具有内切葡聚糖酶活性的新型蛋白质、其dna以及它们的应用的制作方法

专利名称：具有内切葡聚糖酶活性的新型蛋白质、其dna以及它们的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有内切葡聚糖酶活性的新型蛋白质、编码该蛋白质的新型DNA、 含有该DNA的载体、含有该载体的转化体以及利用该转化体制备具有内切葡聚糖酶活性的 蛋白质的方法，并且涉及至少利用具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质及担子菌中的任意一个 制备糖的方法、利用通过该糖的制备方法获得的糖制备乙醇的方法，还涉及含有具有内切 葡聚糖酶活性的蛋白质的食品、饲料、洗涤剂以及利用具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质处 理含有纤维素的织物的方法。
背景技术：
内切葡聚糖酶(EGs (endoglucanase) ；EC 3. 2. 1. 4)是水解纤维素的酶的一种。水 解纤维素的酶还包括纤维二糖水解酶(CBHs(cellobiohydrolase) ；EC3. 4. 1. 91)、β-葡 萄糖苷酶(BGLsODeta-glucosidase) ；EC 3. 2. 1. 21)，这些酶基于氨基酸序列的相似性分 类为糖苷水解酶家族(以下，称为“GH家族”)。分类的详细内容可以在碳水化合物活性酶 (Carbohydrate-Active enZymes, CAZy)网络月艮务器(http://www.cazy.org/)上确认。纤维素是葡萄糖分子通过β -1，4_糖苷键连接的直链高分子物质。纤维素是植物 细胞壁的主要组成成分，并且是地球上分布最广的生物聚合物(biopolymer)。因此，从分子 内部切断这种纤维素的内切葡聚糖酶被应用于生物质原料的处理、洗涤剂等领域中，并且 相关研究也在持续进行(例如，参照专利文献1 2)。至今为止，对于作为子囊菌亚门真菌的一种的红褐肉座菌(Hypocreajecorina (无 性世代里氏木霉(Trichoderma reesei)))有较为深入的研究，已经得知，可以产生属于 GH家族-6和GH家族-7的两种纤维二糖水解酶(Cel6A (CBHI)、Cel7A (CBHII))和至少五种 内切葡聚糖酶(Cel7B(EGI)、Cel5A(EGII)、Cell2A(EGIII)、Cel61A(EGIV)、Cel45A(EGV))， 并且这些酶协调或者协同作用，使纤维素水解。并且，子囊菌分解纤维素的培养基滤液还作为纤维素酶混合物在市场上销售。另一方面，已经得知，在包含有食用菌的担子菌中，属于木霉菌的黄孢原毛平革 菌(Phanerochaete chrysosporium)可以有效地分解木质纤维素，可以产生与纤维素和 半纤维素的分解相关的一系列水解酶。并且，也已测出黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的全基因组序列。然而，至今为止，已知的仅限于，产生属于GH家族-6和GH家族_7的纤维二糖水 解酶(例如，非专利文献1)和属于GH家族-5和GH家族-12的四种内切葡聚糖酶(例如， 非专利文献2、3)，而并没有发现属于GH家族-45的内切葡聚糖酶，并且也没有阐明详细的 纤维素分解机制。与包含霉菌的子囊菌不同，担子菌包含有食用菌。因此，对于用在生物质原料的处 理等工艺中的内切葡聚糖酶来说，如果考虑安全性等方面，则选择来源于担子菌的内切葡 聚糖酶，就会有容易使用的优点。因此，目前现状是，期待获得来源于担子菌的内切葡聚糖酶。现有技术文献专利文献专利文献1 特许第3874409号公报专利文献2 特表2004-519212号公报非专利文献非专 利文献 1 :Uzcategui, Ε. , A. Ruiz, R. Montesino, G. Johansson 禾口 G.Pettersson. 199 1 · The 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolases from Phanerochaetechrysosporium. I.A system of synergistically acting enzymes homologous toTrichoderma reesei. J. Biotechnol. 19 :271-285.# # ^lJ i K 2 :Henriksson, G. ， A. Nutt, H. Henriksson, B. Pettersson, J. Stahlberg, G. Johansson 禾口 G. Pettersson. 1999. Endoglucanase 28(Cel 12A), a newPhanerochaete chrysosporium cellulase. Eur. J. Biochem. 259 :88-95.非专利文献 3 =Uzcategui, Ε.，G. Johansson, B. Ek 和 G. Pettersson. 1991. Thel， 4-β -D-glucan glucanohydrolases from Phanerochaete chrysosporium. Re-assessment of their significance in cellulose degradation mechanisms. J. Biotechnol 21 143-159.

发明内容
技术问题本发明的目的在于，从在安全性等方面上容易使用的、分类有食用菌的担子菌发 现具有内切葡聚糖酶活性的新型蛋白质，并提供编码该蛋白质的新型DNA、含有该DNA的载 体、含有该载体的转化体以及利用该转化体制备具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的方法， 并且提供至少利用具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质及担子菌中的任意一个制备糖的方法、 利用通过该糖的制备方法获得的糖制备乙醇的方法，还提供含有具有内切葡聚糖酶活性的 蛋白质的食品、饲料、洗涤剂以及利用具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质处理含有纤维素的 织物的方法。技术方案为了达到上述目的，本发明的发明人经过努力探索，结果得到了以下见解。即发 现，在安全性等方面上容易使用的、属于分类有食用菌的担子菌的一种的黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)产生一种蛋白质，虽然该蛋白质与已知的内切葡聚糖酶 的氨基酸序列一致性较低，且具有不同的酶残基(catalytic residue)，却是具有内切葡聚 糖酶活性的新型的、且有用的蛋白质。由此，完成了本发明。本发明是基于发明者们的以上见解而完成的，作为解决所述问题的技术方案如 下<1> 一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质是来源于担子菌的蛋白质，利用SDS-PAGE 测定的分子量为18kDa，并且具有内切葡聚糖酶活性。<2>如前述<1>所述的蛋白质，其特征在于，担子菌是黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)。
<3> —种蛋白质，其特征在于，具有内切葡聚糖酶活性，并且为记载于下述(a)至 (d)中的任意一个的蛋白质(a)包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的蛋白质；(b)包含用序列标识符1表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、 插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质；(c)包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的第27位至第206位的氨基酸序列 的蛋白质；(d)包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的第27位至第206位的氨基酸序列 中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质。<4> 一种DNA，其特征在于，编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，并且为记载于 下述(a)至(f)中的任意一个的蛋白质(a)编码包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的蛋白质的DNA ；(b)编码包含用序列标识符1表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺 失、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质的DNA ；(c)编码包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的第27位至第206位的氨基酸 序列的蛋白质的DNA;(d)编码包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的第27位至第206位的氨基酸 序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质的DNA ；(e)包含用序列标识符2表示的碱基序列的DNA ；(f)与包含用序列标识符2表示的碱基序列的DNA以及所述DNA的互补链中的任 意一个在严谨条件下杂交的DNA ；(g)包含用序列标识符2表示的碱基序列中的第79位至第621位的碱基序列的 DNA ；(h)与包含用序列标识符2表示的碱基序列中的第79位至第621位的碱基序列 的DNA以及所述DNA的互补链中的任意一个在严谨条件下杂交的DNA。<5> 一种重组载体，其特征在于，包含记载于前述<4>的DNA。<6> 一种转化体，其特征在于，该转化体是利用记载于前述<5>的重组载体转化得 到的。<7>—种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的制备方法，其特征在于，包括以下工 艺 培养记载于前述<6>的转化体；从所述培养物提取具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。<8> 一种糖的制备方法，其特征在于，利用记载于前述<1>至<3>的蛋白质以及担 子菌中的至少一个，从生物质原料获得糖。<9>如前述<8>所述的糖的制备方法，其特征在于，进一步利用除了记载于前述 <1>至<3>中任意一项的蛋白质以外的纤维素酶。<10> 一种乙醇的制备方法，其特征在于，通过发酵根据记载于前述<8>至<9>中任 意一项的糖的制备方法得到的糖，获得乙醇。<11> 一种食品，其特征在于，含有记载于前述<1>至<3>的蛋白质中的至少一个。
<12> 一种饲料，其特征在于，含有记载于前述<1>至<3>的蛋白质中的至少一个。<13> 一种洗涤剂，其特征在于，含有记载于前述<1>至<3>的蛋白质中的至少一 个。<14> 一种含有纤维素的织物的处理方法，其特征在于，利用记载于前述<1>至<3> 的蛋白质中的至少一个，处理含有纤维素的织物。有益效果根据本发明，能够达到上述目的，从在安全性等方面上容易使用的、分类有食用菌 的担子菌发现具有内切葡聚糖酶活性的新型蛋白质，可以提供编码该蛋白质的新型DNA、含 有该DNA的载体、含有该载体的转化体以及利用该转化体制备具有内切葡聚糖酶活性的蛋 白质的方法，并且可以提供至少利用具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质及担子菌中的任意一 个制备糖的方法、利用通过该糖的制备方法获得的糖制备乙醇的方法，还可以提供含有具 有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的食品、饲料、洗涤剂以及利用具有内切葡聚糖酶活性的蛋 白质处理含有纤维素的织物的方法。


图1为示出培养黄孢原毛平革菌(P. chrysosporium)后的培养液的过滤物的 SDS-PAGE的结果的图。图2为示出编码PcCel45A的cDNA的碱基序列和所述cDNA编码的氨基酸序列的 图。图3为示出PcCel45A的在黄孢原毛平革菌(P. chrysosporium)的基因组上的位 置的图。图4为示出对PcCel45A的氨基酸序列与其它蛋白质的氨基酸序列进行多序列比 对的结果的图。图5为示出PcCe 145A的系统进化树的图。图6为示出PcCel45A与各底物反应1小时之后的反应液中的水解产物的TLC分 析结果的图。图7为示出PcCel45A与各底物反应120小时之后的反应液中的水解产物的TLC 分析结果的图。图8为示出在PcCel45A与PASC反应后的反应液中产生纤维寡糖的随时间的变化 的图。图9为示出根据HPLC检测在PcCel45A、PcCel6A与PASC反应时生成的纤维寡糖 的图。图10为示出检测在PcCel45A、PcCel6A与PASC反应时发生的协同效应的图。
具体实施例方式(具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质)本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质是来源于担子菌的蛋白质，采用 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定的分子量为18kDa。并且，本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质包括包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的蛋白质、包含用序列标识符1表示的氨基酸序列中的第27位至第206位 的氨基酸序列的蛋白质。并且，本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质还包括包含用序列标识符1表 示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质； 包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的第27位至第206位的氨基酸序列中一个或多个 氨基酸被取代、缺失、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质。在此，对于“多个氨基酸”，只要具有内切葡聚糖酶活性，没有特别限制，可以根据 目的适当选择。并且，对于氨基酸被取代、缺失、插入或者添加的区域，只要具有内切葡聚糖 酶活性，没有特别限制，可以根据目的适当选择。另外，本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质也可以是与用序列标识符1表 示的氨基酸序列或与用序列标识符1表示的氨基酸序列中的第27位至第206位的氨基酸 序列具有序列一致性的蛋白质。对于所述序列一致性，只要具有内切葡聚糖酶活性，没有特 别限制，可以根据目的适当选择，但是优选70%以上，进一步优选80%以上，尤其优选90% 以上，最为优选95%以上。所述氨基酸序列的一致性可以通过Karlin及Altschul算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268,1990 以及 Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873-5877,1993)确定。 Altschul等人开发了利用这种算法的BLAST程序(J. Mol. Biol. 215 =403-410,1990)。这些 例如可以通过 NCBI 蛋白质数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/Blast. cgi)而 利用。对于分析所述氨基酸序列的一致性的BLAST程序，没有特别限制，可以根据目的适当 选择，例如，可以列举blastp程序。对于利用所述程序分析序列一致性时的参数，没有特别 限制，可以根据目的适当选择，例如，可以使用默认值。另外，对于碱基序列的一致性，也可 以采用相同的方法确定序列一致性。-分子量测定-本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的分子量可以采用SDS_PAGE(聚丙烯 酰胺凝胶电泳)测定。对于所述SDS-PAGE方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，可以用公知的方法。对于所述SDS-PAGE中所使用的聚丙烯酰胺凝胶，没有特别限制，可以根据目的适 当选择，例如，可以列举12 %的聚丙烯酰胺凝胶等。对于所述电泳中所使用的装置，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可 以列举Mini-Protein II (Bio-Rad公司制造)等。-内切葡聚糖酶活性测定-本发明的蛋白质是具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，这可以通过测定所述蛋白质 的内切葡聚糖酶活性而确认。对于测定所述内切葡聚糖酶活性的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择， 例如，可以通过检测样品与底物反应得到的产物而测定。对于所述底物，只要是能够由内切葡聚糖酶分解的物质，没有特别限制，可以根据 目的适当选择，例如，可以列举非晶态纤维素、羧甲基纤维素、地衣多糖(Iichenan)、大麦 β-葡聚糖、葡甘聚糖等。
对于所述反应的温度，只要是内切葡聚糖酶具有活性的温度，没有特别限制，可以 根据目的适当选择，例如，可以列举30°C等。所述产物是所述底物的分解物，例如，可以列举还原糖等。对于所述检测方法，只要能够检测出所述产物，没有特别限制，可以根据目的选 择，例如，可以列举采用对羟基苯甲酸酰胼(p-hydroxybenzoic acidhydrazide, PHBAH)法 的检测方法、采用薄层色谱法(TLC)的检测方法、采用高效液相色谱法(HPLC)的检测方法等。-氨基酸序列的确定-本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的氨基酸序列可以通过公知的方 法确定，例如，可以利用蛋白质测序仪(Protein sequencer)(型号491 cLc ；Applied Biosystems公司制造)确定。-底物-作为本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的底物，例如，可以列举非晶态纤 维素、羧甲基纤维素、地衣多糖、大麦葡聚糖、葡甘聚糖等，其中优选地衣多糖、大麦 β-葡聚糖。作为所述底物的分解物，例如，可以举出单糖至七糖的还原糖，其中优选地获得三 糖至五糖的还原糖。-最适温度-对于利用本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的温度，没有特别限制，可 以根据目的适当选择，但是优选10°c 70°C，进一步优选20°C 60°C，最为优选30°C 50°C。如果所述温度小于10°C，则所述具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质不能发挥其功能； 如果超过70°C，则所述具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质就会失去活性。另一方面，如果所述 温度在所述最为优选的范围内，则从能够有效地分解底物的方面考虑，是有利的。-最适pH-对于利用本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的pH，没有特别限制，可以根 据目的适当选择，但是优选2. 0 8. 0，进一步优选3. 0 7. 0，最为优选4. 0 6. 0。如果 所述PH值小于2. 0或者大于8. 0，则酶就会失去活性。另一方面，如果所述pH值在所述最 为优选的范围内，则从能够有效地分解底物的方面考虑，是有利的。-组合使用-如果本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质与其它纤维素酶一起使用，则根据 协同作用，能够有效分解底物。对于所述其它纤维素酶，没有特别限制，可以根据目的适当 选择，例如，可以举出黄孢原毛平革菌(P. chrysosporium)的Cel6A等。对于组合使用时的本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质与所述其它纤维素 酶的摩尔比(本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质所述其它纤维素酶)，没有特别限 制，可以根据目的适当选择，但是优选75 25 25 75，进一步优选75 25。本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质可以通过以下记载的制备方法制备，优 选地，可以用于后述的糖的制备方法、利用该糖的乙醇的制备方法，还可以用于食品、饲料、 洗涤剂以及含有纤维素的织物的处理方法。(具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的制备方法)
本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质可以从担子菌的培养物得到，并且优选 地，还可以根据利用本发明的转化体的方法制备。<利用担子菌制备具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的方法>所述利用担子菌制备具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的方法至少包括培养担子 菌的工艺(培养工艺)和从所述培养物提取具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的工艺(提取 工艺)，根据需要进一步包括其它工艺。该所述制备方法是制备本发明的具有内切葡聚糖酶 活性的蛋白质的第一实施形态。-培养工艺-所述培养工艺是培养担子菌的工艺。对于所述担子菌，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是优选属于担子菌 门伞菌亚门的担子菌，进一步优选属于担子菌门伞菌亚门伞菌纲的担子菌，尤其优选属于 担子菌门伞菌亚门伞菌纲非褶菌目的担子菌，最为优选黄孢原毛平革菌(Wianerochaete chrysosporium)0对于所述培养方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出采用 琼脂培养基的固体培养方法、采用液体培养基的液体培养方法等。其中，从可以制备较多的 蛋白质的方面考虑，液体培养方法是优选的方法。对于所述液体培养基，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举 出含有纤维素的 Kremer 和 Wood 培养基(Kremer，S. Μ.和 P. Μ. Wood. 1992. Evidence that cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium isprimarily an Fe (Ill)reductase. Kinetic comparison with neutrophil NADPHoxidase and yeast f lavocytochrome b2. Eur. J. Biochem. 205 133-138.)。对于所述培养温度，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是优选20°C 45°C，进一步优选30°C 40°C，最为优选37°C。如果所述培养温度小于20°C，则担子菌的 生长发育会变慢；如果超过45°C，则担子菌会停止生长发育。另一方面，如果所述培养温度 在所述最为优选的范围内，则从能够有效地制备具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的方面考 虑，是有利的。对于所述培养天数，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是优选1天 30 天，进一步优选2天 14天，最为优选3天 7天。如果所述培养天数小于1天，则担子菌 的数量会较少，且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的制备量会较少；如果超过30天，成为 死菌的担子菌的数量就会较多，或者制备的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质会被分解。另 一方面，如果所述培养天数在所述最为优选的范围内，则从能够有效地制备具有内切葡聚 糖酶活性的蛋白质的方面考虑，是有利的。-提取工艺_所述提取工艺是从通过所述培养工艺得到的培养物提取具有内切葡聚糖酶活性 的蛋白质的工艺。对于所述提取方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，本发明的具有 内切葡聚糖酶活性的蛋白质产生在菌体内或者菌体表面时，可以通过从培养物分离菌体， 并对该菌体进行超声波破碎等公知的处理，提取本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白 质。并且，例如，本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质产生在培养液中时，可以通过采用离心分离和过滤等方法去除菌体，提取本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。优选地，对上述提取的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质进行纯化。对于所述纯化 方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出硫酸铵沉淀、各种色谱法、乙 醇沉淀法、超滤法等方法。-其它工艺-对于所述其它工艺，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出为了 保存具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质而进行的冷冻干燥工艺、为了提高具有内切葡聚糖酶 活性的蛋白质的浓度而进行的浓缩工艺等。〈利用转化体制备具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的方法〉本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的制备方法至少包括培养后述的本发 明的转化体的工艺(培养工艺)和从所述培养物提取具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的工 艺(提取工艺)，根据需要进一步包括其它工艺。该所述制备方法是制备本发明的具有内切 葡聚糖酶活性的蛋白质的第二实施形态。-培养工艺-所述培养工艺是培养后述的本发明的转化体的工艺。对于所述培养方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出采用 琼脂培养基的固体培养方法、采用液体培养基的液体培养方法等。其中，从可以制备较多的 蛋白质的方面考虑，液体培养方法是优选的方法。对于所述转化体，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出毕赤酵 母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母、大肠杆菌等。其 中，从具有活性的酶的生产量较多的方面考虑，毕赤酵母(Pichia pastoris)是优选的。对于所述培养基，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是优选地，根据所使 用的转化体进行选择。例如，作为所述转化体，当利用重组载体中的表达调控序列为乙醇氧 化酶启动子的毕赤酵母(Pichia pastoris)时，作为所述培养基，例如，优选利用含有酵母 膏、蛋白胨和甲醇的培养基。另外，例如，作为转化体，当利用重组载体中的表达调控序列 为GALl启动子的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)时，作为所述培养基，例如，优选 地，预培养的培养基采用将棉子糖作为碳源的液体基础培养基，之后的培养用的培养基采 用将半乳糖和棉子糖作为碳源的液体基础培养基。另外，例如，作为转化体，当利用重组载 体中的表达调控序列为Iac启动子的大肠杆菌时，作为所述培养基，例如，优选地采用含有 IPTG (异丙基-β -D-硫代半乳糖苷)的液体培养基。-提取工艺_所述提取工艺是从通过所述培养工艺得到的培养物提取具有内切葡聚糖酶活性 的蛋白质的工艺。对于所述提取方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，本发明的具有 内切葡聚糖酶活性的蛋白质产生在菌体内或者菌体表面时，可以通过从培养物分离菌体， 并对该菌体进行超声波破碎等公知的处理，提取本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白 质。并且，例如，本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质产生在培养液中时，可以通过采 用离心分离和过滤等方法去除菌体，提取本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。优选地，对上述提取的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质进行纯化。对于所述纯化方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出硫酸铵沉淀、各种色谱法、乙 醇沉淀法、超滤法等方法，并且，在所述具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质上添加有纯化用标 记序列时，还可以采用对应被添加的标记的纯化方法。作为所述对应被添加的标记的纯化 方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，当添加的标记为六聚组氨酸(6xHis) 的序列时，可以采用利用镍柱的纯化方法。-其它工艺-对于所述其它工艺，只要不影响本发明的效果，没有特别限制，可以根据目的适当 选择，可以举出在 < 利用担子菌制备具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的方法 > 中记载的工乙寸。(编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的DNA)本发明的编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的DNA是，编码包含用序列标识 符1表示的氨基酸序列的蛋白质的DNA、编码包含用序列标识符1表示的氨基酸序列中的 第27位至第206位的氨基酸序列的蛋白质的DNA、包含用序列标识符2表示的碱基序列的 DNA、包含用序列标识符2表示的碱基序列中的第79位至第621位的碱基序列的DNA。并且，本发明的编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的DNA还包括编码包含用 序列标识符1表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或者添加的氨基 酸序列的蛋白质的DNA ；编码包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的第27位至第206位 的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质的 DNA。在此，对于“多个氨基酸”，如上所述，只要具有内切葡聚糖酶活性，没有特别限制，可以 根据目的适当选择。并且，对于氨基酸被取代、缺失、插入或者添加的区域，只要具有内切葡 聚糖酶活性，没有特别限制，可以根据目的适当选择。进一步地，本发明的编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的DNA还包括与包 含用序列标识符2表示的碱基序列的DNA和所述DNA的互补链中的任意一个在严谨 (stringent)条件下杂交的DNA ；与包含用序列标识符2表示的碱基序列中的第79位至第 621位的碱基序列的DNA和所述DNA的互补链中的任意一个在严谨条件下杂交的DNA。另外，本发明的编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的DNA还可以是与包含用序 列标识符2表示的碱基序列的DNA或与包含用序列标识符2表示的碱基序列中的第79位 至第621位的碱基序列的DNA具有序列一致性的DNA。对于所述碱基序列一致性，只要具有 内切葡聚糖酶活性，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是优选70 %以上，进一步优 选80%以上，尤其优选90%以上，最为优选95%以上。所述碱基序列的一致性可以通过与上述的氨基酸序列的一致性相同的方法确定。 对于分析所述碱基序列的一致性的程序，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可 以列举blastn程序。对于利用所述程序分析序列一致性时的参数，没有特别限制，可以根 据目的适当选择，例如，可以使用默认值。对于所述DNA的制备方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举 出应用杂交技术(Southern，EM.，J Mol Biol，1975，98，503.)的方法、应用聚合酶链式反应 (PCR)技术(Saiki, RK.等，Science，1985，230，1350.、Saiki，RK.等，Science，1988，239， 487.)的方法、对于所述DNA通过定点突变(site-directed mutagenesis)方法(Kramer, W.和 Fritz, HJ.，MethodsEnzymol, 1987，154,350.)导入突变的方法等。
另外，在自然界中也会发生由碱基序列的突变引起编码的蛋白质的氨基酸序列突 变。另一方面，即使碱基序列发生突变，也会出现该突变不引起蛋白质中的氨基酸突变的情 况。本发明的DNA包括这种人工合成的DNA或者自然突变的DNA。对于所述DNA的形态，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出基 因组DNA、cDNA、化学合成DNA等。对于所述基因组DNA的制备方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如， 可以举出以下方法通过从包含本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的基因的生物 提取基因组DNA，构建基因组文库(作为载体，可利用质粒、噬菌体、粘粒、细菌人工染色体 (BAC)、Pl派生人工染色体(PAC)等)，并展开该基因组文库，利用基于序列标识符2记载 的碱基序列或者基因组上的其附近的碱基序列制备的探针，进行菌落杂交或噬菌斑杂交， 从而制备基因组DNA。并且，也可以通过以下方法而制备合成对序列标识符2记载的碱基 序列或基因组上的其附近的碱基序列具有特异性的引物，利用该引物进行PCR扩增。对于所述cDNA的制备方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举 出，通过基于从包含本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的基因的生物提取的mRNA 合成cDNA，将该cDNA插入到载体构建cDNA文库，并展开该文库，利用基于序列标识符2记 载的碱基序列信息合成的探针或引物，进行菌落杂交或噬菌斑杂交，或者进行PCR扩增，由 此制备cDNA的方法。如此，通过杂交技术或PCR技术可以分离的包含用序列标识符2表示的碱基序列 的DNA，或者与所述DNA及所述DNA互补链杂交的DNA，只要是编码具有内切葡聚糖酶活性 的蛋白质，均包含于本发明的DNA。对于利用所述杂交技术时的反应条件，只要能够分离上述的DNA，没有特别限制， 可以根据目的适当选择，但是优选严谨条件。对于所述严谨条件，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，钠浓度优选 25mM 500mM，进一步优选25mM 300mM，温度优选42°C 68°C，进一步优选42°C 65°C。 例如，可以举出5XSSC(83mM的NaCl，83mM的柠檬酸钠)，温度为42°C。由此分离的DNA认为与序列标识符2记载的碱基序列或者用序列标识符2表示 的碱基序列中的第79位至第621位的碱基序列具有较高的序列一致性。对于较高的序列一 致性而言，在整个碱基序列中，优选70%以上，进一步优选80%以上，尤其优选90%以上， 最为优选95%以上。认为这种碱基序列可以编码具有与本发明的内切葡聚糖酶实质相同的 活性的蛋白质。另外，对于表现如上所述的碱基序列的序列一致性或编码的蛋白质的氨基酸序列 的序列一致性的DNA来说，如上所述，可以将杂交作为指标而得到，但是还可以从通过基因 组碱基序列分析等得到的功能未知的DNA群和公共数据库中，通过例如利用所述的BLAST 程序的检索而容易发现。这种检索是本技术领域的研究人员通常使用的方法。由此得到的DNA编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质是通过以下方法确认如下 所述，整合到适当的载体上，转化适当的宿主，培养转化体，对于得到的蛋白质，采用如上所 述方法测定内切葡聚糖酶活性。(重组载体)本发明的重组载体至少包含本发明的DNA，根据需要还包含其它的DNA。
对于所述载体，只要是能够在宿主中复制的，没有特别限制，可以根据目的适当选 择，例如，可以举出质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。作为这些载体的具体示例，可以举出来源于 酵母的质粒、来源于大肠杆菌的质粒、来源于枯草杆菌的质粒、λ噬菌体、反转录病毒或者 牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒载体。并且，优选地，所述载体是能够表达本发明的DNA的表达载体。对于所述其它的DNA，只要不影响本发明的效果，没有特别限制，可以根据目的适 当选择，例如，可以举出标记基因、调控序列、纯化用序列等。作为所述标记基因，例如，可以举出，如URA3、niaD等宿主营养缺陷型互补基因， 对于氨苄西林、卡那霉素等药物具有抗性的抗药基因等。作为所述调控序列，例如，可以举出启动子序列、增强子序列、终止序列、多聚腺苷 酸化(polyadenylylation)序列等。对于所述启动子序列，没有特别限制，可以根据目的适 当选择，还可以使用除了在自然状态下调控本发明的DNA表达的固有的启动子以外的启动子。作为所述纯化用序列，例如，可以举出编码组氨酸的碱基序列等。本发明的重组载体可以通过将本发明的DNA和根据需要进一步选择的其它的DNA 连接(插入)到适当的载体而得到。对于将上述DNA插入到载体的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例 如，可以举出以下方法采用适当的限制性酶切断纯化的DNA，插入到适当的载体DNA的限 制性酶位点或者多克隆位点，由此连接载体。(转化体)本发明的转化体可以通过将本发明的载体(表达载体)导入到宿主中而得到。对于所述宿主，只要是能够表达本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的， 没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等 酵母，大肠杆菌(Escherichia coli)等属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌，枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)等属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌，或者恶臭假单胞 菌(Pseudomonas putida)等属于假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌，COS细胞、CHO细 胞等动物细胞，Sf9等昆虫细胞等。其中，从大量产生活性型酶的方面考虑，毕赤酵母 (Pichiapastoris)是优选的。对于将所述载体导入到宿主中的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择。作为将重组载体导入到酵母的方法，例如，可以举出电穿孔法、原生质体转化法、 醋酸锂法等。作为将重组载体导入到细菌的方法，例如，可以举出利用钙离子的方法、电穿孔法寸。作为将重组载体导入到动物细胞的方法，例如，可以举出电穿孔法、磷酸钙法、脂 质体介导法等。作为将重组载体导入到昆虫细胞的方法，例如，可以举出磷酸钙法、脂质体介导 法、电穿孔法等。对于确认本发明的重组载体是否导入到宿主的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出PCR法、Southern杂交方法(Southernhybridization method)、Northern 杂交方法(Northern hybridization method)等。作为所述PCR法，例如，从转化体制备DNA，设计DNA特异性引物进行PCR扩增，对 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或者毛细管电泳等，用溴化乙锭、SYBR 绿色核酸凝胶(SYBR Green)染色液等进行染色，由此以一条条带检测扩增产物，从而可以 确认重组载体导入到宿主。并且，可以利用预先用荧光染料等标记的引物进行PCR扩增，检 测扩增产物。进一步地，可以将扩增产物结合到微孔板等固相，并通过荧光或者酶反应等确 认扩增产物。如上所述，所述转化体可以用于制备本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质， 得到的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质优选地可以适用于后述的糖的制备方法、利用该糖 的乙醇的制备方法，还适用于食品、饲料、洗涤剂以及含有纤维素的织物的处理方法。(糖的制备方法)本发明的糖的制备方法包括，至少利用本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质 以及担子菌中的任意一个，从生物质原料得到糖的工艺(糖获得工艺)，并且根据需要还包 括其它工艺。-糖获得工艺_所述糖获得工艺是至少利用本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质以及担子 菌中的任意一个，从生物质原料得到糖的工艺，根据需要，还可以利用除了本发明的具有内 切葡聚糖酶活性的蛋白质以外的纤维素酶。对于所述生物质原料，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以使用作 为伴随农业和林业等生产活动的废弃物得到的“废弃物类生物质”、以得到能量等为目的专 门栽培而得到的“资源作物类生物质”等。作为所述“废弃物类生物质”，例如，可以举出废 弃建材、间伐材、稻秸、麦秸、糠、蔗渣(甘蔗渣)等。并且，作为所述“资源作物类生物质”， 例如，可以举出甘蔗、玉米等糖类作物等。并且，生物质原料还可以分为以树木为原料的“木 质生物质”、以草为原料的“草本生物质”等。并且，所述生物质原料可以单独使用，也可以两种以上组合使用。对于所述担子菌，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是优选属于担子菌 门伞菌亚门的担子菌，进一步优选属于担子菌门伞菌亚门伞菌纲的担子菌，尤其优选属于 担子菌门伞菌亚门伞菌纲非褶菌目的担子菌，最为优选黄孢原毛平革菌(Wianerochaete chrysosporium)0对于所述纤维素酶，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出黄孢 原毛平革菌(P. chrysosporium)的 Cel6A 等。对于在所述糖获得工艺中的本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的使用量， 没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，基于所述生物质原料lg，优选0. OOlmg lOOmg，进一步优选0. Olmg 10mg，最为优选0. Img lmg。如果基于所述生物质原料lg， 所述蛋白质的使用量小于0. OOlmg，则不能充分进行糖化；如果超过lOOmg，则阻碍糖化反 应发生。另一方面，如果所述蛋白质的使用量在所述最为优选的范围内，则从相对于酶添加 量可以获得的糖的量较多的方面考虑，是有利的。并且，对于所述担子菌的使用量，没有特别限制，可以考虑担子菌产生的内切葡聚糖酶的量等因素而适当选择。另外，进一步使用所述纤维素酶时，对于该纤维素酶的使用量，没有特别限制，可 以根据目的选择，但是本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质与所述纤维素酶的摩尔 比，优选为75 25 25 75，进一步优选为75 25。对于所述糖获得工艺中的温度，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如优选 10°C 70°C，进一步优选20°C 60°C，最为优选30°C 50°C。如果所述温度小于10°C，则 不能进行糖化；如果超过70°C，则所述具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质就会失去活性。另 一方面，如果所述温度在所述最为优选的范围内，则从相对于所述具有内切葡聚糖酶活性 的蛋白质的使用量可以获得的糖的量较多的方面考虑，是有利的。对于所述糖获得工艺中的pH，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如优选 2. 0 8. 0，进一步优选3. 0 7. 0，最为优选4. 0 6. 0。如果所述pH值小于2. 0或者大 于8.0，则所述具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质就会失去活性。另一方面，如果所述pH值在 所述最为优选的范围内，则从相对于所述具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的使用量可以获 得的糖的量较多的方面考虑，是有利的。通过所述糖获得工艺，例如可以得到含有来源于纤维素的糖的葡萄糖的糖液。并 且，优选地，通过所述糖获得工艺得到的糖液还包含来源于半纤维素的糖。作为来源于半纤 维素的糖，例如，可以举出称为木糖、阿拉伯糖的戊糖，称为葡萄糖、半乳糖、甘露糖的己糖。所述糖液例如可以直接提供于后述的本发明的乙醇制备方法中，也可以经过如下 所述的其它工艺后，提供于后述的本发明的乙醇制备方法中。〈其它工艺〉对于所述其它工艺，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出将所 述糖液的PH值调整为适合后述的发酵工艺的pH值的工艺等。(乙醇的制备方法)本发明的乙醇的制备方法包括通过发酵根据所述糖的制备方法得到的糖而获得 乙醇的工艺(发酵工艺)，并且根据需要还包括其它工艺。-发酵工艺-对于所述发酵糖的方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择，但是例如，最为 优选通过向含有所述糖的溶液添加酵母等醇类发酵微生物而进行醇类发酵的方法。对于 所述酵母，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出酵母属(Saccharomyces) 酵母等。另外，所述酵母可以是天然酵母，也可以是基因重组酵母。对于在所述发酵时的所述酵母的使用量、发酵温度、pH值、发酵时间等，没有特别 限制，例如，可以根据提供到醇类发酵的糖的量、使用的酵母的种类等适当选择。-其它工艺-对于所述其它工艺，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以举出分离 纯化通过所述发酵工艺得到的乙醇的工艺等。对于所述分离纯化方法，没有特别限制，可以 根据目的适当选择，例如，可以举出蒸馏等方法。通过所述乙醇的制备方法得到的乙醇可以优选地适用于例如燃料用乙醇、工业用 乙醇等用途。由于所述乙醇可以从生物质原料得到，因此只要有生物质原料就能够进行再 生产。并且，由于成为生物质原料的植物在栽培时吸收大气中的二氧化碳，因此即使所述乙醇燃烧而产生二氧化碳，也不会增加大气中的二氧化碳浓度。据此，所述乙醇可以视为有利 于防止地球热化的能源。并且近年来，人们尤其期待着这种乙醇与汽油混合而作为环保的 汽车燃料使用。(食品以及饲料)本发明的食品以及饲料至少包含本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，并且 根据需要还包含其它成分。对于所述食品以及饲料中的本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的含量，没 有特别限制，可以根据目的适当选择。并且，对于所述食品以及饲料的制造方法，没有特别限制，可以根据目的适当选 择。由于所述食品以及饲料含有本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，因此例如 可以分解包含在食品以及饲料中的纤维素等，可以有效地促进消化。(洗涤剂)本发明的洗涤剂至少包含本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，并且根据需 要还包含其它成分。对于所述洗涤剂中的本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的含量，没有特别 限制，可以根据目的适当选择。并且，对于所述洗涤剂的制造方法，没有特别限制，可以根据目的适当选择。由于所述洗涤剂含有本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，因此例如可以有 效地去除被堵在洗涤对象的纤维素纤维的污垢。(含有纤维素的织物的处理方法)本发明的含有纤维素的织物的处理方法包括利用本发明的具有内切葡聚糖酶活 性的蛋白质中的至少一个而处理含有纤维素的织物的工艺(处理工艺)，并且根据需要还 包括其它工艺。对于所述含有纤维素的织物，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以 举出牛仔裤。对于所述处理工艺中的本发明的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的使用量、温 度、时间等，没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，采用本发明的含有纤维素的织物的处理方法处理所述牛仔裤时，例如可以 进行石磨水洗(Stone Washing)加工等。实施例以下，结合实施例进一步详细说明本发明，但是本发明不限于这些实施例。(具有内切葡聚糖酶活性的新型蛋白质的基因的探索)为了得到具有内切葡聚糖酶活性的新型蛋白质的基因，首先通过以下方法，对于 由担子菌的黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)K—3 株(Johnsrud, S. C.禾口 K. E. Eriksson. 1985. Cross breeding of selected and mutatedhomokaryotic strains of Phanerochaete chrysosporium K_3_New eellulasedeficient strains with increased ability to degrade lignin. Appl. Microbiol. Biotechnol. 21 :320-327.)产生的蛋白质 进行了研究。
将上述黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) K-3株在含有2 %的纤 维素(CFl 1 ；Whatman 公司制造)的 Kremer 禾口 Wood 培养基(Kremer,S. Μ.和 P. M.Wood· 1992. Evidence that cellobiose oxidase from Phanerochaetechrysosporium is primarily an Fe (III)reductase. Kinetic comparison withneutrophil NADPH oxidase and yeast f lavocytochrome b2. Eur. J. Biochem. 205 :134)中，基于文献(Habu, N. , K. Igarashi, Μ· Samejima, B. Pettersson 禾口 K. Ε· Eriksson. 1997. Enhanced production of cellobiose dehydrogenase incultures of Phanerochaete chrysosporium supplemented with bovine calf serum. Biotechnol. Appl. Biochem. 26 98)的记载，培养了 3 天。过滤所述培养后的培养液，采用玻璃纤维滤纸(ADVANTEC(注册商标)GA-100 ；东 洋滤纸株式会社制造)分离菌丝体。并且，分离的菌丝体用液氮冷冻，用于后述的总RNA的 提取。利用离心过滤装置(Ultrafree(注册商标)-0. 5Centrifugal Filter Device, Millipore公司制造)对500 μ L的培养液滤液进行浓缩，利用Bio-Rad公司制造的装置 (Mini-Protean II)，对该浓缩液(约100 μ g的未纯化的蛋白质)进行SDS-PAGE (12%的 聚丙烯酰胺凝胶)检测。其结果，可知，黄孢原毛平革菌(Wianerochaete chrysosporium) K-3株产生如图1所示的蛋白质。另外，在图1中，“箭头”表示后述的进行N-末端氨基酸 序列确定的蛋白质。完成上述的SDS-PAGE检测后，利用Bio-feid公司制造的装置(Trans-BlotSD Cell)，将18kDa的蛋白质(图1的箭头，以下称为“PcCel45A”。)转印到PVDF膜(Millipore 公司制造)。此后，通过蛋白质测序仪(型号491cLc ;Applied Biosystems公司制造)确定 所述转印的PcCel45A的N-末端氨基酸序列。其结果，PcCel45A的N-末端氨基酸序列是 ATGGYVQQAT。通过进行所述PcCel45A的N-末端氨基酸序列的序列一致性检索，研究与所述 PcCel45A序列具有一致性的序列。进行所述序列一致性检索时，BLAST程序使用tblastn，数据库使用黄孢原毛平革 菌(Phanerochaete chrysosporium)白勺基因组数据库 ν2· O (http://genome. jgi_psf· org/ Phchrl/Phchrl. home, html)。设定 tblastn 时，除了将 “expect value” 设定为 “ le_l”，将 "scoring matrix”设定为“PAM30”以外，设定为默认值。其结果，得知，所述PcCel45A的N-末端氨基酸序列与功能未知的黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)的"Scaffold 6、1798263-1798234，，一致。(PcCel45A 的 cDNA 的克隆)其次，通过如下所述的方法，进行所述PcCel45A的cDNA的克隆。首先，利用ISOGEN(nippongene株式会社制造)，基于制造商的使用手册，从上述 的冻结的菌丝体提取约200mg的总RNA。利用Oligotex (TM) _dT30<Super>(宝生物工程(TaKaRa Bio)株式会社制造)，从 所述提取的ι μ g的总RNA纯化mRNA。并且，利用反转录酶(ReverTraAce ；东洋纺绩株式会社制造)和cDNA3'末端快 速扩增(rapid-amplification of cDNA 3' ends, 3' RACE)接头引物(adapter primer)(Invitrogen公司制造)，基于制造商的使用手册，将所述mRNA作为模板合成第一链 (First-strand)cDNA。此后，将所述第一链cDNA为模板，通过PCR反应扩增编码所述PcCel45A的区域 和3'非翻译区(将94°C、2分钟为一个循环；将98°C、10秒，68°C、30秒为25个循环；4°C 下结束)。进行PCR扩增时，聚合酶使用KOD-Plus (版本2 ；东洋纺绩株式会社制造)，引 物使用基于黄孢原毛平革菌(Wianerochaete chrysosporium)的基因组序列设计的引物 (Pccel45A-Fl、Pccel45A-F2)和反向引物Qnvitrogen公司制造)，并基于制造商的使用手 册进行扩增。引物 Pccel45A-Fl :ATGGCGAAGCTGTCGATGTTCTTGGG (序列标识符 3)Pccel45A-F2 CTGACCGTCTCCGAGAAGCGTG (序列标识符 4)反向引物精简的通用扩增引物(AbridgedUniversal AmplificationPrimer) (Invitrogen公司制造)并且，利用GneneRacer (商标)试剂盒 Qnvitrogen 公司制造)、SuperScript (注 册商标)111 RTdnvitroge公司制造)以及以下的基因特异性引物，扩增5'非翻译区的碱 基序列(将94°C、2分钟为一个循环；将98°C、10秒，70°C、30秒为5个循环；将98°C、10秒， 680C >30秒为5个循环；将98°C、10秒，66°C、30秒，68°C、30秒为20个循环；4°C下结束)。引物Pccel45A-5' -Rl :CAGCCTTGCCGCAAGCAGGAGAGCCGC (序列标识符 5)Pccel45A-5' -R2 :CGCAAGCAGGAGAGCCGCAGCCCGAAT (序列标识符 6)用kro Blunt (注册商标)Τ0Ρ0 (注册商标)PCR克隆试剂盒Gnvitrogen公司制 造)和大肠杆菌(E. coli)JM109株(宝生物工程(TaKaRa Bio)株式会社制造)，对在上述 步骤中得到的PCR产物进行克隆。并且，利用耐热测序引物循环测序试剂盒(Thermo Sequence Primer CycleSequencing Kit) (GE Healthcare 公司制造)和 DNA 测序仪 SQ5500E (株式会社日立 高新技术制造)，分析所述PCR产物的碱基序列。其结果，得知，所述cDNA由718bp长的序列构成，在黄孢原毛平革菌 (P. chrysosporium)的基因组上，包含被两个内含子分成三个外显子的、编码206氨基酸的 翻译区。结果示出在图2以及图3。另外，在图2中，用灰色的反底表示的部分(KR)表示Kex2蛋白酶的加工位点 (processing site)，并且至今为止在分泌蛋白组(kcretome)研究中发现的序列用粗体表
7J\ ο(PcCel45A氨基酸序列分析)-信号肽分析-对于信号肽(signal peptide)，利用生物学序列分析中心(the Center forBiological Sequence Analysis)的 SignalP 3· O 月艮务器(http://www. cbs. dtu. dk/ services/SignalP/)进行了分析。其结果得到了以下启示与上述的PcCel45A的N-末端氨基酸序列(图2中用双 下划线表示。)不同的最初的19氨基酸(图2中用单下划线表示。)为信号肽。
-糖基化位点分析_对于N型糖基化位点(glycosylation site)，利用生物学序列分析中心 (theCenter for Biological Sequence Analysis)的 NetNGlyc 1· 0 月艮务器(http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/)进行了分析。其结果，预测有一个N型糖基化位点(图2中用反底表示部(NYT)表示)。对于0型糖基化位点，利用生物学序列分析中心(the Center for BiologicalSequence Analysis)的 NetOGlyc 3· 1 月艮务器(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/)进行了分析。其结果，预测有四个0型糖基化位点(图2中用方框部表示)。-序列一致性分析_对于所述PcCel45A的氨基酸序列，BLAST程序使用blastp，数据库使用NCBI蛋白 质数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/Blast. cgi)，进行了序列一致性检索。另 外，设定blastp时，设定为默认值。其结果，得知，所述PcCel45A的氨基酸序列对于属于真菌GH家族-45 (EGV)的内 切葡聚糖酶，仅具有较低的序列一致性，因此所述PcCel45A是新型蛋白质。除了假设的蛋白质以外，与所述PcCel45A的序列一致性最高的是红褐肉座菌 (H. jecorina(T. reesei))的EGV，为22%。并且还得知，所述PcCel45A中并不包含属于真 菌GH家族-45 (EGV)的内切葡聚糖酶的保守的预测结构域。其次，对于所述PcCel45A的氨基酸序列与在BLAST检索结果中已确认序列相关性 的以下五个蛋白质的氨基酸序列，根据E-INS-i算法的MAFFT (版本6 ；http//align, bmr. kyushu_u.ac.jp/mafTt/online/server/)禾呈序，进 亍多序列比对(Multiple alignment)。 结果示出在图4。另外，图4是利用序列着色软件B0XSHADE(http://www. ch. embnet. org/ software/B0X_form. html)而制作的。五个蛋白质·灰盖鬼伞菌(Coprinopsis cinerea)的假设的蛋白质(以下，称为“CcHP”。)。·玉米黑粉菌(Ustilago maydis)的假设的蛋白质(以下，称为“UmHP”。)。·构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的假设的蛋白质(以下，称为“AnHP”。)。·烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的假设的蛋白质(以下，称为“AfHP”。)。 红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的 Cel45A(以下，称为“HjCel45A”。)。另夕卜， 除了假设的蛋白质以外，所述HjCel45A是与上述的ISkDa的蛋白质的氨基酸序列具有最高 的序列一致性的蛋白质。通过图4中示出的PcCel45A的氨基酸序列与HjCel45A的氨基酸序列的比对，认 为PcCel45A的氨基酸序列的Aspl40(图4中的箭头部分)是酶残基中的一个。然而，在 PcCel45A的氨基酸序列中没有发现可能是其它的酶残基的氨基酸(HjCel45A的Asp27)。因 此，可以认为PcCel45A的反应机制与已知的酶不同。-系统学分析-其次，应用系统学分析PcCel45A的氨基酸序列、在blastp检索中表现出相关性 的属于真菌GH家族-45的内切葡聚糖酶的亚家族B(以下，称为“Cel45-SubB”。)的酶、 植物的膨胀素(Expansin)、在CAZy服务器上属于真菌GH家族-45的亚家族A (以下，称为“Cel45-subA”。)的酶、真菌的膨胀素(Swollenin)，结果示出在图5中。图5的系统进化树是利用最短距离法(minimum linkage method)，根据MAFFT服 务器上的多序列比对的结果制作的，并且是利用FigTree (版本1. 1. 2 ；http//tree. bio. ed. ac. uk/software/figtree/)制作的进化树。从BLAST检索结果考虑，虽然从氨基酸序列来看，PcCel45A与GH家族-45的亚家 族B略微相似，但是明显区别于GH家族-45的亚家族A。并且，如图5所示，包含PcCel45A的分化枝仅包含来源于担子菌中的灰盖鬼伞菌 (Coprinopsis cinerea (EAU91056)))、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis (XP_761686))的假设 的蛋白质。鉴于上述，可知，PcCel45A是分类为GH家族-45的新的亚家族的新型蛋白质。以 下，举例说明PcCel45A的制备方法。(利用酵母的PcCel45A的制备)-重组载体(表达载体)的制备-基于成熟的PcCel45A的碱基序列，设计以下的寡核苷酸引物(oligonucleotide primer)。寡核苷酸引物Pccel45A-XhoI-F :TTTCTCGAGAAAAGACTGACCGTCTCCGAGAAGCGTG (序列标识符 7)Pccel45A-NotI-R :TTTTGCGGCCGCTCACGAAGGGGCAGTCCCCTTGTT (序列标识符 8)将包含PcCel45A的基因的载体作为模板，利用上述的寡核苷酸引物、 KOD-Plus (版本2;东洋纺绩株式会社制造)聚合酶，进行PCR反应(将94°C、2分钟为一 个循环；将98°C、10秒，68°C、30秒为20个循环；4°C下结束)，扩增出将插入到表达载体的 DNA片段。将所述扩增出的DNA片段插入到酵母(Pichia)的表达载体pPICZ α (Invitrogen 公司制造)的HioI位点和NotI位点，得到重组载体(表达载体)。-转化体的制备_利用Bpul 1021 (宝生物工程(TaKaRa Bio)株式会社制造)，对在上述步骤中得到 的约5μ g表达载体进行线性化。并且，根据电穿孔法，将所述线性化的重组载体导入到酵 母(Pichia paSt0riS)KM71H株之后，对转化体进行筛选。所述电穿孔法以及转化体的筛选 是基于fesyklect (商标)毕赤酵母属表达试剂盒(Pichia expression kit)的使用手册 进行。据此，得到利用所述表达载体转化的转化体。-转化酵母的培养以及PcCel45A的制备及纯化-将上述的转化体在含有25 μ g/mL的博莱霉素(Zeocin)的IOmL的YPG培养基(1 % 的酵母膏、2%的多聚蛋白胨、的甘油)中，于30°C下，在以300rpm速度往复震荡的培养 器中，培养M小时，接种于装有200mL的YPG培养基的三角瓶，然后进一步在旋转培养器 (30°C、150rpm)中，培养M小时。通过离心分离(3，OOOg、10分钟)回收菌体之后，将菌体 移到50mL的YPM培养基(1 %的酵母膏、2%的多聚蛋白胨、1 %的甲醇)，每M小时加入甲 醇以使终浓度达到1%，同时进一步在旋转培养器(30°C、150rpm)中，培养96小时。离心分离(30分钟、5，OOOXg)所述培养液，将得到的培养上清液作为酵母粗提 液。在所述酵母粗提液中加入硫酸铵以使终浓度达到1M，并且加入醋酸钠缓冲液(pH5.0)以使终浓度达到20mM。利用用含有IM的硫酸铵的20mM的醋酸钠缓冲液(pH5. 0)平衡的 Phenyl-Toyopearl 650S柱Q6mmX 120mm, TOSOH株式会社制造)，对所述溶液进行分馏。 PcCel45A在300mL的反梯度下洗脱到20mM的醋酸钠缓冲液(ρΗ5. 0)中。此后，收集含有所述PcCel45A的分馏物，对20mM的磷酸钾缓冲液(ρΗ7. 0)进 行平衡。并且，用20mM的磷酸钾缓冲液(ρΗ7. 0)平衡的SuperQ-Toyopearl 650S柱 (9mmX 120mm, TOSOH株式会社制造)中加入所述经过平衡的含有PcCel45A的溶液。 PcCel45A在IOOmL的OM 0. 5M的氯化钠的线性梯度下从分馏柱洗脱下来。得到的PcCel45A的纯度利用SDS-PAGE(12%的聚丙烯酰胺凝胶)分析。并且，得到 的PcCel45A的N-末端氨基酸序列利用蛋白质测序仪(型号491cLc ；Applied Biosystems 公司制造)确认。其结果，得知，从转化酵母得到的PcCel45A的N-末端氨基酸序列是 ATGGYVQQAT，与从担子菌的黄孢原毛平革菌(P. chrysosporium)得到的天然物质相同。其次，通过以下酶试验，确认通过上述步骤得到的PcCel45A是否具有内切葡聚糖 酶活性。(酶试验)-对各种底物的水解活性-将通过上述步骤得到的1. O μ M的PcCel45A与0. 5%的以下各底物，在250 μ L的 50mM的醋酸钠溶液(ρΗ5· 0)中，30°C下、反应120小时。底物 结晶纤维素(Funacel II，funakoshi株式会社制备。以下，称为“MCC”。)·非晶态纤维素(采用磷酸溶胀纤维素、结晶纤维素，通过记载于文献(Wood， Τ. Μ. 1988. Preparation of crystalline, amorphous, and dyed cellulasesubstrates. Methods Enzymol. 160 :19-25)的方法制备。以下，称为 “PASC”。) 羧甲基纤维素(7LFD，Hercules公司制备。以下，称为“CMC”。)·地衣多糖(Sigma-Aldrich公司制备) 大麦β -葡聚糖(Sigma-Aldrich公司制备)·葡甘聚糖(和光纯药工业株式会社制备)·木聚糖(Sigma-Aldrich 公司制备)-生成的还原糖量的测定一进行1小时的所述反应之后，加入等体积的1.0Μ的氢氧化钠溶液，停止反应。 并且，通过对羟基苯甲酸酰胼(p-hydroxybenzoic acid hydrazide, PHBAH)法(Lever, Μ. 1972. A new reaction for colorimetric determination ofcarbohydrates.Anal. Biochem. 47 :273-279.)，将葡萄糖(和光纯药工业株式会社制备)作为标准，测定还原糖 量。结果示出在表1。[表 1]
权利要求
1.一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质是来源于担子菌的蛋白质，利用SDS-PAGE测定 的分子量为18kDa，并且具有内切葡聚糖酶活性。
2 如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，担子菌是黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)0
3.一种蛋白质，其特征在于，具有内切葡聚糖酶活性，并且为记载于下述(a)至(d)中 任意一个的蛋白质(a)包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的蛋白质；(b)包含用序列标识符1表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入 或者添加的氨基酸序列的蛋白质；(c)包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的第27位至第206位的氨基酸序列的蛋 白质；(d)包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的第27位至第206位的氨基酸序列中一 个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质。
4.一种DNA，其特征在于，编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，并且为记载于下述 (a)至(f)中任意一个的蛋白质(a)编码包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的蛋白质的DNA；(b)编码包含用序列标识符1表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被取代、缺失、 插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质的DNA ；(c)编码包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的第27位至第206位的氨基酸序列 的蛋白质的DNA ；(d)编码包含用序列标识符1表示的氨基酸序列的第27位至第206位的氨基酸序列 中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质的DNA ；(e)包含用序列标识符2表示的碱基序列的DNA；(f)与包含用序列标识符2表示的碱基序列的DNA以及所述DNA的互补链中的任意一 个在严谨条件下杂交的DNA ；(g)包含用序列标识符2表示的碱基序列中的第79位至第621位的碱基序列的DNA；(h)与包含用序列标识符2表示的碱基序列中的第79位至第621位的碱基序列的DNA 以及所述DNA的互补链中的任意一个在严谨条件下杂交的DNA。
5.一种重组载体，其特征在于，包含记载于权利要求4的DNA。
6.一种转化体，其特征在于，该转化体是利用记载于权利要求5的重组载体转化得到的。
7.一种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的制备方法，其特征在于，包括以下工艺培养记载于权利要求6的转化体；从所述培养物提取具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。
8.一种糖的制备方法，其特征在于，利用记载于权利要求1至3中任意一项的蛋白质以 及担子菌中的至少一个，从生物质原料获得糖。
9.如权利要求8所述的糖的制备方法，其特征在于，进一步利用除了记载于权利要求1 至3中任意一项的蛋白质以外的纤维素酶。
10.一种乙醇的制备方法，其特征在于，通过发酵根据记载于权利要求8至9中任意一项的糖的制备方法得到的糖，获得乙醇。
11.一种食品，其特征在于，含有记载于权利要求1至3的蛋白质中的至少一个。
12.—种饲料，其特征在于，含有记载于权利要求1至3的蛋白质中的至少一个。
13.一种洗涤剂，其特征在于，含有记载于权利要求1至3的蛋白质中的至少一个。
14.一种含有纤维素的织物的处理方法，其特征在于，利用记载于权利要求1至3的蛋 白质中的至少一个，处理含有纤维素的织物。
全文摘要
从在安全性等方面上容易使用的、分类有食用菌的担子菌发现具有内切葡聚糖酶活性的新型蛋白质，提供编码该蛋白质的新型DNA、含有该DNA的载体、含有该载体的转化体以及利用该转化体制备具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的方法，并且提供至少利用具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质及担子菌中的任意一个制备糖的方法、利用通过该糖的制备方法获得的糖制备乙醇的方法，还提供含有具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的食品、饲料、洗涤剂以及利用具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质处理含有纤维素的织物的方法。本发明的蛋白质的特征在于，该蛋白质是来源于担子菌的蛋白质，利用SDS-PAGE测定的分子量为18kDa，并且具有内切葡聚糖酶活性。
文档编号C12N9/42GK102099469SQ20098012801
公开日2011年6月15日 申请日期2009年7月16日 优先权日2008年7月16日
发明者五十岚圭日子, 鲛岛正浩 申请人:国立大学法人东京大学