用于生产高容量重组腺病毒的自失活辅助性腺病毒的制作方法

专利名称：用于生产高容量重组腺病毒的自失活辅助性腺病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及腺病毒载体领域，更具体的说，涉及通过使用自失活辅助性腺病毒的 第三代腺病毒载体或无肠(gutless)腺病毒载体的生产系统领域，其能允许通过使用辅助 性腺病毒在细胞中产生高容量腺病毒中污染最小的重组腺病毒。
背景技术：
高容量腺病毒(HC-Ad)，也被称为无肠腺病毒或辅助病毒依赖型腺病毒，具有作 为基因治疗的载体的能力，因为在啮齿类动物和其他灵长类动物中它们都能维持高转导效 率和其他腺病毒载体的向性，但是在感染的细胞中它们阻止与病毒蛋白表达相关的免疫原 性。此外，这些病毒载体具有插入目标转基因的大容量(高达约361Λ)，其远高于其他病毒 载体的容量。高容量腺病毒载体是基于将其中所有病毒编码序列“掏空”的腺病毒。这些载体 对腺病毒基因组末端区域(ITR，末端反向重复序列)和顺式作用的包装信号(Ψ)具有最低 的要求，ITR对于病毒复制是必要的。鉴于高容量腺病毒缺少所有的病毒编码区域，所以其增殖需要使用删除El区域 且提供反向病毒蛋白的辅助病毒。通过293细胞株的共转染和协同感染进行增殖，在增殖 时整合辅助病毒中删除的El区域。然而，这个增殖系统也产生了不需要的病毒颗粒，其用壳体包裹辅助病毒基因组， 且污染了高容量腺病毒的最终制剂。辅助病毒的积累变化很大，但有时变得过于强烈以至 于取代了高容量腺病毒，这也是目前的生产方法对于临床应用不够可靠的原因之一。其性 能是另一个限制因素，也部分地与辅助病毒的表象有关。直到现在才对用于减少辅助病毒 包装效率的不同系统进行开发和描述。这些系统一般都基于辅助病毒包装信号的突变的合 并，基于基因组数量的增加，更特别的是基于病毒生产过程中包装信号的特异性去除。Parks 等(Proc. Natl. Acad. ki. USA 1996 ；93 :13565-13570)描述 了通过 Cre-IoxP重组系统去除辅助病毒的包装信号Ψ的方法，其中所述病毒的信号Ψ两侧是 IoxP位点。如果在表达Cre重组酶的293细胞株中进行增殖，重组酶将切除辅助病毒的信 号Ψ，阻止其进行包装，但这样它保留了对于高容量腺病毒的包装必要的编码序列。可选择 地，US 7，045，347和Ng等(Mol Ther 2001 3 :809-815)描述了基于辅助病毒的辅助病毒 失活系统，辅助病毒的包装序列两侧具有FLP重组酶的frt识别位点，以使表达酵母FLP重 组酶的293细胞株中辅助病毒的增殖可引起包装序列的切除。这些系统的缺点是重组酶催化的反应是双向的，由此能在辅助病毒的基因组中 再次引入包装序列。为了阻止这个问题，Groth等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000:97: 5995-6000)提出使用单向重组酶，特别是WiiC31重组酶，使用特异性attB/attP识别序列 位于信号Ψ的两侧。当WiiC31重组酶通过去除两侧为attB/attP位点的序列时，它更改 识别序列且将它们转化为attR/attL序列，阻止识别再次发生(信号Ψ的重新引入)。然而，所有的方法都面临着这样的问题，S卩如果要去除辅助病毒的包装序列则需要使位于宿主细胞基因组中编码重组酶的序列表达。所述过程发生在病毒周期的一瞬间， 其中由于与腺病毒感染相关的细胞病变影响，细胞蛋白质的表达被部分抑制，因此可能达 不到消除所有辅助性腺病毒复制体的足够高的胞内重组酶水平。因此，提出了替代方法以阻止能够被包装的辅助性腺病毒的产生，或至少，延迟其 形成及无肠载体的形成。因此，专利文件W02007125146描述了前述方法的一种变型，其 中辅助性腺病毒载体包括一个位于包装序列和与所述包装序列最近的ITR之间的噬菌体 OC31 attB序列。即使不存在Φ031重组酶，包含所述attB位点将使与无肠腺病毒有关 的辅助性腺病毒的包装延迟，这能减少在无肠病毒制备中污染的辅助性腺病毒的数量。然 而，这种方法只能使辅助性腺病毒的形成延迟，却不能阻止有包装能力的辅助性腺病毒的 形成。这个问题通过DE10159167所描述的腺病毒系统解决。在该系统中，重组酶由无肠 腺病毒编码，而且辅助性腺病毒包括重组酶识别靶位点，其能限定一个包括包装信号的区 域，而组酶识别靶位点的消除使存在于辅助性腺病毒3’端与表达沉默子有关的El腺病毒 基因接近AAV p5转录启动子。因此，存在无肠腺病毒时，重组酶消除辅助性腺病毒基因组 中的包装区域，同时允许El基因表达，其对于无肠腺病毒的包装是必要的。然而，这个腺病 毒系统包括一个表达El的辅助病毒，因此，它是一种可复制病毒，而且比常规的辅助病毒 更危险。此外，无肠病毒表达重组酶在潜在的临床应用的治疗载体中是不必要的。另一个阻止包装细胞对重组酶的依赖的可选择的解决方案是使用由辅助病毒自 身编码的重组酶。专利文件US20020072120描述了辅助性腺病毒载体编码了一种通过Cre 重组酶形成的融合蛋白以及雌激素受体的配体结合域，所述融合蛋白由组成型启动子调控 的序列编码。Cre-ER融合蛋白只能位移至细胞核且在有雌激素或类似物的存在下，发挥其 重组酶活性，借以消除用细胞表达重组酶的需求，同时通过向培养基中添加雌激素调节重 组酶活性从而阻止其毒性作用。因此，本领域需要能消除现有系统缺点的用于腺病毒载体的包装系统，特别是能 够最大化减少无肠腺病毒增殖期间产生辅助性腺病毒的方法。

发明内容
在第一方面，本发明涉及一种多核苷酸，其包括a)编码位点特异性重组酶的区域，其中所述区域由诱导型启动子调控，以及b)对于腺病毒基因组的复制和/或包装必不可少的区域，该腺病毒基因组的两侧 为对由序列a)编码的重组酶具有特异性的识别序列，其中所述识别序列被定向，以使存在 所述重组酶时，切除所述重要区域。在第二方面，本发明涉及一种包括本发明多核苷酸的表达载体。在第三方面，本发明涉及一种包括本发明多核苷酸序列的腺病毒颗粒。在另一方面，本发明涉及一种用于自失活辅助性腺病毒复制和包装的系统，其包 括a)根据本发明的一种多核苷酸、表达载体或腺病毒颗粒；以及b) 一个真核细胞。在另一方面，本发明涉及一种用于获得自失活辅助性腺病毒的方法，其包括
(i)在适合的条件下使细胞与本发明的一种多核苷酸、一个表达载体或一个腺病 毒颗粒及可选择地一个或多个编码对于细胞中腺病毒包装或复制必要的腺病毒蛋白质的 多核苷酸接触，以使腺病毒基因组或包括所述基因组的多核苷酸进入细胞，(ii)将该细胞维持在适当的条件下，允许细胞中腺病毒的包装和复制，并阻止位 点特异性重组酶的表达，和(iii)从培养基中重新获得腺病毒。在另一方面，本发明涉及一种根据前述段落所述的方法获得的辅助性腺病毒。在另一方面，本发明涉及根据本发明的用于高容量腺病毒的生产和包装的多核苷 酸、载体和腺病毒颗粒的应用。在另一方面，本发明涉及一种用于高容量重组腺病毒生产的系统，其包括(a)根据本发明的一种多核苷酸、表达载体或腺病毒颗粒；(b) 一个腺病毒，其基因组包括目的基因且该腺病毒缺少编码至少一个复制所需 的重要蛋白质的序列，或缺少编码至少一个对所述腺病毒包装重要的蛋白质的序列，或包 含所述腺病毒基因组的多核苷酸，和(c) 一个真核细胞。在另一方面，本发明涉及一种产生表达目的基因的高容量腺病毒的方法，其包括 以下步骤(i)在适合条件下将一个细胞与一个腺病毒接触，以使所述腺病毒基因组或包含 所述基因组的多核苷酸进入该细胞，(ii)在适合条件下将所述细胞与选自下组中的第二组分接触，(a) 一种多核苷酸，包括1.编码位点特异性重组酶的区域，其中所述区域由诱导型启动子调控，以及2. 一个腺病毒包装信号Ψ，其两侧具有序列a)编码的重组酶的特异性识别序列， 其中所述识别序列被定向，以使存在所述重组酶时，切除包装信号Ψ，(b)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒载体，和(c)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒颗粒以使所述多核苷酸、所述腺病毒载体或所述腺病毒颗粒的基因组进入该细胞中，(iii)将该细胞维持在适当的条件下，用于两种病毒基因组编码的蛋白质的表达， 两种腺病毒基因组的复制和步骤(ii)中使用的多核苷酸、载体或腺病毒编码的重组酶的 表达。(iv)从细胞培养基中重新获得高容量腺病毒。附图简述

图1示出了自失活辅助性腺病毒的操作方案。图A示出了基于通过包装细胞生产 Cre的传统方法。在强烈的病毒复制条件下，用于切除大量指数增殖的病毒基因组的包装序 列，Cre的表达是不充分的。图B示出了每个自失活辅助性病毒怎样作为Cre基因的载体， 以使Cre的表达能力随着病毒基因组的增加而增加。图2示出了 Cre表达诱导系统的操作方案。组成型启动子(PGK)指导反式激活蛋 白rtTA-M2的表达。在诱导物(强力霉素)存在时，rtTA-M2 二聚化并激活调控Cre重组 酶的表达的诱导型启动子(tetO-pAlb)。PA，加尾序列。
图3示出了蛋白质tTS的操作方案。不存在强力霉素时，tTS与诱导型启动子结 合并抑制Cre表达。当添加强力霉素时，tTS失去与启动子的亲和力，停止抑制Cre表达， 并允许二聚体介导激活反式激活蛋白。图4示出了在293细胞株中tTS的稳定表达。转染表达tTS质粒的293细胞株的 不同克隆的RNA被纯化，并进行RT-PCR检测tTS mRNA的产生。包括cDNA的质粒作为对照 组。MW，大小标记物。图5示出了在诱导型质粒中Cre表达的调控。用标记的质粒转染293细胞株在组 成型CMV启动子调控下pBS185表达Cre ；通过调控Cre表达，palbCre包括诱导型启动子； 在PGK启动子调控下pGKrtTA表达反式激活因子；prtTACre含有在一个或相同质粒中Cre 和反式激活因子的表达框。在A中，所有的细胞都维持在强力霉素存在情况下。在B中，它 们在存在或缺乏强力霉素下进行比较。通过Western印迹检测Cre表达。图6示出了 AdTetCre病毒的图示和其功能。包装信号(Ψ)两侧是相同方向的 LoxP位点。rtTA-M2反式激活因子受小鼠PGK基因的组成型启动子调控，MerCreMer蛋白 受其TetO-palb诱导型启动子调控。存在强力霉素时，rtTA_M2反式激活因子二聚化并与 TetO-palb启动子结合。这激活了 MerCreMer蛋白的表达，存在他莫西芬时，MerCreMer蛋 白是有活性的，识别LoxP位点并消除阻止辅助性病毒衣壳化的包装信号。ITR，末端反向重复。图7示出了 pAdLoxPMerCre和pShutMer质粒重组产生的AdTetCre病毒基因组。 在^3tTs细胞株中，pSiutMer和pAdLoxPMerCre质粒均被I^acI限制性内切酶酶切后共转 染。重组发生在两种质粒的同源区域，感染腺病毒的基因组由MerCreMer完全表达框重建， 包装信号两侧为LoxP位点。图8示出了 AdTetCre病毒中MerCreMer蛋白表达的调控。在存在(系7-9)或缺 乏(系4-6)他莫西芬和强力霉素的处理下，293tTs细胞株被AdTetCre病毒以2病毒/细 胞的MOI感染48小时。293细胞株提取物加载到系2，以验证具有抗体的野生型重组酶的 检测。^3tTs细胞株在系3被pANMerCreMer质粒转染。系1对应于未感染的293细胞株， 作为阴性对照。通过免疫印迹检测Cre和MerCreMer的表达。图9示出了 AdTetCre病毒的生产的调控。^3tTs、293和^3Cre4细胞株被以2 病毒/细胞的MOI的AdTetCre病毒感染48小时，在细胞提取物中量化感染性病毒的产生。 该细胞株先接受M小时的强力霉素(Dox)、他莫西芬(Tam)、两种同时(T/D)的处理或在该 阶段不进行处理(对照)，如图所示。在感染期间仍保持处理。图10示出了与标准辅助性腺病毒相比，AdTetCre病毒的生产的调控。293tTs,293 和293Cre4细胞株被以2病毒/细胞的MOI的AdTetCre或AdLC8cluc病毒感染。该细胞 株先接受M小时的强力霉素和他莫西芬(T/D)处理或在该时期不进行处理(对照)，如图 所示。在感染期间仍保持处理。在48小时结束时，在细胞提取物中量化感染病毒的产生。图11示出了 AdTetCre和AdLC8cluc病毒的包装信号的切除。(A) 293细胞株被 AdTetCre病毒以2病毒/细胞的MOI感染48小时。该细胞株先接受M小时的强力霉素和 他莫西芬(系4)处理或在该时期不进行处理(系幻，如图所示。在感染期间仍保持处理，感 染期后感染细胞的DNA被提取，且通过PCR扩增与病毒基因组前端相关的区域。以pShutMer 质粒作为PCR产物的模板，该质粒包括基因组(系2)或产生于四3 8细胞株(系1)中的纯化的AdTetCre病毒的相同区域，作为对照。(B) 293Cre4细胞株(系2)被AdLC8cluc病 毒以2病毒/细胞的MOI感染，其DNA在48小时后提取。进行如前一节所述的PCR分析。 产生于293细胞株(系1)中的纯化的AdLCScluc病毒的DNA，作为对照。对应具有完整或 切除包装信号的片段大小分别由黑色或白色箭头指示。图12示出了在HC-Ad生产中AdTetCre病毒的应用。(A) 293Cre4细胞株与包括 HC-Ad KCZ基因组的质粒转染，6小时后它们被AdTetCre辅助性病毒以MOI 1感染。所述 细胞株在48小时后收集(0代)。前一代的裂解物应用于连续的代中与MOI 1的AdTetCre 病毒一起感染更多的^3Cre4细胞株。在60mm板中进行0-3代的培养。在2个150mm板 中进行4代培养，在8个150mm板中进行5代培养，并且在相当于30个的150mm板中进行 6代培养。每代中KCZ和AdTetCre病毒的数量通过免疫细胞化学进行定量。在所有情况 下，细胞株都进行强力霉素和他莫西芬处理。(B) 293细胞株也通过相同的方案产生4代。 (C)293Cre4细胞株通过相同的方案使用AdLCScluc辅助性病毒而不进行强力霉素和他莫 西芬处理。图13示出了 AdTetCre病毒中MerCreMer蛋白的表达动力学。293细胞株接受M 小时强力霉素和他莫西芬的预处理，此后它们被AdTetCre病毒以2病毒/细胞的MOI感染。 在6、12、36和48小时后，收集细胞并通过免疫印迹分析MerCreMer表达。未感染的293细 胞株的提取物为对照系。发明详述本发明已经示出辅助性腺病毒载体能令人惊讶地允许产生具有辅助病毒的低污 染的无肠腺病毒，所述辅助性腺病毒载体中的包装序列两侧为重组酶的目标识别位点，且 其还包括一编码重组酶的序列，其中所述序列与诱导型启动子相关。与任何理论都不相关， 认为在实际辅助性腺病毒中的编码序列允许重组酶表达的增加而平行地增加实际病毒的 复制体，所以总有足够数量的重组酶切除辅助性腺病毒基因组所有复制体的包装序列，并 且总是对由实际病毒引起的细胞蛋白表达的抑制不敏感。图1示出了传统腺病毒包装方法 的比较方案，其中重组酶由细胞表达，在细胞中进行所述包装(左图)或根据本发明的方 法，重组酶由实际辅助病毒的基因组表达(右图)。实验部分描述了一种示例性的实施方式 (见实施例幻，包括本发明特征的腺病毒依赖于培养基中强力霉素的存在表达重组酶。本发明的多核苷酸因此，在第一方面，本发明涉及一种多核苷酸，其包括i)编码位点特异性重组酶的区域，其中所述区域由诱导型启动子调控，以及ii)对于腺病毒基因组的复制和/或包装必不可少的区域，该腺病毒基因组的两 侧为对序列a)编码的重组酶具有特异性的识别序列，其中所述识别序列被定向，以使在所 述重组酶时，切除所述重要区域。根据本发明，位点特异性重组酶应理解为是一种能够促进对于所述酶的靶位点间 进行特异性重组的蛋白质。适合用于本发明的重组酶包括Pl噬菌体(LoxP)的Cre重组酶、 酿酒酵母(Frt)的FLP重组酶、来自链霉菌属Φ031噬菌体(attB，attP)的整合酶、TP901-1 重组酶、R4重组酶或λ整合酶。在一优选实施例中，由本发明的多核苷酸编码的重组酶是 Cre 重组酶，其包括最初由 Abreinski 和 Hoess (J. Biol. Chem. 1984,259 :1509-1514)描述 的Pl噬菌体的Cre重组酶和包括重组酶序列和一调控重组酶活性的第二多肽的融合蛋白。该Cre重组酶，无论是作为自身使用时，还是作为融合蛋白的形式使用，都可以被改性以使 其对于靶序列有更广泛的特异性，如W02000060091中所描述的那样。如果本发明的核苷酸包括一编码融合蛋白的序列，所述融合蛋白包括一重组酶， 将多肽用作激活核定位序列是可能的，也就是，它们只在特定配体存在时发挥作用。因此， 可自由地调节重组酶活性，以使其在只在所述配体存在时位移到细胞核并发挥活性。在一 优选实施例中，可激活核定位序列来自核受体。适合用于本发明的核定位序列包括以下定 位序列，它们来自于PPAR(过氧化物酶体增殖因子激活受体)，其在15-脱氧-[δ ]-前列腺 素J2存在时位移到细胞核；维甲酸受体，其在存在9-顺式维甲酸的α，β或Y异构体时 位移到细胞核；由维甲酸和TTNPB激活的法尼醇X受体；由24-羟基胆固醇激活的肝X受 体；由4-氨基丁基苯甲酸激活的苯甲酸X受体；由16-氰基孕烯醇酮诱导的组成型雄烷受 体，孕烷受体；由利福平诱导的类固醇和异型生物质受体；由甲羟基孕酮、米非司酮致效剂 和拮抗剂、19-炔诺酮衍生物诱导的黄体酮受体；由糖皮质激素激活的糖皮质激素受体；由 Τ3和/或Τ4激活的甲状腺激素受体；由雌激素和其衍生物如17 β -雌二醇和雌二醇激活 的雌激素受体。可替代地，也可以使用通过与其他蛋白结合而失活的融合蛋白，且在配体存 在时，其与所述其他蛋白分离，从而导致融合蛋白的诱导活化。可激活核定位序列优选地对应于雌激素受体的配体结合域，如W002^175中所 述。在本发明的上下文中，“配体结合域”可理解为雌激素受体的雌激素结合域序列，而且 优选其变体包括一个或几个由一个或几个氨基酸的插入、删除和/或替换所引起的基因突 变，但是在特定配体存在时，其仍能够大体上完整地位移到细胞核，尽管变体的优选配体可 以根据野生型受体的配体变化。因此，本发明主要考虑优选对应于雌激素受体(雌二醇、雌 素三醇或雌素酮)天然配体或不同致效剂和拮抗剂的核定位序列的应用，如他莫昔芬、ICI 164384、RU 54876,己烯雌酚、雷洛昔芬、珠氯米芬和托瑞米芬。重组酶和核定位序列可在与融合蛋白其他组分有关的任何相关位置被发现。因 此，本发明主要考虑编码融合蛋白的多核苷酸，其中核定位序列的C-末端区域与重组酶的 N-末端区域相连接，编码融合蛋白的多核苷酸，其中重组酶的C-末端区域与核定位序列的 N-末端区域相连接，而且优选地编码融合蛋白的多核苷酸序列由重组酶构成，所述重组酶 两侧具有相同的或不同的核定位序列，然而它们优选是相同的。另外，本发明还主要考虑核 定位序列变体的应用，其示出了与野生型受体的核定位序列不同配体的亲和力。因此，本发 明主要考虑包括G512R突变(根据人类雌激素受体编号)的雌激素受体的配体结合域的序 列的应用。该突变引起配体结合域对天然配体的亲和力，其比野生型受体的配体结合域所 示出的少1000倍，但是不影响其对4-羟基他莫昔芬的亲和力。因此，可以通过使用4-羟 基他莫昔芬促进具有重组酶活性蛋白的融合蛋白的位移，而不影响包装细胞对雌激素的可 能响应。可替代地，雌激素受体的配体结合域可包括G400V/MM3A/LM4A突变，其产生一个 比细胞核转运敏感10倍的配体结合域，且使用4倍低于激活G512R突变细胞核转运所必需 的的剂量激活。所述配体结合域可替代地包括M543和L544A突变，其产生一与他莫昔芬和 4-羟基他莫昔芬的敏感度10倍高于G400V/MM3A/LM4A突变所示的分子。在一优选实施 例中，可激活核定位序列为人类雌激素受体(Metger等，1995，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92 :6991-6995)或 G521R变体(Feil 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93 :10887-10890) 的配体结合域。在另一优选实施例中，重组酶包括由雌激素激活的核定位序列的G525R变体，所述雌激素来源于小鼠雌激素受体(所述受体的氨基酸观1_599)在所述蛋白的末端， 诸如，例如 Verrou 等(Biol. Chem.，1999，380 :1435-1438)和 Louet M.等 Ofepatology, 2002 ；35 ；1072-1081)详细描述的MerCreMer蛋白，其内容通过参考引入本文中。本发明的多核苷酸包括一编码重组酶的序列，且其被一诱导型启动子调控。在本 发明的上下文中，诱导型启动子理解为存在一化合物或特定条件时，能够促进位于3’端的 多核苷酸转录的任何DNA序列。优选地，在本发明的上下文中使用的诱导型启动子是响 应于诱导剂的，在缺乏诱导剂时表现为不表达或不重要的基础表达，且该诱导型启动子能 够促进位于3’端的基因的活化。根据诱导剂的类型，诱导型启动子被分为四环素(Tet) 开 / 关启动子(Gossen, M. and H. Bujard(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :5547-5551 ； Gossen，M.et al.，1995，Science 268 :1766-1769 ；Rossi,F. Μ. V.和 H. M. Blau，1998，Curr. Opin.Biotechnol. 9 :451-456) ；Pip 开 / 关启动子(US 6, 287,813)；抗孕酮依赖型启动 子(US 2004132086)；蜕皮素依赖型启动子(Christopherson 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :6314-6318 ；No 等，1996，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 :3346-3351, Suhr 等， 1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,95 :7999-8004 和 W09738117)；金属硫蛋白依赖型启动子 (W08604920)和雷帕霉素依赖型启动子(Rivera 等，1996，Nat. Med. 2 :1028-32)。在一优选实施例中，诱导型启动子是一四环素依赖型系统。该系统允许通过四环 素或其衍生物例如强力霉素调节的方式达到高表达水平。在该系统中，存在强力霉素时基 因表达被激活，缺乏强力霉素时基因不表达。该系统基于两个发生在大肠杆菌四环素抗性 操纵子的调节元件，具体地，与四环素阻遏物结合的四环素调节序列。目的基因在关于包括 几个四环素敏感元件的启动子的3’端被克隆。第二质粒包括编码调节元件的序列，其被称 作为四环素-调控反式作用因子，该反式作用因子由单纯疱疹病毒的VP16转录因子和野生 型四环素阻遏物(rtTA-M2，Zabala等描述，Cancer Res. ,64 :2799-2804)组成。因此，存在 强力霉素时，四环素阻遏物和VP16与诱导型启动子相互作用促进位于启动子3’端的基因 转录，形成融合蛋白。优选地几个四环素操纵子(TetO)的复制体融合成最小启动子形成所 述诱导型启动子，例如CMV最小启动子，人类乙型肝炎病毒中心蛋白的四个碱基对的启动 子，或196或84碱基对小鼠白蛋白基因的5’区域的启动子，或白蛋白启动子(Zabala等， 2004,supra)。本领域技术人员应该理解的是四环素应答的反式作用因子能被用于包装的细胞 基因组编码，被实际的多核苷酸编码，该多核苷酸包括在对四环素敏感的启动子调控下编 码重组酶的序列，或在一优选实施例中，两者均可编码。反式作用因子产生的量依赖于细 胞中腺病毒基因组复制体的数量，其反过来使反式作用因子的量适应细胞中存在的启动子 的量。编码反式作用因子的序列由一组成型启动子调控。组成型启动子适合于调控配体 依赖型反式作用因子，其中它们是巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶 (DHFR)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、延伸因子Ia(EFla)启动子、白蛋白启动 子、载脂蛋白Al(ApoAl)启动子、角蛋白启动子、CD3启动子、免疫球蛋白重链或轻链启动 子、神经丝启动子、神经元特异性烯醇化酶启动子、L7启动子、CD2启动子、肌球蛋白轻链激 酶启动子、HOX基因启动子、胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子、RNA聚合酶II启动子、MyoD基 因启动子、磷酸甘油激酶(PGK)基因启动子、低密度脂蛋白(LDL)启动子、肌动蛋白基因启 动子。在一优选实施例中，调控反式作用因子表达的启动子是PGK基因启动子。
本发明的多核苷酸还包括一腺病毒复制和/或包装的重要区域，其两侧具有所述 多核苷酸编码的重组酶的靶位点。对于所述基因组的复制和/或包装重要的腺病毒基因组 区域包括末端反向重复序列(ITR)和腺病毒包装信号Ψ。根据本发明，末端反向重复序列或ITR应被理解为大约100碱基对的序列，其在腺 病毒线性基因组的两侧且对于腺病毒基因组的复制很重要(Stow，N. D. ,1982, Nucl. Acid. Res, 10 :5105-5109)。根据本发明，腺病毒包装信号Ψ应被理解为大约160碱基对长的序列，在2和5 血清型腺病毒的情况下，其在基因组的190到350之间的位置延伸。腺病毒基因组序列的 切除阻止在病毒增殖过程中产生的DNA分子有效地整合到新形成的衣壳(Hearing，P.等， 1987，J.Virol. ,61 :2555-2558)，但是不能阻止包装细胞中所述基因组的复制，与ITRs的 切除不同。在一优选实施例中，形成本发明多核苷酸部分的腺病毒基因组序列是腺病毒包装 信号。显而易见地，两侧为腺病毒包装信号的相应的靶位点必须基于本发明多核苷酸编码 的重组酶进行选择。因此，如果多核苷酸编码的重组酶为Cre重组酶，包装序列的两侧必须 为LoxP位点。如果多核苷酸编码的重组酶为FLP重组酶，包装序列的两侧必须为FLP位点。 在一优选实施例中，本发明多核苷酸编码的重组酶为Cre重组酶，且包装信号Ψ两侧为同 向的所述重组酶的靶位点(LoxP位点)，以切除两位点之间的序列。LoxP位点由34个碱基对的序列构成，该34个碱基对由8个碱基对的中心区域和 其两侧的两个13个碱基对的反向重复序列依次构成。本发明还主要考虑了野生型LoxP 序列变体的应用，其不能与LoxP序列进行重组，但是其只能与相同的LoxP变体重组，如 W0199925851和W02007085906所述。当将被用作腺病毒包装的细胞包括其基因组中两侧 为野生型LoxP序列的区域时，变体LoxP序列尤其重要。本发明使用的变体LoxP序列包括 IoxP、1οχΡ2、1οχΡ511、1οχΡ514、loxB、loxC2、loxL、loxR、1οχΑ86、1οχΑ117、loxP3 和 1οχΡ23 序列。本发明的辅助性腺病毒载体前面所述本发明的多核苷酸能构成表达载体的部分或用于构建表达载体，该表达 载体包括其作为腺病毒载体发挥作用时必要的序列。因此，本发明的另一方面涉及一包括 本发明多核苷酸的表达载体。在一优选实施例中，包括本发明多核苷酸的载体是一辅助性 腺病毒载体。在本发明的上下文中，“辅助性载体”应被理解为能够部分或完全与重组病毒载体 反式互补的载体，该重组病毒载体不能被复制。因此，它是一迟早能够产生至少一个多肽的 载体，该多肽不能由重组载体产生但对病毒颗粒的形成是必要的。辅助性载体与腺病毒载 体完全互补，也就是说，辅助性载体能够提供腺病毒载体缺少的对腺病毒复制必不可少的 所有组分，或辅助性载体只能与腺病毒载体部分互补，也就是说，其只能补充腺病毒载体缺 少的部分功能。本领域技术人员应理解的是辅助性腺病毒载体的序列依赖于所应用的腺病毒载 体，考虑到依赖于腺病毒载体中缺少的腺病毒基因组的编码序列的数量，辅助性载体必须 包括更高或更低数量的序列以允许所述腺病毒载体的复制和包装。如果腺病毒载体是一无 肠载体(也被认为是高容量腺病毒载体或辅助病毒依赖型载体)，本发明的辅助性载体必须包括几乎所有的早期和晚期腺病毒转录区域，不包括对体外病毒复制不是必须的早期的 E3区域和可有包装细胞提供的El区域。在一优选实施例中，本发明的辅助性载体包括第一 代腺病毒载体的基因组，其特征在于，缺少El和E3蛋白的编码序列，其中插入编码重组酶 的基因取代了 El蛋白的编码区域。因此，本发明的辅助性腺病毒载体包括下述组分-5’末端反向重复序列，-两侧为重组酶识别靶位点的包装信号Ψ，-由诱导型启动子调控的重组酶序列，-除了El和Ε3区域的腺病毒编码序列，-3’末端反向重复序列.在一优选实施例中，辅助性腺病毒的基因组编码一反式作用因子，其能够在配体 存在时促进重组酶的表达。在一更优选实施例中，反式作用因子为rtTA-M2反式作用因子， 由与单纯疱疹病毒的VP16蛋白相结合的四环素阻遏物构成，在该情况下存在四环素类似 物，优选为强力霉素时，进行所述方法的步骤(iii)。图2提供了本发明腺病毒载体的图示，其包括在PGK基因启动子的调控下编码转 录反式作用因子的序列，且其中重组酶受一启动子调控，该启动子由几个四环素重复序列 和白蛋白基因最小启动子相结合组成。优选地包装信号Ψ两侧为LoxP位点。在一更优选实施例中，重组酶为Cre重组 酶或MerCreMer重组酶，其受一启动子调控，该启动子由一系列TetO操纵子重复序列和例 如白蛋白启动子的小启动子构成。还可能使用两侧为重组酶靶位点的衰减包装序列。这些 信号显示了被衣壳化的较低能力，且可如W094^152所述，通过去除包装区域而获得。对于位于所述腺病毒基因组的另一重要区域的额外的重组酶识别靶位点，例如 ITR区域，还可能通过使用一对重组酶识别靶位点增加辅助性载体的安全性，以使重组酶的 存在引起对于腺病毒的复制或衣壳化必需的多个腺病毒基因组区域的切除。本领域技术人员应该理解的是辅助性载体是一可复制病毒，也就是，它具有所有 对其复制和包装重要的基因，或者它是缺失一个或几个基因的缺陷型腺病毒，可阻止周围 环境中腺病毒载体的可能增殖。考虑到这些蛋白质对腺病毒的增殖很重要，它们必须以反 式提供，优选地通过用于包装的细胞提供。适合此目的的细胞系为来自于人类胚胎肾细胞 的293细胞系(Graham等，1977，J. Gene. Virol. 36，59-72)，考虑到它在其基因组中包括 5型腺病毒的5’末端其能补充El功能，能补充腺病毒El和/或E4功能的W162细胞系 (Weinberg 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983,80 :5383-5386)，能补充 5 型腺病毒全部基 因组或El和E4功能的细胞系(W09^8152)，N52系，Perc系及其类似物。本发明的辅助性腺病毒载体可被视为包括所有前述功能的多核苷酸，或可替代 地，如果多核苷酸已通过在允许细胞中的转染生成或扩增，它将引起整个腺病毒颗粒的生 成，该腺病毒颗粒能从包装细胞中重新获得，且代替多核苷酸作为辅助性载体。因此，在 另一方面，本发明涉及一包括本发明多核苷酸序列的腺病毒颗粒。在本发明的上下文中， 腺病毒颗粒应被理解为一由构成腺病毒基因组的双链DNA分子构成的颗粒，如已经被描 述的那样，例如，Shenk, T. (Adenoviridae :The viruses and their replication，1996， In Fields Virology. B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley, eds. (Lippincott-Raven， Philadelphia，PA)pp. 2111-2147)。
^mnmm十牛白_■诚本发明辅助性载体可通过在允许的真核细胞(permissive eukaryotic cells)中 的连续复制循环进行扩增。因此，在另一方面，本发明涉及一腺病毒重组体的复制和包装的 系统，其包括a) 一种本发明的多核苷酸，一个本发明的表达载体或一个本发明的腺病毒颗粒， 以及b) 一个真核细胞。本领域技术人员应该理解的是真核细胞中腺病毒的复制需要本发明多核苷酸编 码的重组酶不能表达，鉴于如果重组酶表达，它将引起腺病毒基因组区域的切除，该区域两 侧为所述重组酶的靶位点，其将阻止新的辅助病毒的增殖。如果编码重组酶的序列受四环 素操纵子的调控，后者具有较低的基础表达水平。然而，如果进行辅助性腺病毒增殖的细胞 表达四环素-依赖型阻遏物，则该基础表达将被进一步降低，其中四环素-依赖型阻遏物能 够在缺乏强力霉素时阻止四环素操纵子3’末端基因的转录。因此，在一优选实施例中，根 据本发明形成用于腺病毒复制系统的组分(b)的细胞包括调控位点特异性重组酶表达的 启动子特异性转录阻遏物。在一优选实施例中，如果调控重组酶表达的启动子是由四环素 或其类似物(强力霉素)激活的启动子，那么表达包装细胞的阻遏物是在缺乏所述配体时 被激活的阻遏物。因此，在一优选实施例中，本发明的包装细胞包含一表达四环素-依赖型 阻遏物的多核苷酸，在缺乏四环素或强力霉素时，其与Tet操纵子结合，阻遏转录。Tet操纵 子特异性阻遏物优选为rtTS阻遏物。在一更优选实施例中，rtTS阻遏物由组成型启动子 操控。调控rtTS表达的启动子优选为真核延伸因子EFla启动子。图3的左图示出了缺乏强力霉素时编码重组酶的基因表达的抑制机制。另外，如果重组酶包括可激活核定位序列，辅助性腺病毒的增殖一定在缺乏能激 活所述核定位序列的配体时发生，这样，即使由于所述基因的基础转录而存在最低数量的 重组酶，其仍然在细胞质中且不能对腺病毒基因组发挥其重组酶活性。本发明的辅助性载体和其包装系统可用于扩增所述载体。因此，在另一方面，本发 明涉及一种获得辅助性重组腺病毒的方法(下文中本发明的第一种方法)，其包括(i)在适合的条件下使细胞与本发明的一种多核苷酸、一个表达载体或一个腺病 毒颗粒及可选择地一个或多个编码对于细胞中腺病毒包装或复制必要的腺病毒蛋白质的 多核苷酸接触，以使腺病毒基因组或包括所述基因组的多核苷酸进入细胞，(ii)将该细胞维持在适当的条件下，允许细胞中腺病毒的包装和复制，并阻止位 点特异性重组酶的表达，和(iii)从培养基中重新获得腺病毒。本发明第一种方法的步骤(i)包括将所述腺病毒的基因组引入到细胞中。本领域 技术人员应该理解的是步骤(i)的不同实施依赖于所述腺病毒基因组的不同形式。如果所 述基因组是一多核苷酸，步骤(i)包括将所述多核苷酸在允许其进入细胞的条件下与细胞 接触。可通过包括多核苷酸的组分的微注射进行转染，或可替代地，在磷酸钙或氯化钙存在 的条件下通过共沉淀进行转染，通过由DEAE葡聚糖介导的转染，脂质转染，电穿孔法及基 于前述技术的一系列商用的转染试剂盒。转染效率取决于一系列因素，包括细胞类型、代 数、融合状态及转染条件(时间、脂质体或沉淀物的制备形式等)。所有这些参数可通过常规实验确定和调整。如果腺病毒载体是根据本发明的腺病毒颗粒，将腺病毒与细胞接触已足以使腺病 毒自然地感染细胞。优选地在许多的病毒颗粒/细胞比率(感染复数或Μ0Ι)下将病毒与 细胞接触，该比率至少约为1、2、10、20、30、50、100、200、2000或其他合适的MOI值，以使培 养基中所有细胞都基本上被感染。如果辅助性腺病毒载体缺少任何编码对于其复制和/或包装重要的组分的序列， 则有必要提供反式的所述组分。优选地，该组分由多核苷酸的表达提供，多核苷酸构成用 作包装的细胞的基因组的部分。因此，在腺病毒载体的基因组缺少El和/或E4区域时， 本发明方法的步骤(i)中使用的细胞是，属于四3的细胞系(Graham等，1977，J. Gene. Virol. 36,59-72)和 W162 细胞系(Weinberg 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA，1983，80 5383-5386)，及前述的W09^8152所述的细胞系。在步骤(ii)中，本发明的第一种方法考虑到了将已包含步骤(i)中腺病毒基因组 的细胞保持在合适的条件下，以允许细胞中腺病毒的包装和复制，并阻止位点特异性重组 酶的表达。考虑到重组酶由诱导型启动子的操控，在理想条件下所述启动子不能激活转录， 除非存在激活剂。然而，所有诱导型启动子都有一定的基础活性，在存在辅助性载体时，其 能引起重要序列的切除(优选包装序列Ψ)，从而使腺病毒基因组不能被衣壳化，降低该过 程的产量。因此，在一优选实施例中，衣壳化过程在表达转录阻遏物的细胞中进行，该阻遏 物与调控重组酶表达的结合位点相结合，基于后者阻遏转录。所述转录阻遏物在缺乏激活 所述转录启动子的配体时优选为有活性的。在特定情况下，启动子被rtTA四环素-依赖型 激活物激活，在缺乏强力霉素时转录阻遏物与四环素操纵子特异性结合，从而阻断重组酶 基因的表达。步骤(ii)在必要时进行以使病毒颗粒的浓度足够高，其由标准方法确定，如 Shabram 等(Hum. Gene Ther. 1997,8 :453-465)所述的基于 HPLC 的 Resource Q 方法，或间 接地由对细胞中细胞病理效应的目测确定。细胞培养可选择地包括新鲜培养基的添加。在第三步骤中，步骤(ii)过程中产生的腺病毒从细胞培养物中重新获得。为此， 有必要通过任何本领域技术人员已知的方法(胰酶消化或机械刮，及离心或过滤)将细胞 从培养基中分离，使细胞在惰性溶液中破裂(冷冻/解冻循环，均化作用，超声降解，空化作 用，洗涤剂等的使用)，及通过已知方法纯化腺病毒颗粒，如氯化铯梯度超速离心法，或通过 不同类型的色谱法，如离子交换色谱和金属螯合物亲和色谱的组合(Huyghe等，1996,Human Gene Therapy, 6 :1403-1416)，离子交换色谱和凝胶分层色谱的组合(W007059473)，二乙基 氨基乙基(DEAE)纤维素色谱(Haruna等，1961，Virology 13，264-267)，羟基磷灰石色谱 (US2002/0064860)，及在其它树脂中的色谱，如软凝胶(琼脂糖)，基于合成聚合物的大孔 聚合物，包括许可色谱(permission chromatography) (fractogel)和基于硬胶囊中软凝胶 的材料(例如，Ceramica HyperD F) (Rodrigues, 1997, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl 699 :47-61)。在另一方面，本发明考虑了根据本发明第一种方法获得的辅助性腺病毒。目的基因的腺病毒的系统禾Π方法本发明的辅助性腺病毒客体可用于包括目的基因的高容量腺病毒复制和包装的 系统和过程。因此，本发明的一方面涉及本发明多核苷酸或本发明载体或根据本发明的腺病毒颗粒在高容量腺病毒生产和包装中的应用。在另一方面，本发明涉及生产高容量重组腺病毒的系统，其包括(a)本发明的一个多核苷酸，根据本发明的一个表达载体或根据本发明的一个腺 病毒颗粒；(b) 一个腺病毒，其基因组包括目的基因，且该腺病毒缺少编码至少一个对于复制 重要的蛋白或至少一个对于所述腺病毒包装重要的蛋白的序列或包括所述腺病毒基因组 的多核苷酸，以及(C) 一个真核细胞。在所述系统中，辅助性腺病毒的扩增系统中实质上描述的第一组分包括一多核苷 酸，其包括至少部分辅助性腺病毒基因组，能为高容量腺病毒的复制和包装完全或部分地 提供必要组分。第二组分包括高容量腺病毒或包括所述病毒基因组的多核苷酸，其中所述基因组 缺少编码至少一个对于所述腺病毒的复制重要的蛋白或至少一个对于所述腺病毒的包装 重要的蛋白的序列，且使用本发明系统进行扩增。根据本发明，“高容量腺病毒”应被理解 为被称为辅助病毒依赖型腺病毒或无肠腺病毒的重组腺病毒类型，其特征在于，除了 5'和 3' ITR区域及包装区域Ψ腺病毒基因组的所有基因都被切除，例如，如Alb等所述(Gene Therapy, 2005,12 :S18_S27)。鉴于缺乏腺病毒基因组的特征序列，这些腺病毒允许高达 36kD的异源序列。根据本发明的方法外源基因可整合到无肠载体，所述外源基因包括编码促红细胞 生成素(EPO)、瘦素、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、生长激素释放激素(GHRH)、促性腺 激素释放激素(&iRH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、催乳素释放激素(PRH)、褪黑激素释 放激素(MRH)、催乳素抑制激素(PIH)、生长激素抑制素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激 素或(GH)、促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH或促甲状腺腺素)、 泌乳刺激素、催产素、抗利尿激素(ADH或加压素)、褪黑激素、MUllerian抑制因子、降钙素、 甲状旁腺素、胃泌激素、缩胆囊素(CCK)、分泌素、I型胰岛素样生长因子(IGF-I)、11型胰岛 素样生长因子(IGF-II)、心房利钠肽(ANP)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、胰岛素、胰高血糖 素、生长激素抑制素、胰多肽(PP)、瘦素、神经肽Y、肾素、血管紧缩素I、血管紧缩素II、因子 VIII、因子IX、组织因子、因子VII、因子X、凝血酵素、因子V、因子XI、因子XIII、白细胞间 介素1 (IL-I)、白细胞间介素2 (IL-2)、肿瘤坏死因子-α (TNF- α )、白细胞间介素6 (IL_6)、 白细胞间介素8 (IL-8和趋化因子)、白细胞间介素12 (IL-12)、白细胞间介素16 (IL-16)、白 细胞间介素 15(IL-15)、白细胞间介素 24(IL-24)、干扰素-α、β、γ、CD3、ICAM-1、LFA-1、 LFA-3、包括RANTES 1 α、MIP-I α、MIP-I β的趋化因子、神经生长因子(NGF)、血小板衍生 生长因子(PDGF)、转化生长因子-β (TGF-beta)、骨形态发生蛋白(BMPs)、成纤维细胞生长 因子(FGF和GF)、表皮生长因子(EGF和类似物)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落 刺激因子(G-CSF)、胶质细胞生长因子、角质细胞生长因子、血管内皮生长因子、α -抗胰 蛋白酶、肿瘤坏死因子、粒细胞和噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、心肌营养素I(CT-I)、制 瘤素M(OSM)、双调蛋白(AR)、环孢霉素、纤维蛋白原、乳铁传递蛋白、组织型纤溶酶原激活 物(tPA)、糜蛋白酶、免疫球蛋白、水蛭素、超氧化物歧化酶、伊米苷酶、β-葡糖脑苷脂酶、 α-L-糖苷酶-α、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸酯-2-硫酸酯酶、加硫酶、人α -半乳糖苷酶Α、α-1蛋白酶抑制因子、乳糖酶、胰腺酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)、腺甙脱氨酶、 免疫球蛋白、白蛋白、A型和B型肉毒杆菌素、胶原酶、人类脱氧核糖核酸酶I、透明质酸酶、 L-天门冬酰胺酶、重组水蛭素、溶栓酶、β细胞转化因子(TGF-β)抑制剂多肽的基因，如 W00331155、W0200519244和W00393^3中所述，其内容在这里通过参考文献引入，对干扰 RNA分子转录合适的表达框(shRNA、siRNA、miRNA、改性Ul核蛋白RNA)。除了所述外源基因，用于本发明的无肠腺病毒可包括填充区域，如Parks等所述 来源于λ噬菌体基因组的填充序列(J.Virol.，1999，73 :8027-8034)，或Sandig等所述出 现在 PSTK120 的填充 DNA(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 :1002-7)。如 Parks 等所描述，这 些区域通常包含存在于人类基因组的序列，且能够提高关于控制腺病毒外源基因的表达， 控制腺病毒代替所述人类填充DNA，其包括λ噬菌体的221Λ片段(J.Virol.，1999，73: 8027-8034)。人类填充DNA的总长度是可变化的，但其在20-301Λ范围内，优选为20-251Λ，或 更优选为21-231Λ，例如，221Λ。所述填充DNA中顺式作用序列的数量可在2、3、4或更多中 变化，且包括无限制的16. 2kb白斑样的重复区域(Smith J G等，1995，Mol. Cell. Biol.， 15 =5165-72)；基质附着区域(MAR)，例如包含了 6型腺病毒6左端或2个免疫球蛋白κ基 质附着区域的4. 2kb的片段(Betz A G等，1994，Cell, 77 =239-248)；肝细胞控制区域，如 包括所述HCR的1. 2kb片段(如Miao等所述，Molecular Therapy, 1 :522-32)；或其他基 质附着区域，如鸡溶菌酶的2. 8kb区域(如Phi-Van L等所述，1990，Mol. Cell. Biol. 10 2302-2307)，干扰素β的5'区域的基质附着区域(如Bode J等所述，1992，kience，10 195-197)，或其他非编码的人类序列，如端粒序列或着丝粒序列。最后，根据本发明用于产生高容量重组腺病毒的系统还包括一个真核细胞，所述 腺病毒的扩增过程在该细胞中进行。适合用于所述系统的真核细胞包括能被腺病毒自发地 感染的所有细胞系(如果腺病毒构成系统的组分(a)和(b))，或那些易于被包含高容量腺 病毒和辅助性腺病毒基因组的多核苷酸转染的细胞系。另外，如果辅助性腺病毒的基因组 不包括编码能够激活重组酶表达的反式作用因子的序列，构成组分(c)的细胞必须表达所 述反式作用因子，优选地在一稳定的方式下且优选地受组成型启动子的调控。这有利于加 速包含于辅助性腺病毒中的重组酶的表达动力学，从而促进其包装序列的切除。在一优选 实施例中，有可能使用细胞表达重组酶，其靶位点位于辅助性腺病毒基因组重要区域的两 侧，因此，除了由实际的辅助性腺病毒产生的重组酶，还有由实际的细胞产生的重组酶，以 使在辅助性腺病毒所有复制基因组的去除中获得更高的效率。本发明优选地考虑了以稳定 方式表达Cre重组酶的新建细胞系如293Cre系的应用(Parks等，supra.)。表达细胞的重 组酶可受组成型启动子的调控或受诱导型启动子的调控，其可以与用于调控由辅助性腺病 毒编码的重组酶表达的启动子相同或不同。用于调控被细胞编码的重组酶表达的组成型和 诱导型启动子与上面提到的那些相同。另一方面，本发明涉及一种用于生产表达目的基因的高容量辅助腺病毒载体的方 法(下文中的本发明的第二种方法)，其包括以下步骤(i)在适合条件下将一个细胞与一个腺病毒或一个包括所述腺病毒基因组的多核 苷酸接触，所述腺病毒基因组包括目的基因，且缺少编码至少一个对所述腺病毒复制或包 装重要的蛋白的序列，以使所述腺病毒基因组或包含所述基因组的多核苷酸进入该细胞，
(ii)在适合条件下将所述细胞与选自下组中的第二组分接触，(a) 一种多核苷酸，包括1.编码位点特异性重组酶的区域，其中所述区域由诱导型启动子调控，以及2. 一个腺病毒包装信号Ψ，其两侧为序列a)编码的重组酶的特异性识别序列，其 中所述识别序列被定向，以使存在所述重组酶时，切除包装信号Ψ，(b)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒载体，和(c)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒颗粒以使所述多核苷酸、所述腺病毒载体或所述腺病毒颗粒的基因组进入该细胞中，(iii)将该细胞维持在适当的条件下，用于两种病毒基因组编码的蛋白质的表达， 两种腺病毒基因组的复制和步骤(ii)中使用的多核苷酸、载体或腺病毒编码的重组酶的 表达。(iv)从细胞培养中重新获得高容量腺病毒。本发明的第二种方法的步骤(i)与本发明的第一种方法的第一个步骤类似，因为 其包括将一个细胞与腺病毒基因组接触的环节，其中所述腺病毒基因组可以是裸多聚腺苷 酸的形式或者构成腺病毒颗粒的部分。在第一种情况下，该方法的步骤(i)包括使用已知 的方法使得多腺苷酸如前所述进入细胞内部。在第二种情况下，将腺病毒颗粒与细胞接触 已经足够，如果该表达的表面分子作为腺病毒受体起作用，则后者将自发地将其基因组融 入到细胞中。在一优选实施例中，用于步骤(i)的腺病毒为高容量腺病毒或无肠腺病毒。本发明第二种方法的步骤(ii)可以与步骤(i)同时进行，或在步骤(i)之前或之 后进行，尽管其应该在步骤(i)之后进行以阻止腺病毒的结构和调控蛋白表达引起的细胞 病变作用阻止包括目的基因的腺病毒的基因组的有效复制。如果所述基因组是裸多腺苷 酸，那么辅助性腺病毒基因组进入细胞可以采取已知的转染技术，如果所述基因组以腺病 毒颗粒的形式提供，那么可以采取自然感染路线使辅助性腺病毒的基因组进入细胞。本发明第二种方法的步骤(iii)包括将细胞保持在合适的条件下，以允许通过由 辅助性腺病毒的基因组编码的结构蛋白的细胞转录/翻译机制进行表达，其中辅助性腺病 毒在步骤(ii)中引入，并且以允许包括目的基因的腺病毒的基因组进行复制。在该步骤 中，保证由辅助性腺病毒编码的重组酶在细胞中的表达与活性很重要，以使所述基因组中 对于其复制和/或壳体化重要的区域切除，形成的包括辅助腺病毒基因组的腺病毒颗粒最 大程度的减少。在一优选实施例中，步骤(iii)在存在一调控位点特异性重组酶表达的启 动子的特定反式作用因子诱导物时进行。所述反式作用因子可由实际的细胞提供，其中如 果编码其的多核苷酸以稳定的方式整合到所述细胞中的基因组中或，可代替地，在一优选 实施例中，其是编码所述反式作用因子的辅助性腺病毒的实际的基因组，则开始进行包装。 在一更优选的实施例中，反式作用因子由辅助性腺病毒和包装细胞的基因组进行表达。在 一更优选的实施例中，所述反式作用因子要求存在一配体，以实施其反式激活的活性，在这 种情况下，本方法的步骤(iii)在存在所述配体的情况下进行，以确保重组酶最大化表达。 在一更优选的实施例中，反式作用因子为rtTA-M2反式作用因子，其由与单纯疱疹病毒的 VP16蛋白结合的四环素阻遏物形成，在这种情况下，本发明的步骤(iii)在存在四环素类 色物时进行，优选为强力霉素。图3中的右图示出了在强力霉素存在时，重组酶的表达和活化机制。
如前所述，任何重组酶基本上适用于在辅助病毒中切除包装信号，所述包装信号 两侧为适当方向的所述重组酶的目标位点，其导致包含在两个信号之间的序列的切除。在 一优选实施例中，由辅助性腺病毒编码的重组酶是Cre重组酶或者包括所述重组酶的融合 蛋白。当重组酶不用于目的腺病毒的包装过程中时，另一个确保重组酶失活的方式是使用 重组酶，该重组酶移位到核内，是依赖于可外源性添加的配体的存在，在缺乏特异性配体 时，该重组酶与阻止其发挥功能的细胞蛋白结合。因此，在本发明的优选实施例中，考虑使 用由Cre重组酶和至少一个雌激素蛋白受体的配体结合区域形成的融合蛋白。融合蛋白的 这些类型默认地位于细胞质中，并与特定的细胞蛋白结合，因此他们不能发挥其重组酶的 功能。然而，存在雌激素或衍生物(例如他莫西芬)时，融合蛋白从所结合的所述细胞蛋白 中释放，并移动到核内行使其重组酶功能。在一更优选的实施例中，由重组腺病毒编码的重 组酶是MerCreMer重组酶，其由Cre重组酶和一在氮端和碳端的突变的雌激素蛋白受体配 体结合区域形成。图6图解地示出了在强力霉素和他莫西芬存在时，重组酶的表达和活化机制。本发明第二种方法的步骤(iv)包括在步骤(iii)中形成的无肠腺病毒的纯化，其 实质上采用了与本发明第一种方法的步骤(iii)中纯化辅助性腺病毒相同的方法，其细节 如上所述。本领域技术人员将理解的是，根据本发明的第二种方法纯化的包含目的基因的腺 病毒可以通过将所述腺病毒再次与细胞接触用于连续几轮的增殖，然后将所述细胞与通过 本发明第一种方法获得的另一剂量的辅助性腺病毒接触。从而本发明的这个过程可以连续 重复几次，以使在每个循环中获得更多数量的腺病毒颗粒。以下将基于所提供的具体实施例以说明性和非限制性的方式对本发明的范围进 行说明。
具体实施例实施例1AdTetCre病毒的构建.诱导型MerCreMer表达框的构建诱导系统由两个独立的转录单元组成。其中之一在一个诱导型启动子的调控下 编码重组酶，并且另一个在组成型启动子(小鼠PGK基因的启动子)的调控下编码反式作 用因子。为了获得第一单元，用前述PO7Pal-Iuc质粒(Zabala等，2004，Cancer Res. 64 2799-2804)作为开始。该质粒包括7个反式作用因子的结合位点和位于小鼠白蛋白启动子 5'末端的用于调控荧光素酶基因的196bp区域，以及一个来自SV40病毒的多聚腺苷酸化 言自 PANMerCreMerM半立(Dr. M. Reth，Max_Pl￡mck Institute for Immunobiology, Freiburg,Germany) (Verrou et al. , 1999,Biol Chem. 380 :1435-8)中用于编码MerCreMer 融合蛋白的序列引入到该质粒中。使用PANMerCreMer质粒的HindIII限制性酶切位点和 PO7Pal-Iuc质粒的HindIII和XbaI位点来构造克隆体，形成palbMerCreMer质粒。小鼠磷 酸甘油酸酯激酶(PGK)基因的启动子用于获得调控rtTA2S-M2反式作用因子(Zabala等， 2004，supra.)表达的第二单元，和一基于鼠β球蛋白基因(Levitt等，1989，Genes Dev. 3 1019-25)的合成多聚腺苷酸信号。所获得的质粒被称为pGKrtTA。两个转录单元都通过将palbMerCreMer质粒的BioI-SalI片段亚克隆到pGKrtTA质粒被融合到一个单独的称作 prtTAMerCre的质粒中。-AdTetCre载体基因组的构建首先，通过PCR获得包括左侧腺病毒ITR和两侧具有LoxP位点的包装信号的序 列。用含有辅助性腺病毒(E.Ayuso，Doctoral Thesis. School of Veterinary Medicine. Universidad Autonoma de Barcelona. CBATEG. 2006)基因组的 pGS102 质粒作为 PCR 的模 板，所使用的寡核苷酸为寡核苷酸 序列序列号5Ad5St TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTG1AdpTGC-IO TGACTAGTATAAGCGGCCGCAGCAGATACGGGATATC 2该片段引入到pShuttle质粒(He等，1998)以构成pShut_VH质粒。然后包含在 该质粒中的细菌序列的定向(对卡那霉素的抗性和复制起点)通过I^acI酶消化改变，并将 片段重新连接。所获得的质粒被称为pShutLoxP。然后在质粒的NotI和MlI之间包括了 一个单独的用于SwaI酶的限制性内切酶位点。至此，通过寡核苷酸的杂交构建了一个表达 框。寡核苷酸 序列序列号5SwaBCTGACTGAGCGGCCGCATTTAAATGTCGACACTTCAC 33SwaBGTGAAGTGTCGACATTTAAATGCGGCCGCTCAGTCAG 4用NotI和MlI酶进行消化，并连入到pSmtLoxP质粒中。所获得的质粒被称为 PShutSwa0然后用该质粒作为模板扩增含有腺病毒基因组左侧部分(包括两侧具有LoxP 位点的壳体化序列和SwaI识别位点)的片段。所使用的寡核苷酸为寡核苷酸 序列序列号5ClaITR ACTGACATCGATTTAATTAACATCATCAATAATATACC 53ClaLoxP TAGATTATCGATTCTTAACCACGCCCAGATC6将该片段引入至IjpAdEasyl 质粒的 ClaI 位点(He 等，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，95:2509-14)。由此获得了含有第一代腺病毒载体基因组(El与E3区域缺失)的 pAdLoxP2质粒，其中第一代腺病毒载体的壳体化信号两侧具有LoxP位点。使用唯一的 SwaI位点，将来自prtTAMerCre质粒的prtTAMerCre蛋白的可诱导的表达框引入该质粒。 这个新的质粒(pAdLoxPMerCre)应该包括新的自失活辅助性腺病毒的序列，但是观察到的 是当该质粒在大肠杆菌中进行扩增时，很可能由于MerCreMer重组酶的表达而使壳体化序 列自动切除。为了解决这个问题，使用了基于哺乳动物细胞的同源性重组策略。为了达到 此目的，将含有诱导型表达框，但是具有编码MerCreMer去尾序列的prtTAMerCre质粒的 SnaBI-SapI片段引入pSiutSwa质粒。由此，LoxP位点的共同存在和表达重组酶活性的能 力在同一质粒中被阻止了。所获得的质粒被称为pShutMer。为了产生新的辅助病毒，在 293tTS细胞株中进行PAdLoxPMerCre和pShutMer质粒的共转染。这些质粒具有足够的同 源区域，以使能产生功能性病毒基因组的重组顺利进行(图7)。当在细胞培养物中观察到 明显的细胞病变效应时(大约在转然后的10-15天)，细胞破裂并通过PCR和对最重要区域 的测序验证病毒的结构。在四3 3细胞株中通过有限的稀释获得单个克隆。新的自失活 辅助性腺病毒被称为AdTetCre。
病毒的扩增、纯化和定量在四3 5细胞株中扩增AdTetCre病毒。一旦在大多数细胞中观察到细胞病变效 应，则与培养基一起收集并离心。弃上清，将细胞于PH 8.1的IOmM较小体积的Tris中再 次重悬。然后通过3次冻融循环使细胞破裂，通过双氯化铯梯度对已释放的病毒进行纯化。 收集对应于病毒的带，通过尺寸排阻柱(Sephadex)去除盐。用市售的AdenoX快速滴度试 剂盒(BD Biosciences)，根据制造商的说明书，对病毒的无效单元进行定量。MerCreMer蛋白的表汰将四3 5细胞接种到6-孔多孔板(7. 5 χ IO5细胞/孔)中。M小时后，用他 莫西芬(0. 8 μ Μ) and强力霉素(lOOng/mL)进行预处理，或者不进行处理。在48小时时，用 AdTetCre病毒以2病毒/细胞的MOI进行感染，在感染过程中，维持用他莫西芬和强力霉 素进行处理。48小时后收集细胞。对于293细胞的对照组，它们在6-孔多孔板进行培养 并在先感染48小时后同时进行收集。对于四3 Cre4细胞的对照做相同的事情。为了研究 MerCreMer蛋白的表达动力学，用同样的方式处理细胞并在不同的时间(6小时、12小时、36 小时和48小时)进行收集。为了获得MerCreMer蛋白的阳性对照，用pANMerCreMer质粒 转染^3tTS细胞。用20 μ L脂质体2000和15 μ g的非消化质粒进行转染。在48小时处 收集细胞。在所有情况下，用补充添加意格倍(Ig印al)的TNE缓冲液(50mM Tris pH 7. 5,5mM EDTA, IOOmM NaCl)和蛋白酶抑制剂混合组成的溶液，在冰上15分钟进行细胞裂 解，并随后使细胞经声波处理并在4°C下15，OOOg离心45分钟。通过Bradford方法测定蛋 白质的量，通过8%的SDS-PAGE，对蛋白质进行电泳分离，其中加载的每个样品为20yg蛋 白质。通过使用特异性抗Cre (Novagen)的初级抗体的1 10. 000倍稀释液和与过氧化酶 (BioRad)结合的次级山羊抗-兔抗体的1 5. 000的稀释液，进行免疫印迹以检测Cre或 MerCreMer蛋白。它们通过蛋白印迹化学发光剂进行(Perkin Elmer)。用强力g素禾口他‘！！西芬控泡丨病毒产牛将不同的细胞(四3，四3 5或四3(仪4)接种于每孔具有虹104个细胞的12-孔 板中，在补充添加有10%胎牛血清，谷氨酰胺，青霉素，链霉素的DMEM培养基中培养。对小 时后，用他莫西芬(0. 8 μ M)、强力霉素(lOOng/mL)或同时进行预处理，或者不进行处理。M 小时后，用具有2病毒/细胞MOI的AdTetCre病毒或AdLC8cluc感染，48小时后收集细胞。 用AdenoX快速滴度试剂盒(BD Biosciences)，根据制造商的说明书，对无效病毒的量进行 定量。HC-Ad生产过程用Riiel限制性内切酶消化含有HC_Ad KCZ基因组的pKCZ质粒，为了使其线性化 并消除其抗生素抗性。然后通过加入醋酸钠(300mM)和2. 5倍体积的无水乙醇使其沉淀。 样品在_20°C保持至少1小时，然后在4°C下11，OOOg离心30分钟。用70%的乙醇洗涤沉 淀并空气干燥。在水中进行重悬，用15 μ g去转染60mm板中的IxlO6 293Cre4细胞，其已 经用他莫西芬和强力霉素预处理M小时。使用20 μ L的脂质体2000 (Invitrogen)进行转 染。在6小时的时候更换培养基，添加具有2% FBS的DMEN培养基和1病毒/细胞的MOI 的AdTetCre病毒。该MOI值由之前的实验测定，其中分析了在感染48小时处产生90%细 胞病变效应必要的病毒数量。进行感染48小时，然后在200 μ L ρΗ8. 1的IOmM Tris中收集 细胞。该转染-感染步骤被称为代0。在该阶段产生的病毒通过3次冻融循环从细胞中释放，用150 μ L溶菌液去感染具有MOIl的AdTetCre辅助病毒的^3Cre4细胞的新的板。如 前所述，细胞用强力霉素和他莫西芬预处理M小时。由此进行所谓的代1-3。在代4中，2 个150mm的板均用1 xlO7 293Cre4细胞感染，在代5中，所使用的为8个150mm板，在中规 模生产的最后的代使用30个150mm的板。通过双氯化铯梯度对产生的病毒进行纯化，通过 尺寸排阻柱(S印hadex)去除盐。用市售的AdenoX快速滴度试剂盒(BD Biosciences)，根 据制造商的说明书，对每代中AdTetCre的量进行定量。通过使用X_gal染色对HC-Ad KCZ 进行定量。用相同的方法产生293细胞株，直到代4。在不用强力霉素和他莫西芬处理的 293Cre4细胞中生产AdLC8cluc辅助病毒，直到代6。实施例2力聽辆碰膽T，介Λ午Cre ■汰白備_充白_聿为了调控Cre的表达，使用之前被优化的“tet-on”型诱导系统(Zabala等，2004， supra.)。该系统是基于反式作用因子(rtTA-M2)的组成型表达，其在外部添加强力霉素 时，进行二聚化，形成一个能够与含有“tet”结合序列的启动子结合的活性构象(图2)。由 此达到了在诱导型启动子(具有“tet”位点)调控下的基因仅在存在强力霉素的条件下进 行表达，并且以剂量依赖型的方式进行表达。在这种情况下，质粒被构建，其中rtTA-M2反 式作用因子在组成型启动子(磷酸激酶，PGK)的调控下，以确保其在任何HC-AD包装细胞 中具有活性。此外，Cre受诱导型启动子调控，该启动子由几个与最小启动子(在这种情况 下是白蛋白启动子)结合的“tet”位点构成。然后这两种构建体融合从而获得具有Cre完 整诱导表达系统的质粒(图2)。为了确保Cre的基础表达不妨碍新的辅助病毒的产生，进行了两个补充策略。一方面，生成组成型表达tTS阻遏物的细胞。在缺乏强力霉素时，tTS蛋白能够 结合诱导型启动子。当添加强力霉素诱导物时，tTS改变构象并不再属于启动子，留给 rtTA-M2反式作用因子一开放路径使其结合并激活Cre的表达(图3)。因此，该方法基于 两种类型的包装细胞表达tTS用于生产辅助性腺病毒的293细胞，和用于生产HC-Ad的 293细胞(具有或不具有Cre和/或rtTA-M2的组成型表达)。获得了一个商用质粒，其中 编码tTS的基因在CMV病毒启动子调控下表达。考虑到该启动子经历长时间的沉默，其被 EFla启动子代替，以获得在稳定系中的一个更持久的表达。图4示出了 RT-PCR的结果，其 用来检测在293细胞株中筛选克隆后的引入的基因表达。此外，获得了一个编码融合蛋白的序列，该融合蛋白由Cre重组酶组成，其融合蛋 白羧基末端和羟基末端分别为突变雌激素受体。该蛋白(称为MerCreMer)已经被公开仅 在存在他莫西芬时，表现Cre重组酶活性(Verrou等，1999，Biol Chem. 380 :1435-8)。因 此，在缺乏强力霉素时，如果诱导型tet-on系统不能获得Cre表达的有效调控，则该酶失活 并且允许辅助病毒产生。相反，当生产Hc-Ad时，将他莫西芬添加到无强力霉素处理的tTS 的细胞中，以使系统的活化达到最大化。—旦整合了 Cre或MerCreMer重组酶调控系统的质粒构建完成，验证诱导系统的 运行。图5示出了在293细胞中Cre表达调控的实施例。当用于编码反式作用因子和具有 诱导型启动子的Cre的单独的质粒被共转染时，获得了存在强力霉素时的重组酶的表达， 然而两种质粒并不分别表达。含有完整系统的质粒也产生Cre，尽管数量少些。图5B示出了当用强力霉素处理细胞时，后者质粒如何仅表达出一定数量的Cre。实施例3由强力霉素和他莫西芬调控的表汰Cre的辅助件腺病毒载体然后开始通过将不同成分整合到一个质粒中以构建承载有MerCreMer重组酶的 自失活载体的过程，其中该质粒包括第一代腺病毒载体基因组。图6示出了该载体的基因 组结构，并伴随有预期的操作模式。然而，在一个质粒中是不能获得完整系统的，因为观察 到两侧具有LoxP位点的包装序列在大肠杆菌的质粒中进行扩增时会被切除。为了达到这 个目的，要进行最后步骤获得新的载体，即两个质粒在^3tTS细胞株中共转染，其在细胞 中发生同源重组后储存了整个基因组(图7)。在^3tTS细胞中扩增病毒并且根据任何其 他用于第一代腺病毒载体的方法进行纯化。一旦获得病毒，则通过免疫印迹进行检测，其能够表达由强力霉素诱导MerCreMer 蛋白(图8)。然后研究了在不同类型细胞中存在强力霉素和他莫西芬时的情况。为此，在 存在或缺乏上述处理的情况下，组成型表达Cre重组酶的^3tTS或293细胞被感染(Parks 等，1996，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 :13565-70)。感染48小时后，每种情况下产生的感 染性病毒的数量被定量。如图9所示，在四3 3细胞中，仅在存在强力霉素和他莫西芬时， 病毒产物锐减，这与由于其壳体序列的切除而导致的病毒壳体化的预期抑制相符。在细胞 株293中，其中MerCreMer的基础表达水平更高些，单独加入强力霉素或他莫西芬引起病毒 产量相对减少，尽管再次组合处理产生了更为显著地减少。当使用^3Cre4细胞时，如预期 所料，病毒的产量并不独立于与诱导系统的活化。为了证明该系统的特异性，进行了一个类 似的研究，这次用标准辅助病毒(AdLC8cluc)与AdTetCre病毒进行比较，所述AdTetCre具 有两侧有LoxP位点的壳体化信号，但是其并不表达任何重组酶(Parks等，1996，supra.)。 如图10所示，用他莫西芬和强力霉素处理并不引起病毒生产水平的显著变化。仅当使用 293Cre4细胞时，病毒的包装减少。相反地，在AdTetCre情况下，证实了病毒的大幅度减少， 其病毒水平甚至比在293Cre4中使用AdLCScluc时观察到的更低。为了证明该减少是由于 包装序列的切除引起的，通过PCR对经强力霉素和他莫西芬处理的在293细胞株中呈现的 AdTetCre病毒的原始区域进行扩增。如图IlA所示，扩增的片段比与非改性的基因组相应 的片段小，并且其大小与完全丢失的包装序列相符合。通过测序进行进一步验证。图IlB示 出了当感染^3Cre4细胞时，包装序列是怎样在标准辅助病毒(AdLCScluc)中丢失的。它 还可进一步看到，该切除并不完整，与AdTetCre病毒相反。实施例4通过使用自失活辅助性腺病毒生产无肠腺病毒—旦检测到AdTetCre病毒以诱导型方式失活(自失活)，则对其在HC-Ad生产过 程中作为辅助病毒的功能进行研究。为此，进行了编码HC-Ad的质粒转染的标准过程(该 过程中，KCZ表达LacZ基因)，并随后用辅助病毒进行感染。在连续的扩增步骤之后，使用 之前步骤产生的HC-Ad感染细胞的新板，并伴随添加新的辅助病毒。板的尺寸与数量逐渐 增加。该过程在以AdTetCre病毒为辅助病毒的293细胞和^3Cre4细胞中同时进行。与 标准的方法相比，应用的相同方法在^3Cre4细胞中使用AdLCScLuc辅助病毒。在每一步 骤中，对对应于HC-Ad和辅助病毒的无效单元的量进行定量。如图12A所示，在四3&^4细 胞中进行的连续步骤中，使用AdTetCre病毒生产的HC-Ad逐渐增加，然而具有辅助性腺病毒的污染物总是很好的维持在那里。在该实施例进行的最后一代(代6)中，1.2x10"总IU 的高容量腺病毒具有辅助腺病毒污染物的量少于0. 05%。对于HC-Ad的中型生产来说，该 产量和纯度被认为是可以接受的。相反，当使用AdLCScluc病毒时，具有该病毒污染的程度 在整个步骤中增加，最终超过高容量载体的量(图12C)。尽管其它的情况下，该污染较少， 并且可用标准方法来生产HC-Ad，辅助性腺病毒的过度积累被频繁地描述并表明了该方法 的致命缺陷。关于用AdTetCre病毒在293细胞中的生产，其污染程度同样过高(图12B)。 这表明由包装细胞表达的Cre重组酶与由病毒表达的MerCreMer重组酶合作以完成最佳效 果。可能的是这种组成型表达对于用辅助病毒感染后的初始时刻，确保重组酶的存在是十 分重要的。到目前为止进行的一些连续的试验中，当使用293Cre4细胞时，AdTetCre病毒 的量始终保持在高容量病毒的量之下，这说明与基于传统辅助性腺病毒的技术相比，该生 产方法具有更高的可靠性。实施例5通过使用自失活辅助腺病毒牛产携带治疗转基因的无肠腺病毒一旦检测到AdTetCre以诱导型方式失活(自失活)并在生产HC-Ad过程中作为 辅助病毒起作用，则对其能够生产携带有治疗基因的HC-Ad的能力进行研究。例如，GL-Ad/ RUmIL-12病毒(也称为HC-Ad-mIL_12)在米非司酮-活化的肝脏特异性诱导型启动子的调 控下表达小鼠白细胞介素12(mIL-U)细胞因子。该载体在一些动物肝癌模型中已经显示 出了具有抗肿瘤作用(Wang等，(Gastroenterology 2004,126 =278-289) 如前所述生产含 有 GL-Ad/RUmIL-12 的基因组的 pGLAd-RUmIL-12 质粒(Wang，L.，等，2004Gastroenterology 126 :278-89),其用限制性内切酶RiieI进行消化，以使其线性化并消除抗生素抗性。随后 通过加入醋酸钠(300mM)和2. 5倍体积的无水乙醇进行沉淀。样品保持在_20°C至少一个 小时，然后4°C下，11，OOOg离心30分钟，用70%乙醇清洗沉淀物并在空气中干燥。在水中 进行重悬，在用60mm板中，IxlO6 293Cre4细胞转染15 μ g样品，其中60mm板在此之前用他 莫西芬和强力霉素处理M小时。用20 μ L脂质体2000 (Invitrogen)进行转染。6小时后 更换培养基，加入具有2% FBS和具有1病毒/细胞MOI的AdTetCre病毒的DMEN培养基。 该MOI值由之前的实验测定，其中分析了在感染48小时处产生90%细胞病变效应必要的病 毒数量。进行感染48小时，然后在200 μ L ρΗ8. 1的IOmM Tris中收集细胞。该转染-感 染步骤被称为代0。在该阶段产生的病毒通过3次冻融循环从细胞中释放，用150 μ L溶菌 液去感染具有AdTetCre辅助病毒MOIl的^3Cre4细胞的新的板。如前所述，细胞用强力 霉素和他莫西芬预处理M小时。以此方式进行所谓的代1-3。在代4中，2个150mm的板 均用1 XlO7 293Cre4细胞感染，在代5中，所使用的为8个150mm板，在中规模生产的最后 的代使用30个150mm的板，其具有相当于4个150mm板的裂解液。通过双氯化铯梯度对 产生的病毒进行纯化，通过尺寸排阻柱(S^hadex)去除盐。用市售的AdenoX快速滴度试 剂盒(BD Biosciences)，根据制造商的说明书，对每代中AdTetCre的量进行定量。GL-Ad/ RumIL-12的产量达到了 1. 5xl012个病毒颗粒(vp)，而具有的AdTetCre辅助腺病毒污染少 于 2. 6xl06iu。考虑到该载体并不表达任何报告基因，通过测定感染细胞中转基因(mIL-12)的 产生对其功能进行验证。图14A示出了在存在米非司酮诱导物时，用不同量的高容量腺病 毒载体GL-Ad/RUmIL-12感染HuH_7细胞(源于人类肝癌细胞)后的mIL_12水平。随后，在体内对载体的功能进行验证。为此，将该载体内源性地注射到小鼠体内，测定了在腹腔使 用米非司酮诱导物后，在血清中出现的mIL-12的量。mIL-12的诱导与测量在注射载体后的 第7、48和62天进行，并检测到小鼠稳定表达大量的转基因(图14B)。这些数据显示出新 型的方法用于生产临床有益的载体是有效的。
权利要求
1.一种多核苷酸，其包括a)编码位点特异性重组酶的区域，其中所述区域由诱导型启动子调控，以及b)对于腺病毒基因组的复制和/或包装必不可少的区域，其两侧为对由序列a)编码的 重组酶有特异性的识别序列，其中所述识别序列被定向，以使存在所述重组酶时，切除所述 重要区域。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中用于包装和复制腺病毒基因组的重要的区域 b)是包装信号Ψ。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，还包括编码转录激活物的序列，所述转录激活 物在存在所述转录激活物配体的情况下，能够特异性激活调控由序列(a)编码的重组酶表 达的启动子。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述转录激活物是四环素类似物依赖型反式 作用因子。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述转录激活物是rtTA-M2反式作用因子。
6.根据前述任一项权利要求所述的多核苷酸，其中重组酶是Cre或者包括Cre重组酶 序列的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中重组酶还包括一激素结合域或一可激活的核 定位序列，优选雌激素受体蛋白的激素结合域。
8.一种包括根据权利要求1到7任一项所述的多核苷酸的表达载体。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其中所述载体是腺病毒载体。
10.一种包括据权利要求1到7任一项所述的多核苷酸序列的腺病毒颗粒。
11.一种用于自失活辅助性腺病毒复制和包装的系统，其包括a)根据权利要求1到7中任一项所述的多核苷酸、或根据权利要求8到9中任一项所 述的表达载体，或根据权利要求10所述的腺病毒颗粒；和b)一真核细胞。
12.根据权利要求11所述的系统，其中细胞形成组分(b)包括一启动子特异性转录阻 遏物，其调控位点特异性重组酶的表达。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述特异性转录阻遏物在缺乏能够促进位点特 异性重组酶表达的配体时具有活性。
14.一种用于获得自失活辅助性腺病毒的方法，其包括(i)在适合的条件下使细胞与根据权利要求1到7中任一项所述的多核苷酸、或根据权 利要求8到9中任一项所述的表达载体，或根据权利要求10所述的腺病毒颗粒，和可选择 地与细胞中的一个或多个编码对于细胞中腺病毒包装或复制必要的腺病毒蛋白质的多核 苷酸接触，以使腺病毒基因组或包括所述基因组的多核苷酸进入细胞，( )将该细胞维持在适当的条件下，允许细胞中腺病毒的包装和复制，并阻止位点特 异性重组酶的表达，和(iii)从培养基中重新获得腺病毒。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞包括一调控位点特异性重组酶表达的 启动子特异性转录阻遏物，其中所述阻遏物在缺乏能够促进位点特异性重组酶表达的配体 的类似物时具有活性。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述阻遏物是强力霉素依赖型tTS阻遏物。
17.一根据权利要求16所述方法获得的辅助性腺病毒。
18.根据权利要求1到7中任一项所述的多核苷酸、或根据权利要求8到9中任一项所 述的表达载体，或根据权利要求10所述的腺病毒颗粒的应用，其包括用于生产和包装高容 量腺病毒的多核苷酸。
19.一种用于高容量重组腺病毒生产的系统，其包括(a)根据权利要求1到7中任一项所述的多核苷酸、或根据权利要求8到9中任一项所 述的表达载体，或根据权利要求10所述的腺病毒颗粒；和(b)一个腺病毒，其基因组包括目的基因，且该腺病毒缺少编码至少一个复制所需的重 要蛋白质的序列，或缺少编码至少一个对所述腺病毒包装重要的蛋白质的序列，或包含所 述腺病毒基因组的多核苷酸，和(c)一个真核细胞。
20.根据权利要求19所述的系统，其中真核细胞包括一多核苷酸，其表达由系统组分 (a)编码的位点特异性重组酶。
21.根据权利要求20所述的系统，其中编码位点特异性重组酶的区域由诱导型启动子 调控。
22.—种产生表达目的基因的高容量腺病毒的方法，包括以下步骤(i)在适合条件下将一个细胞与一个腺病毒接触，以使所述腺病毒基因组或包含所述 基因组的多核苷酸进入该细胞，( )在适合条件下将所述细胞与选自下组中的第二组分接触，(a)一种多核苷酸，包括1.编码位点特异性重组酶的区域，其中所述区域由诱导型启动子调控，以及2.一个腺病毒包装信号Ψ，其两侧具有序列a)编码的重组酶的特异性识别序列，其中 所述识别序列被定向，以使存在所述重组酶时，切除包装信号Ψ，(b)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒载体，和(c)包括(a)所述多核苷酸的腺病毒颗粒以使所述多核苷酸、所述腺病毒载体或所述腺病毒颗粒的基因组进入该细胞中，(iii)将该细胞维持在适当的条件下，用于两种病毒基因组编码的蛋白质的表达，两种 腺病毒基因组的复制和步骤(ii)中使用的多核苷酸、载体或腺病毒编码的重组酶的表达。(iv)从细胞培养基中重新获得高容量腺病毒。
23.根据权利要求22所述的方法，其中在(a)中限定的多核苷酸和/或细胞还包括一 编码调控位点特异性重组酶表达的启动子的特异性反式作用因子的序列。
24.根据权利要求23所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在存在能够结合或激活调 控位点特异性重组酶表达的启动子的特异性反式作用因子的配体时进行。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述反式作用因子是rtTA-M2并且其中所述配 体是强力霉素。
26.根据权利要求22到25中任一项所述的方法，其中所述细胞包括一编码位点特异性 重组酶的序列，其中所述重组酶与被在(a)中限定的多核苷酸编码的一样。
27.根据权利要求22到26中任一项所述的方法，其中位点特异性重组酶是Cre或者包括Cre重组酶序列的融合蛋白。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述重组酶是merCremer。
29.根据权利要求28所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在存在三苯氧胺时进行。
30.根据权利要求22到29中任一项所述的方法，包括至少重复一次步骤(i)到(iv)， 每个循环的步骤(i)都由上一循环的步骤(iv)获得，而且有选择地在每个循环的步骤(i) 中加入新的剂量的辅助性腺病毒。
全文摘要
本发明涉及用于生产自失活辅助性腺病毒的试剂和方法，所述自失活辅助性腺病毒允许发展用于生产通过辅助腺病毒而减少污染的高容量重组腺病毒的细胞系统。
文档编号C12N15/861GK102099481SQ200980128059
公开日2011年6月15日 申请日期2009年5月13日 优先权日2008年5月16日
发明者曼努埃拉·冈萨拉斯阿帕里西奥, 米伦伊莎索·毛莱翁马约拉, 鲁本·埃尔南德斯阿尔科塞瓦 申请人:西马生物医学计划公司