B细胞的 3个几乎汇合的Τ25烧瓶培养物48h，以诱导CYPAl活性。通过EROD试验，即通过7-乙氧 基试卤灵(7-ERF)向高荧光产物试卤灵的转化，测量PICM-19H细胞、PICM-19B细胞、亲代 ARS-PICM-19细胞和单独的STO饲养细胞中的3-MC诱导的CYP450活性(图14)。如Donato 和同事(1993. Anal. Biochem. 213 :29-33)所述，将细胞暴露于培养基199培养基30min，后 者含有Hank氏盐，不含有L-谷氨酰胺或碳酸氢钠，且含有7-ERF (8 μ Μ)、双香豆素(10 μ Μ) 和牛血清白蛋白。收获培养基，并在有和没有β -葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶(Roche Applied Science^Marmhein，德国)存在下，测定荧光产物试卤灵的浓度，以测定可能的缀合反应的程度。所有试剂都来自Sigma-AldrichGt.LouisJO)，并将活性表示为用和不用 3-MC制备的培养物中每30min/mg细胞蛋白形成的pmol产物。还测定了仅STO饲养细胞的 T25烧瓶，作为它们在PICM-19培养物中的存在的对照。以约^cl(fpmol/30min/mg细胞蛋白的速率，PICM-19H细胞将7-ERF转化成试卤 灵。在PICM-19B细胞中也发现了诱导的EROD活性，但是它的水平与在PICM-19H细胞中测 得的相比降低了约50%。ARS-PICM-19亲代细胞仅具有比PICM-19B细胞有限的更高的试 卤灵生成速率。STO饲养细胞没有显示出可检测的CYP450活性。当没有通过暴露于3-MC 进行诱导时，所有PICM-19细胞培养物中的EROD活性都低于检测水平(未显示)。当暴露于3-MC48h时，PICM-19H细胞表现出比PICM-19B细胞和亲代ARS_PICM_19 细胞更高的可诱导的CYP450含量。类似地，通过7-ER向试卤灵的转化测得的CYP450活 性，在PICM-19H细胞中也更高(图14)。PICM-19H细胞中诱导相对大量的CYP450的能力 与肝表型相一致(Murray 等人，1987. Gastroenterology 93 :141-147 ；Brill 等人，1993. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 204 =261-269)，而在PICM-19B细胞中看到的更低的量指示该细胞 倾向于胆管上皮细胞特有的表型(Sirica，A. E. 1992. Progress in Liver Diseases 10: 63-87 ；Alpini ^Α 1994. The Biology of Biliary Epithelia.见The Liver :Biology and Pathobiology, Arias 等)κ (编)，Raven Press, 第 623-653 M ；Talbot 等)κ, 1998，同上)。在亲代ARS-PICM-19细胞系中，以前提出CYP450水平可能取决于交替分化的 表型的相对比例和程度，即肝细胞单层分化的细胞具有比分化成胆小管的PICM-19细胞更 高的CYP450活性(Talbot等人，1996a，同上)。因而，与相同细胞数目的亲代ARS-PICM-19 细胞系相比，PICM-19H细胞系中胆小管分化表型的缺失可以提高这些培养物的总CYP450 活性，因为没有PICM-19H细胞分化形成胆小管，后者与肝细胞相比大量缺少CYP450活性 (Sirica,同上；Alpini 等人，同上；Talbot 等人，1998，同上)。实施例8条件培养基的二维电泳分析；蛋白的质谱分析如前所述(Talbot等人，1996，同上)，将PICM-19H或PICM-19B细胞接种进T25 烧瓶并培养。在传代后约2周取出培养基，用无血清的DMEM培养基冲洗烧瓶4次以去除 FBS相关的蛋白，并在无血清的DMEM中培养烧瓶48h。收集条件培养基(CM)，并通过 在 500xg离心15min沉淀细胞碎片。如前所述(Talbot等人，2007. In Vitro Cell dev. Biol. Anim. 43 :72-86)，通过等电点聚焦浓缩和分离CM的蛋白。也如前所述(Talbot等 人，2007，同上)，在10%聚丙烯酰胺凝胶(8x10cm)上进行二维分离。通过胶态考马斯蓝 g-250 (Gradipure ；Life Therapeutics，Frenchs Forest，Australia)染色，使凝胶中 的蛋白显影，并使用激光密度测定法(PDSI，GE Healthcare)扫描凝胶。类似地分析来自单 独的STO饲养细胞的CM，作为它们在PICM-19培养物中的存在和FBS相关的蛋白的对照。使用标准的吸管头从二维凝胶切下蛋白斑点，并如前所述(Talbot等人，2007，同 上)处理凝胶“栓”。使用运行在阳离子反射器模式的Voyager DE-STR MALDI-TOF质谱 仪(Applied Biosystems, Framingham, ΜΑ)分析胰蛋白酶处理过的肽，并用运行在20Hz的 337nm氮激光器的75射击获取波谱。使用在m/z 842. 51和2，211. 10的胰蛋白酶自溶峰作 为内部标准品来校正波谱。由PICM-19H细胞4 调节的无血清培养基的分析表明，该细胞系正在分泌一系列蛋白，类似于在胎猪血清中发现的那些(图15A)。在单独的STO饲养细胞中没有看到分泌 (未显示；Talbot 等人，1994，2000a, 2005，同上)。通过 MALDI-T0F 和 LC-MS/MS 质谱法鉴 别出了几个蛋白斑点。鉴别的血清蛋白包括α-2-HS-糖蛋白前体(胎球蛋白-A)、转甲状 腺素蛋白、白蛋白、甲胎蛋白(AFP)、转铁蛋白、载脂蛋白-Al和视黄醇结合蛋白(图15A和 表2)。考马斯蓝总蛋白染色表明，转铁蛋白、AFP、α-1-抗-胰蛋白酶和胎球蛋白-A是最 丰富地分泌的蛋白。表2.通过MALDI-TOF和LC-MS/MS在PICM-19H细胞的条件培养基中鉴别出的血清蛋白
斑点
编号MWPI1769186.932471645.543685805.474384245.5 5157926346693665.927303125.388211425.69208855.8310277466.59
蛋白ID
链A,猜血清g蛋白 α-Ι-Μ蚤白酶丨拷J 甲脸蛋白丨猪]
α-2-HS-糖蛋白(麻球蛋白-A) 转甲;yum素蛋白(前白蛋白)丨诸] 白蛋白丨拷J 栽脂蛋白A-I 视黄酵结M白(Rbp) α-l-酸贼蛋白
肽SCMO预期值NCBIID方法1723%1196.10E-07gi|18655907Maldi Tof720%840.0018gi|975230Maldi Tof1014%1004.90E-05gi|47523700Maldi Tof412%268gi|231467MS/MS658%380gi|975233MS/MS1526%1523.50E-10gi|833798Maldi Tof1654%2204.90E-17gi|164359Maldi Tof211%88gi|2914422MS/MS527%690.068gi|164302Maldi Tof837%1051.80E-05gi|1705760Maldi Tof
MW:预測的分子量;PI:预測的等电点；肽匹配的肽的数目；SC:序列度盖的百分比;MO: MOWSE评分；预期值 预期单独偶然发生的具有相等或更好的评分的匹配的数目(http://www.matrixscience.com); NCBI:登录号;ID方法:质谱法 鉴别方法。最佳匹配的指定的蛋白给出了已经鉴别出的它的物种和它的登录号.
〔0122
〔0127〕 PICM-19B Os . , Siwimm^lfeim -Al ^siwf mm Si ( M 15s。
21
Oz 102099463 A
^SM^ 100/
因而，在2种衍生的PICM-19细胞系中发现的最显著的差异可能是它们的血清 蛋白生成。肝细胞的血清蛋白生成是仅被一种其它细胞类型所共有的定义特征，所述 细胞类型是早期哺乳动物胚胎的胚胎外内脏内胚层细胞(Junqueira等人，1992. Basic Histology, Appleton 和 Lange，Norwalk, CT,第 406 页；Talbot 等人，2007，同上)。因此， PICM-19H细胞系保留了该肝细胞功能(如在亲代ARS-PICM-19细胞系中所发现的；Talbot 等人，1994a,同上)，且在PICM-19B细胞系中极大降低，PICM-19H细胞系是肝细胞样的，而 PICM-19B细胞系则不是。实施例9氨清除和尿素生成试验将PICM-19H或PICM-19B的3个几乎汇合的T25烧瓶培养物暴露于无谷氨酰胺的 Williams-Ε培养基72h，后者添加了 10% FBS、ImM鸟氨酸、胰高血糖素(lOOng/ml)、2_巯基 乙醇(0. ImM)、HEPES(25mM)和抗生素。然后将细胞暴露于相同的基础培养基48h，后者添加 了 12 μ mol氯化铵(终浓度=2mM)。收集培养基，并在2000xg离心以去除细胞碎片，并在分 析之前在_80°C冷冻。使用为用于微孔板读数器而改良的商业试剂盒(Pointe Scientific, Inc.，Canton，MI，USA)，采用分光光度计测定实验(48h)和起始(Ttl)培养基样品的氨含量。 在不含氨的基础培养基中制备标准曲线。也测定了仅STO饲养细胞的T25烧瓶，以对照它 们在PICM-19培养物中的存在。PICM-19H细胞能在约24h内彻底地清除加入T25培养物的细胞培养基中的氨(图 16)。ARS-PICM-19亲代和PICM-19B细胞也几乎能做到(图16)。所有PICM-19细胞系从 加入的氨生成尿素，其中PICM-19H将36%的加入的氨氮转化成尿素氮，PICM-19亲代和 PICM-19B分别达到35%禾Π 30%转化。2个PICM-19衍生细胞系之间的明显差异是它们的尿素总生成量。按照在特异性 活性基础上生成的尿素的绝对量，PICM-19H的生成量超过PICM-19B的2倍(图16)。单独的 STO饲养细胞既不能清除加入的氨，也不能生成尿素(图16)。在氮转化百分比的基础上响 应于加入2mM氨的尿素生成没有在细胞系之间表现出显著不同。这表明，从氨生成尿素的 代谢机制在PICM-19B细胞中是完整的，但是它以更低的总速率运行。由于普遍接受的是， 胆管上皮不会生成尿素，且这是肝细胞的功能(Triebwasser和Freedland. 1977. Biochem. Biophys. Res. Commun.76 1159-1165 ；Jungermann 禾口 Katz,1989. Physiol.Rev.69 708-764 ；Sirica,同上；VanEyken 和 Desmet. 1993. Bile Duct Cells.见Molecular and Cell Biologyof the Liver, LeBouton, A. V.(编)，CRC Press, Baton Raton, Forida,第 475-524页；Alpini等人，同上)，该发现没有支持PICM-19B细胞作为胆管或胆囊上皮的分 类。可能象胆“椭圆形细胞”或推定的兼性肝干细胞一样(Newsome等人，2004. Curr. Top. Dev. Biol. 61 :1-28 ；Sigal 等人，1992. Am. J. Physiol. 263 :G139_148)，PICM-19B 细胞表现 出横跨肝细胞和胆管上皮细胞的功能的可塑性。实施例10CYP450PICM-19H细胞的诱导；诱导的I期和II期活性的测定在PICM-19H细胞中研究了几种CYP450酶活性，以测定重要的CYP450亚型的存在 和可诱导性质。将无荧光的底物加入到PICM-19H细胞的培养物中(图17)，其作为未诱导 的对照(含有PBS或0. 1 % DMS0)或诱导的培养物，后者如在实施例7中和下文所述，分别用5μΜ 3-MC、50yM利福平(rif)或ImM苯巴比妥(PHB)温育48h，以诱导CYP4501A、3A和 2。将利福平和3-MC储液溶于DMSO (0. 1 %终浓度)中，并将PHB溶于PBS中，在生长培养基 中稀释至上述终浓度；按照指示进行溶剂诱导对照。用PBS洗涤细胞，并加入适当的诱导物 培养基48h，然后试验。在传代后培养3周的PICM-19H细胞的T25培养物中评估CYP450活性。分别在原 代培养3天后和传代后1周或接近汇合时，测试APH或H印G2C3A细胞的T25培养物。用诱 导剂3-MC、利福平、PHB或DMSO(作为载体对照)处理细胞培养物48h。开始诱导后，洗涤细 胞，并添加CYP1A1、CYP1A2、CYP2或CYP3A的无荧光底物(分别是7_ERF、7_MRF、MFC和BFC)。 最终的温育条件基本上如Donato等人所述(1993，同上；2004. Drug Metab. Dispos. 32 699-706)，使完整细胞代谢底物30min (对于7-MRF和7-ERF)和60min (对于MFC和BFC)。收 集培养基样品，离心以去除细胞碎片(14，OOOxgJmin)，并在分析前在-80°C冷冻。将培养 基样品的等分部分加入到96孔平板中，并测定荧光产物的浓度(Donato等人，1993，2004， 同上)。简而言之，在有或没有β-葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶(15FiShman/120Roy 单位/ml，R0Che AppliedSciences)的情况下，在37°C在pH 4. 5醋酸盐缓冲液中温育样品 2h，以释放通过硫酸酯化或葡萄苷酸化II期缀合反应已经缀合的任何荧光反应产物。与实 验培养基样品同样地处理标准曲线包含的试卤灵或7-HFC。在HTS 7000平板读数器中测定 荧光；试卤灵和7-HFC的激发/发射滤光片对分别是530/590和410/510。为了测定相对 缀合活性，还直接测定了荧光，没有首先在葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶中温育。由 于试卤灵和7-HFC的缀合形式是无荧光的，直接和间接荧光测量之间的差异代表已经被缀 合酶修饰的产物的量。在用NaOH溶解TCA沉淀的物质后，通过改良的Lowry方法(Nerurkar等人， 1981. Quantification of selected Intracellular and SecretedHydrolases of Macrophages.见Manual of Macrophage Methodology. Herscowitz 等人(Marcel Dekker, Inc.编，纽约，NY，第M9-247页)测定通过超声处理制备的细胞勻浆中的蛋白。牛血清白 蛋白(A6003，Sigma)用作标准品。CYP450 CYP IA活性。在本文中定义为甲氧基试卤灵_0_脱甲基酶(MROD)活性 的CYP1A2活性，主要负责将环境致癌物(例如，多环芳香烃)代谢成它们的致癌的DNA结 合形式(Shimizu 等人，2000. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97 :779-782)。MROD 活性在未诱导 的PICM-19H培养物中和在与PHB和Rif —起温育的那些中较低，而在暴露于3-MC的那些 中，测得5. 5倍诱导的活性(图17)。在本文中定义为乙氧基试卤灵-0-脱乙基酶(EROD) 活性的CYPlAl活性负责代谢环境致癌物，在肝中高度表达，且占人肝CYP450含量的 13% (Shimada等人，同上)。EROD活性在未诱导的培养物中和在与Rif—起温育的那些中较低， 而与PHB和3-MC 一起温育分别导致7和198倍活性增加(图17)。CYP450CYP2活性。通过加入PHB诱导的并通过无荧光的MFC向荧光化合物7-HFC 的转化定量的特异性活性，可归因于CYP2超家族的几个成员。在本文中称作甲氧基三氟甲 基香豆素脱甲基酶(MF⑶)的CYP2亚型的活性由某些外源物和巴比妥酸盐家族药物的成员 诱导。在PICM19H细胞中，PHB、Rif和3-MC同样地诱导MFCD活性(图17)。CYP450CYP3A活性。在人类中，CYP3A4负责被CYP代谢的所有药物的约50 % (Bertz和Grarmeman，1997)。除了它在外源物代谢中的作用以外，CYP3A4在几种内源类固醇激素的生物合成中也是重要的，且据报道，其占总人肝CYP的约30-40% (Shimada等人， 同上)。无荧光的底物7-苄氧基-4-三氟甲基香豆素(7-BFC)向荧光化合物7-羟基4-三 氟甲基-香豆素(7-HFC)的转化被用于定量地测量脱苄基(BTOD)活性。用Rif和PHB诱 导BFCD导致与未诱导的对照相比活性增加约50%，而3-MC孵育与5. 8倍的诱导有关(图 17)。实施例11睾酮代谢物的液相色谱法-质谱法睾酮被几种CYP450同工酶羟基化，产生不同的代谢物衍生物(Watanabe等人， 1997. J. Mass Spectrom Soc. Jpn. 45 :367-375 ;Donato 等人，1999，同上)。用 0. 1 % DMSO 或50uM财￡处理？扣11-19!1细胞4811，然后暴露于25(^11睾酮(Sigma) lh。通过乙腈沉淀 (1 1 八在冰上，151^11)，然后在10，000秘离心，从样品去除蛋白。在队下在37°C干燥 上清液，然后以1 2的起始培养基上清液，重新悬浮于1 1乙醇MAF溶液(25%甲 醇、75% 2mM 醋酸铵、0. 05% 甲酸)。使用 Alliance 2695 分离模型(Waters，Beverly, ΜΑ) 分离样品，其中使用Symmetry C18柱(3. 5 μ m，2. 1x100mm，具有2. IxlOmm保护柱，其含有 相同的填料(Waters))。起始流动相是40%溶剂A^nM醋酸铵、0. 05%甲酸)和60%溶剂 B (甲醇)。从O至IOmin运行线性梯度，达到100%溶剂B，保持;3min，流速OJmLmirT1。使 用在正模式的配有电喷射电离源的Ultima API-US, Quadrupole-Time of Flight(Q-TOF) 质谱仪(Waters)，以表征分离的代谢物。毛细管电压是2. 60kV(T)，碰撞能量10eV，锥电压 35V,来源和去溶剂化温度分别是120和350°C。锥和去溶剂化气流分别是40和SOOLh—1。从 Steraloids, Inc. (Newport,RI)得到睾酮代谢物标准品。基于并行运行的标准曲线计算化 合物的浓度，累加离子化的亲本和2个片段的峰面积。使用LC/MS分析来鉴别和定量对照和Rif处理过的PICM-19H培养物中的3种睾 酮代谢物(6 β 0ΗΤ,2 α OHT和2 β 0ΗΤ)(图18)。生成每种代谢物的未诱导的活性水平相对 较低(< 0. 08umol/mg蛋白/小时)，而Rif诱导与分别与6 β 0ΗΤ,2 α OHT和2 β OHT的生 成速率的14. 7,8. 3和11倍增加有关(图18)。尽管未诱导的PICM-19H培养物中的睾酮代谢是可忽略的，Rif处理与羟基化代谢 物形成的大于10倍诱导有关。如在PICM-19H细胞中证实的，也已经证实了猪肝微粒体和新 鲜的猪肝细胞会生成6 β-羟基化，作为主要的羟基化物质(Donato等人，1999)。PICM-19H 细胞中2 α -和2 β -羟基化活性的相对高的诱导也是显然的。令人感兴趣地，与Rif —起 温育的PICM-19H细胞代谢的天然底物(睾酮)比人工底物MFC和BFC大2_3个数量级，表 明Rif实际上能够相对于基线水平诱导高水平的CYP3A活性。实施例12EROD和BCFD活性与其它肝细胞类型的对比制备了成年猪肝细胞(APH)和H印G2C3A细胞的单层培养物，并在分别用3_MC和 Rif诱导4 后，将EROD和BCFD活性与PICM-19H培养物进行对比。另外，我们还通过评 价在用β-葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶处理之前和之后观察到的荧光活性的程度，对 比了不同细胞培养物之间的II期活性的相对量。如预期的，APH的原代培养物表现出高水 平的可诱导的EROD和BTOD活性(图19)。PICM-19H细胞中的最大诱导的EROD和BTOD活 性分别是APH中的30 %和43 %，而在H印G2C3A细胞中，EROD活性是APH的7 %，且BFCD活性是不可检测的。也评价了 STO细胞的EROD和BTOD (图19)和其它CYP450活性，且在所 有情况下，已经证实不存在可检测的活性(未显示)。总之，对于PICM-19H和APH而言，缀 合或II期活性了类似于基于试卤灵和香豆素的底物(分别是> 50%和> 95%缀合)(图 20)。CYP450限于在H印G2C3A细胞中的EROD活性，且仅20%的试卤灵被测得为缀合形式。PICM-19H细胞中的特异性底物代谢的诱导包括EROD、MROD、MTOD和BTOD ；这最少 分别与CYPlAl、CYP1A2、CYP2和CYP3A活性相关联。3-MC在使用的浓度诱导了所有这些特 异性的活性。相反，PHB诱导了 ER0D，且在更低的程度上诱导了 BTOD和MTOD活性。证实了 利福平会特异性地诱导MFCD和BFCD以及睾酮羟基化活性。在本研究中，用3-MC和Rif分别诱导了 EROD和BTOD，并在新鲜制备的ΑΡΗ、确切 表征的人肝细胞瘤细胞系、HepG2C3A和PICM-19Η细胞之间对比了活性。与在APH细胞中发 现的诱导的CYP450活性相比，PICM-19H具有约30%和43%的EROD和BFCD活性。相反， 这些活性在H印G2C3A细胞中较低至不存在。这些结果不是令人意外的。首先，与APH相 比，PICM-19H培养物是肝细胞的“原初”群体，因为它们没有持续地暴露于众多化学实体，而 APH细胞在完整猪肝的体内环境暴露于它们。其次，H印G2C3A细胞被普遍认为在某些分化 的肝细胞功能方面是有缺陷的(Nyberg等人，1994 ；Rodri guez-Antona等人，2002)，且C3A 衍生细胞系看起来具有这些缺点，至少在可诱导的CYP450方面。这样的分化功能的相当缺 乏很可能源自下述事实，即!fepG2细胞(不同于PICM-19H细胞)是源自肿瘤组织的，且在 几个生长和分化特征方面是异常的。例如，传代后10-14天，PICM-19H细胞停止分裂，且在 培养3周之前，在可以达到汇合之前已经终末分化。相反，!fepG2C3A细胞显得继续分裂，甚 至在达到汇合之后(数据未显示)。II期反应由负责外源物的解毒的胞质酶介导，所述解毒通过缀合水溶性的化学部 分来实现，从而为身体对不同化学实体的消除提供关键功能。利用基于香豆素和试卤灵的 底物，PICM-19H细胞表现出II期缀合反应，其与原代APH细胞的那些相当。我们的标准方 法采用了组合的水解酶制备物，即β -葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶，所以不能容易地确 定哪种特异性活性导致缀合的产物的降解，因为已经证实，硫酸酯化和葡萄苷酸化活性在 猪肝组织中是有功能的(Diaz和Squires. 2003. Xenobiotica 33:485-498)。这没有排除 形成其它形式的II期缀合的可能性，所述其它形式诸如谷胱甘肽添加或酰化反应，它们在 本研究中没有测量。实施例13细胞生存试验使用WST-I 细胞增殖试剂(Roche Applied Sciences，Mannhein，德国)测试了细 胞向化学试剂暴露的毒性效应。该方法测量完整细胞中线粒体酶将四唑盐向甲JJf的转化。 与对照相比，甲It染料生成的减少可以与活细胞的减少相关联(Ishiyama等人，同上)。使用添加了 2% FCS的Williams E (不含有酚红)制备WST-I储用试剂的1 10 稀释液。将稀释的试剂加给细胞，并在37°C温育30min。将细胞处理过的试剂的样品转移 至干净的96孔平板，用dH20稀释，并在平板读数器(HTS7000，Perkin Elmer, Norwalk, CT) 中在450nm读数。测量在620nm的背景，然后从450nm结果减去。将结果与未处理的对照 进行对比。实施例14
PICM-19H细胞对已知的肝毒素的代谢黄曲霉毒素Bl是确定地记载的霉菌毒素和可疑的肝致癌物，其被几种CYP450代 谢,产生显著毒性的代谢物(Kamdem等人，2006. Chem. Res. Toxicol. 19 :577-586)。在生长 在96孔平板中的PICM-19H细胞中，通过WST-I活力测得，黄曲霉毒素Bl的50%致死浓度 (LC50)是约40 μ M(图21。用3-MCCYP450的诱导与LC50的显著降低(1. 1 μ Μ)有关。因而， 3-MC处理增加了黄曲霉毒素Bl的毒性，证实了参与该毒素的生物活化的CYP的诱导。为了测定醋氨酚在PICM-19H细胞中的相对毒性，将制备并维持在96孔平板中的 培养物暴露于0. 78至IOOmM的不同浓度的药物Mh。通过WST-I试验测定PICM-19H细胞 的存活力。10个独立测定的回归分析表明醋氨酚的LC5tl是12. 65士0. 75mM(图22)。肝CYP450系统与吸收的外源物的解毒以及内源分子(包括胆固醇和有关的甾 类)的代谢有关。另外，CYP450酶可以将药物代谢成更有活性的形式，且有时代谢成毒性形 式。例如，在用醋氨酚处理肝细胞后剂量依赖性的细胞毒性源自响应性地产生活性氧的细 胞，并由此在肝细胞中造成细胞毒性效应(Michael等人，1999. H印atology 30:186-195)。 测得醋氨酚对PICM-19H细胞的LC5tl是约13mM。该LC5tl和剂量响应数据与以前公开的从 人或啮齿动物原代肝细胞培养物得到的实验值类似(Wang等人，2002. J. Toxicol. Sci. 27 229-237 ；Alien等人，2005. Toxicol. Sci. 84 :110-119)。另外，在预实验中，醋氨酚毒性在 谷胱甘肽耗尽的PICM-19H细胞(丁硫氨酸-亚砜亚胺处理)中提高，进一步证实了与主要 的醋氨酚代谢有关的代谢机制的存在(数据未显示)。另外，黄曲霉毒素Bl在PICM-19H 细胞中的毒性生物活化证实了它们的肝CYP450代谢。与CYPlA-和3A有关的活性增强 了黄曲霉毒素 Bl 的细胞毒性(Gallagher 等人，1996. ^Toxicol. Applied Pharmacol. 141 595-606)，且用3-MC预处理PICM-19H细胞，通过这些和可能的其它的CYP450的诱导，导致 黄曲霉毒素Bl毒性的增强作用。实施例15没有饲养细胞的PICM-19H细胞培养开发了独立于饲养细胞的PICM-19H细胞培养。已经通过用聚合的牛胶原I型预 包被组织培养瓶，替换了 STO饲养细胞。将烧瓶干燥，然后在4-8°C储存备用。目前使用的 胶原的浓度是 0. 15mg/ml，在 PICM-19 完全培养基(10% DMEM/199+ ；Talbot 和 Paape)中； 但是，可以使用不同浓度的胶原。也可以得到其它物种(例如，人类)的胶原。其它类型 的胶原也可以常规地用于包被，例如，胶原IV。基础培养基是10% DMEM高葡萄糖，其已经 用STO饲养细胞调节6天。在调节期结束时，将等量的培养基199培养基(Talbot等人， 1996，同上)加入STO条件培养基(CM)，且还加入2-巯基乙醇、IOOx核苷混合物和胎牛血 清，使CM达到与10% DMEM/199+相同(Talbot和I^aape，同上)。另外，将下述生长因子 加入基础CM培养基(a) ITS液体培养基添加物-胰岛素、转铁蛋白、硒IOOx(No. 13146， Sigma Chem. Co.，St. Louis，M0)，(b)肝细胞生长因子(HGF) _50ng/ml (eBioscience，Sigma， Becton-Dickinson 和 R&D Systems)，(c)胰岛素样生长因子-1 (IGF-I) _25ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN)，和(d) IGF 结合蛋白 _4 (IGFBP-4) _50ng/ml (R&D Systems, Minneapolis，MN)。现在通过暴露于胰蛋白酶-EDTA传代独立于饲养细胞的PICM-19H培养 物(Talbot等人，199 ，同上)；但是，也可以通过暴露于胶原酶来传代细胞。在传代之间， 每2-3天给培养物重新饲喂新鲜的完全培养基。
实施例16PICM-19H和PICM-19B在中空生物反应器中的培养使用中空纤维生物反应器筒，单独地或作为组合的培养物培养PICM-19H和 PICM-19B细胞。在有和没有STO饲养细胞的情况下，接种细胞，且PICM细胞接种物由分化的 细胞或未分化的细胞组成。使用的中空纤维生物反应器具有不同的设计，包括但不限于含 有集成的氧合纤维的那些(Stem Cell Systems，德国柏林)。在分化的或未分化的状态接种 细胞，并使用由(但不限于)不同供应商提供的方案进行培养，所述供应商例如FiberCell， Inc. Frederick Maryland, USA。在中空纤维培养中培养和维持细胞的方案包括但不限于， 连续再循环、灌注和分批补料(fed-batch)模式。使用的中空纤维装置没有涂层，或在加入 PICM-19H和/或PICM-19B细胞之前预处理，所述预处理通过加入增强STO饲养细胞(如果 使用的话)和/或PICM-19H和/或PICM-19B细胞的粘附的物质来实现，所述物质例如但 不限于不同形式和浓度的胶原。以每天间隔取出样品，并检查残余葡萄糖和氨水平以及白 蛋白生成。生物反应器运行的结果如图23A和2 所示。实施例17在微载体珠上或包裹的PICM-19H和PICM-19B的培养使用微载体珠或包裹进水凝胶中，单独地或作为组合的培养物培养PICM-19H和 PICM-19B细胞。在有和没有STO饲养细胞的情况下，接种细胞，且PICM细胞接种物由分化 的细胞或未分化的细胞组成。使用的微载体珠具有不同的设计，包括但不限于含有生物活 性物质和/或表面内陷的那些(SoloHill Engineering Ann Arbor,MI USA)。在分化的或 未分化的状态接种细胞，并使用由(但不限于)不同供应商提供的方案进行培养，所述方 案例如由GE Healthcare Piscataway, NJ USA提供的那些。在微载体珠上培养和维持细 胞的方案包括但不限于，批式、灌注和分批补料模式。使用的微载体珠没有涂层，或在加入 PICM-19H和/或PICM-19B细胞之前预处理，所述预处理通过加入增强STO饲养细胞(如果 使用的话)和/或PICM-19H和/或PICM-19B细胞的粘附的物质来实现，所述物质例如但 不限于不同形式和浓度的胶原。以每天间隔取出样品，并检查残余葡萄糖和氨水平以及白 蛋白生成。微载体和运行的结果如图24A和24B所示。用于细胞包裹的水凝胶具有不同的设计，包括但不限于含有藻酸盐的那些，加入 或不加入诸如胶原的生物活性物质。在分化的或未分化的状态包裹细胞，并使用标准的悬 浮细胞技术进行培养，或注射进中空纤维生物反应器的毛细管外空间中。实施例18作为球状体的PICM-19H的培养用于建立PICM-19H细胞的球状体培养物的方法。通过在37°C用lmg/ml的在细 胞培养基或含有钙的生理盐溶液(例如但不限于DMEM或Hank氏缓冲盐水溶液)中制备的 胶原酶(例如但不限于胶原酶II)处理PICM-19H培养物15-30min，从组织培养塑料器具 中释放PICM-19H细胞。胶原酶处理会分解培养物内的由STO饲养细胞生成的胶原纤维，且 STO细胞和PICM-19H细胞收缩得彼此离开，PICM-19H细胞形成细胞小球。通过剧烈搅动 培养瓶，或通过用某种类型的无菌细胞刮器刮下培养物，最终使球化的PICM-19H集落脱离 塑料基质。使PICM-19H细胞的球(初生的球状体)悬浮于细胞培养基中，并进行低速离心 (例如100-200xg，5-10min)，取出在得到的细胞沉淀物上面的上清液，并抛弃，从而去除胶原酶。将初生的PICM-19H球状体的沉淀物重新悬浮于新鲜的完全培养基(例如但不限于 10% DMEM/199 ；Talbot和I^aape，1996)，并在轻柔搅拌下培养，所述搅拌通过使用但不限于 摇摆或定轨振荡器来实现，使得初生的PICM-19H球状体不重新粘附到在培养瓶中位于它 们下面的塑料器具上或塑料器具/饲养细胞基质上。每2-3天给球状体培养物供应新鲜培 养基。通过该方法可以使球状体生长和维持至少2周，如在图25中所证实的。在本说明书中提及的所有出版物和专利，都通过参考引用并入本文中，其程度如 同具体地且单个地说明每篇单独的出版物或专利通过参考引用并入本文。为了解释和描述本发明的目的，已经呈现了前述描述和某些代表性的实施方案和 本发明的细节。无意穷尽或将本发明限制为所公开的具体形式。本领域的技术人员会明白， 其中可以做出修改和变动而不脱离本发明的范围。
权利要求
1.一种分离的、永生的、单能的猪干细胞系，其中所述细胞系的细胞能排它地分化成肝 细胞。
2.权利要求1的干细胞系，其中所述细胞表现出PICM-19H细胞的所有鉴别特征，所述 特征是可诱导的CYP450活性、血清蛋白生成、低Y-谷氨酰基转肽酶(GGT)活性、氨清除 能力和尿素生成能力。
3.权利要求2的干细胞系，其中所述干细胞系是保藏为ATCCPTA-9174的永生的、单能 的PICM-19H干细胞系。
4.一种分离的、永生的、单能的猪干细胞系，其中所述细胞系的细胞能排它地分化成表 达胆管上皮细胞功能的功能性胆管细胞。
5.权利要求4的干细胞系，其中所述细胞表现出PICM-19B细胞的所有鉴别特征，所述 特征是，所述细胞是底外侧极化的细胞，该细胞表现出基底膜流体运输、高GGT活性和血清 蛋白生成的缺乏。
6.权利要求2的干细胞系，其中所述干细胞系是保藏为ATCCPTA-9173的永生的、单能 的PICM-19B干细胞系。
7.根据权利要求1或权利要求4的细胞系，其中所述细胞的培养物进一步包含饲养细胞。
8.一种组合物，其包含根据权利要求1或权利要求4的细胞系的细胞，所述细胞粘附在 微珠上。
9.一种组合物，其包含根据权利要求1或权利要求4的细胞系的细胞，所述细胞包裹在藻酸盐微胶囊中。
10.一种组合物，其包含根据权利要求1或权利要求4的细胞系的细胞，所述细胞粘附 在单个中空纤维上和之间。
11.一种生物人工肝装置，其包含分离的、永生的、单能的猪干细胞系的细胞和所述细 胞的支持物，其中所述细胞系的细胞能排它地分化成肝细胞。
12.—种生物人工肝装置，其包含分离的、永生的、单能的猪干细胞系的细胞和所述细 胞的支持物，其中所述细胞系的细胞能排它地分化成表达胆管上皮细胞功能的功能性胆管 细胞。
13.—种生物人工肝装置，其包含分离的、永生的、单能的猪干细胞系的细胞，其中所述 细胞系的细胞能排它地分化成肝细胞，和包含分离的、永生的、单能的猪干细胞系的细胞， 其中所述细胞系的细胞能排它地分化成表达胆管上皮细胞功能的功能性胆管细胞，以及包 含所述细胞的支持物。
14.权利要求11、12和13中任一项的生物人工肝装置，其中所述支持物包含单个中空 纤维、微珠或藻酸盐微胶囊的集合。
15.使用权利要求1-3中任一项的细胞系作为生物人工肝装置的方法，其中所述细胞 能为需要功能性肝细胞的患者起肝细胞的功能。
16.使用权利要求4-6中任一项的细胞系作为生物人工肝装置的方法，其中所述细胞 能为需要功能性胆管上皮细胞的患者起表达胆管上皮细胞功能的功能性胆管细胞的功能。
17.一起使用权利要求1-3中任一项的细胞系和权利要求4-6中任一项的细胞系作为 生物人工肝装置的方法，其中所述细胞能为需要功能性的肝细胞和胆管上皮细胞的患者起肝细胞和表达胆管上皮细胞功能的功能性胆管细胞的功能。
18.使用组合物作为生物人工肝装置处理诸如全血、血浆和腹膜液的体液的方法，所述 组合物包含权利要求1-3中任一项的细胞系的细胞，所述细胞粘附在微珠上、粘附在无机 或有机多孔支持物上、粘附在单个中空纤维上或包裹在基于水凝胶的支持物中，其中所述 细胞能为需要功能性肝细胞的患者起肝细胞的功能。
19.使用组合物作为生物人工肝装置处理诸如全血、血浆和腹膜液的体液的方法，所述 组合物包含权利要求4-6中任一项的细胞系的细胞，所述细胞粘附在微珠上、粘附在无机 或有机多孔支持物上、粘附在单个中空纤维上或包裹在基于水凝胶的支持物中，其中所述 细胞能为需要功能性胆管上皮细胞的患者起表达胆管上皮细胞功能的功能性胆管细胞的 功能。
20.一起使用权利要求1-3中任一项的细胞系和权利要求4-6中任一项的细胞系作为 生物人工肝装置处理诸如全血、血浆和腹膜液的体液的方法，所述细胞粘附在微珠上、粘附 在无机或有机多孔支持物上、粘附在单个中空纤维上或包裹在基于水凝胶的支持物中，其 中所述细胞能为需要功能性肝细胞和胆管上皮细胞的患者起肝细胞和表达胆管上皮细胞 功能的功能性胆管细胞的功能。
21.使用权利要求1和4的细胞系筛选化合物或新的化学实体的方法，所述化合物或新 的化学实体抑制或促进肝中外源物代谢所涉及的酶活性。
22.使用权利要求1和4的细胞系筛选化合物或新的化学实体的方法，所述化合物或新 的化学实体由于肝中外源物和/或内源底物的代谢而产生细胞毒性。
23.使用权利要求1和4的细胞系筛选化合物或新的化学实体的方法，所述化合物或新 的化学实体由于肝中外源物和/或内源底物的代谢而产生肝毒性。
24.使用权利要求1和4的细胞系筛选化合物或新的化学实体的方法，所述化合物或新 的化学实体由于肝中外源物和/或内源底物的代谢而产生肝功能障碍。
25.—种筛选测定试剂盒，其包含PICM-19H细胞、PICM-19B细胞或二者。
全文摘要
从双能的ARS-PICM-19猪肝干细胞系衍生了2种细胞系PICM-19H和PICM-19B，并评估了它们在人工肝装置中的潜在应用。本研究包括培养物的生长速率和细胞密度的评估、形态学特征和肝细胞解毒功能，所述肝细胞解毒功能即可诱导的CYP450活性、氨清除和尿素生成。PICM-19H细胞含有众多的线粒体、高尔基体、光滑和糙面内质网、泡囊体和偶见的脂质液泡。PICM-19H细胞在无谷氨酰胺的培养基中表现出可诱导的CYP450活性、清除氨并生成尿素。PICM-19B单层的超微结构分析表明，大致上立方的细胞表现出基底-顶极化，并通过紧密连接部样的复合物连接起来。其它超微结构特征类似于PICM-19H细胞的那些，只是它们具有众多类似于粘液液泡的细胞体。PICM-19B细胞具有相对高水平的GGT活性，但是保留一些可诱导的CYP450活性和一些氨清除和尿素合成能力。这些数据表明，两种细胞系在一起或单独地可以用作人工肝装置的细胞基质。需要肝的体外模型来替换动物模型，用于快速评估药物生物转化和毒性。单能的猪干细胞系PICM-19H会排它地分化成肝细胞，且可以被诱导表达CYP450酶。这些细胞具有在其它肝细胞系中缺少的与外来物I期和II期代谢有关的许多活性。还将PICM-19H细胞系与肿瘤衍生的人HepG2 C3A细胞系和成年猪肝细胞的原代培养物进行了对比。结果证实了PICM-19H细胞在药物生物转化和毒性试验中的应用潜力，并进一步支持了它们在人工肝装置技术中的应用。
文档编号C12N5/074GK102099463SQ200980128322
公开日2011年6月15日 申请日期2009年4月30日 优先权日2008年5月23日
发明者尼尔·C·塔尔博特, 托马斯·J·卡佩尔纳, 瑞安·威拉德 申请人:美国农业部