单层或多层细胞培养系统的制作方法

专利名称：单层或多层细胞培养系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞培养系统，其所具有的装置或容器含有一层或各层之间流体 相通的多层细胞生长表面。更具体地，本申请涉及一种具有细胞生长表面的多层托盘的颈 瓶系统(flask system)，其中，每个托盘上的细胞生长培养基通过相同的可重复密封的端 口可直接进入每个托盘。
背景技术：
小规模细胞培养装置多年以来都采用振荡颈瓶及滚瓶的形式。近来，已经开发出 单层及如今的多层颈瓶式瓶子(flask bottles) 0目前研究的趋势要求需要更多细胞来完 成药物研发公司中的高通量筛选工作。此外，由于开发过程早期潜在候选药物挑战的推动， 以细胞为基础的化验方法的应用快速增长。通常的以细胞为基础的化验或HTS筛选流程可 需要约IO9到约101°个细胞。普通单层颈瓶可提供大约IO7个细胞。为了获得必要数量的 细胞来进行给定的基于细胞的化验或HTS筛选，目前的细胞需求要求研究人员维持和供养 10到100个普通颈瓶，所以需要新的多层的形式。因此，人们希望有一种细胞培养系统，其 能在所维持和供养的普通颈瓶的数量没有显著增加的情况下提供大量细胞。该产品的一种是将相互附接的两层托盘，插入颈瓶中形成具有三层培养层的颈 瓶。该颈瓶通常为矩形，在瓶子前方最收缩侧壁处，即瓶颈的形式，存在典型螺纹瓶口(参 见美国专利5，310，676)。每层托盘具有环绕其全部外围的侧壁，且侧壁彼此封接。为了提 供细胞和液体进入中间及下层托盘，需要构建一个通道，其沿着托盘或颈瓶的端壁而与托 盘液体连通，以便液体和细胞可流进及流出该托盘。另一产品采用了多达十层托盘，每层托盘的上表面由气透膜覆盖。每个托盘具有 从该表面向上延伸的侧壁。托盘堆叠在一起，且侧壁合并形成一个整体。然后一个多支管 与带有普通螺纹瓶口的瓶颈侧壁在托盘的前端部相连接形成颈瓶(参见W02008/069902 A3)。该多支管提供了到托盘开放端的通道。美国专利5，310，676和恥2008/069902 A3所教导的系统均存在缺陷。采用移液
管或注射器进入这些系统，不论是添加流体或细胞、样品，或移走已完成生长周期的细胞都 不容易。实际上，由于瓶口位于侧壁，且托盘阻碍了移液管进入培养基和细胞，所以移液管 或注射器的应用受到了限制。人们希望能采用普通的移液工具及普通的细胞培养技术来直 接从培养装置中吸取培养基和细胞。细胞和液体的利用很困难且通常不完全。美国专利5，310，676依靠其在通道中的 模制部件以助于细胞和液体的分配，这种分配可能困难且耗时。液体必须从垂直方向加入颈瓶中，这会引起培养基起泡和培养基中的关键蛋白损伤。然后，颈瓶沿不同方向旋转以确 保所有的托盘获得足够量的液体。同样，为了回收，液体和/或细胞的移除也需要穿过通 道。最后，托盘的数量不足以有效提高现今科学家所需的高产出量。W02008/069902采用一个多支管通过添加液体(含有细胞和/或生长培养基)到 颈瓶的瓶颈部分将液体及细胞分配到颈瓶中。瓶颈是闭合的，且摇动、敲打或者移动颈瓶来 除去任何可能截留在系统的层中的空气。最终，由于托盘之间的空间非常小，且气透膜在任 一给定的托盘上形成了培养基的上限，所以培养基的厚度固定在大约0. 32mis/cm20所需培 养基随培养的细胞类型而不同。例如，人或鼠的干细胞是具有高度代谢活性的细胞，要求高 液面的培养基，通常在0. 4mis/cm2范围内，而低代谢细胞系，如CHO、MDCK或成纤维细胞可 能只需0. anis/cm2。由于WO 2008/069902填充系统的培养基体积是固定的，研究人员就 需要针对所培养的每种细胞类型来调整细胞的供养及维持预定的进程，否则就会浪费昂贵 的培养基和添加剂。此外，为了优化生长条件，科学家更愿意能够改变其能使用的培养基的 量，而该参数在WO 2008/069902中不能被科学家优化。人们希望提供一种具有分层的培养 装置，其易于培养基的填充且不受通道限制，也无需移除截留在层中的空气。随着细胞生长，研究人员需要定期获知培养物的生长状态，以便采取合适的步骤， 如当细胞接近汇合时，研究人员将从培养托盘把它们分离下来，以用于化验、筛选或类似的 用途，或再接种于新的培养系统来继续扩展细胞系。在100%汇合之前回收细胞是很重要 的。这些系统通常需要研究人员将培养系统移动到可能在或可能不在培养区域的昂贵的显 微镜下，来调查细胞的生长状态。人们希望能够用预定量的培养基和添加剂来填充培养装 置，以满足细胞类型的需要，且符合研究人员工作进程。此外，人们希望提供一种使得细胞 可视的细胞培养系统而无需不得不将颈瓶或类似的细胞容器送到昂贵的显微镜下。通常地，使用如上所述的大量细胞来工作的实验室，都采用多种自动化设备，例如 多孔板处理机和液体分配系统，来增加通量并降低由于操作者失误而造成的数据变异。这 些培养系统可以是自动化的，但受限于配备了关节式手臂的系统，该关节式手臂可抓住系 统并将液体倾倒入接收容器中。带有这些复杂的关节式手臂的系统很昂贵，且大多数实验 室无法获得。因此，大多数上述培养系统的使用受该系统人为操作的限制，这与高通量实验 室的工作实践相悖。所以，人们希望提供一种细胞培养系统，能够与目前大多数实验室中的 自动化系统兼容，且不需要特别的关节式手臂来实现自动化。

发明内容
本发明提供了一种单层或多层细胞培养容器，其容易填充，容易清空，可容易地让 移液管或注射器进入，并提供了工业上所期望的高通量能力。本发明基于，至少部分基于，包括如颈瓶或此类的装置或容器的多层细胞培养系 统，包括盖子，其具有顶板，通常为3个或更多个的侧壁，以及可重复密封的端口 ；接收细胞 培养基的中间托盘，其中，中间托盘包括底板，通常为3个或更多个的侧壁，以及在位于中 间托盘底板内部的内部向上成角度的唇与中间托盘底板的邻近向外成角度的侧壁部分之 间形成的缺口区域，其中，该唇具有向外俯冲曲线的内缘特征；以及接收细胞培养基的底部 托盘，包括底板和通常为3个或更多个的侧壁。中间托盘位于盖子和底部托盘之间，使得中 间托盘底板的缺口区域与位于盖上的端口对齐，导致端口、中间托盘和底部托盘相互间以流体连通，这样就给，例如使用者，提供了一个直接通向位于每个中间和底部托盘上的细胞 培养基及细胞的通道。根据另一实施方式，本发明是基于，至少部分基于，多层细胞培养容器或装置，例 如一种颈瓶，包括盖子，其具有顶板，通常为3个或更多个的侧壁，以及可重复密封的端口 ； 多个在彼此顶部堆叠的中间托盘，用来接收细胞培养基，每个托盘具有带上、下侧的底板、 通常为3个或更多个的侧壁，以及在位于底板内部的具有俯冲曲线边缘的内部向上成角度 的唇与底板的邻近向外成角度的侧壁部分之间形成的缺口区域；以及用于接收细胞培养基 的、具有底板和通常为3个或更多个的侧壁的底部托盘。多个中间托盘位于盖子和底部托 盘之间，且每个中间托盘的缺口区域相互之间，以及与盖子上的端口之间对齐，导致所述端 口、堆叠的多个中间托盘和底部托盘相互间以流体连通，从而提供了一个通向位于每个中 间和底部托盘上的细胞及细胞培养基的直接通道。根据另一实施方式，本发明是基于，至少部分基于，细胞培养容器或装置，例如一 种颈瓶，所述颈瓶具有通过一个或多个，通常为3个或更多个的侧壁连接在一起的底部器 壁和顶部器壁，侧壁基本上垂直于顶部器壁和底部器壁。顶部上有螺纹开口，其与具有通气 孔的盖子成螺纹匹配，其中，顶部器壁优选为基本上是平展的。内部空间由器壁来限定的。 底部器壁具有至少两个部分，优选三个；第一部分在一个平面中，第二部分在其上的第二平 面中，且优选为与第一部分的平面相平行，以及一个相互连接的部分，其以一定的角度使第 一部分和第二部分相互连接。在某些实施方式中，相互连接部分并入第二部分，这样邻接第 一部分的第二部分的区域是在第一部分的平面中，且超过邻接区域的第二部分的区域以向 上角度离开第一平面到预定位置或第二平面。底部器壁从外底部平面延伸出来，形成周围 裙部(perimeter skirt)。该周围裙部形成一个直至底部器壁的线性过渡部分。线性裙部 的过渡部分产生一角度，这样当细胞培养系统在适当的位置时，线性过渡部分的裙部平直 地置于工作面，使得所有的内部平面部分(一、二、三和四)处于正角，这样那些平面上的液 体会朝向细胞培养系统的入口端排尽。该特征使得在培养基更换中能够全部回收失去效能 的培养基，并在培养后完全回收细胞。托盘置于内部空间中，优选仅在由底部器壁的第一部 分和相互连接部分的部分(如果使用)所界定的区域。本发明的一个目的是提供一种多层细胞培养装置，允许使用者采用普通的移液管 工具和普通的细胞培养技术，来直接地从该装置中吸取细胞培养基和细胞。本发明的另一目的是提供一种细胞培养系统，其能提供大量细胞，而不增加所维 持和供养的普通瓶的数量。本发明的另一目的是提供一种细胞培养系统，其与目前在大多数实验室所使用的 自动化系统相兼容，而无需特定的关节式手臂来实现自动化。本发明进一步的目的是提供一种细胞培养系统，其提供一种多层细胞培养装置， 其中，每层或每个托盘容易填充培养基，且没有通道限制，也不需要移除截留在间隔平面 (separate levels)中的空气。本发明的另一目的是提供一种多层细胞培养系统，其提供了细胞培养装置，它容 易用预定量的培养基、添加剂和细胞进行填充或清空，从而满足细胞类型的需要，也符合研 究人员的工作进程。本发明的另一目的是提供一种细胞培养系统，其提供了在培养装置中的细胞的可视化，而无需将颈瓶或容纳细胞的装置送到昂贵的显微镜或其它类型的光学观察仪器下。
本发明另外的特征和优点将在以下的详细说明中阐述。对本领域技术人员显而易 见的是，可对本发明作出许多修改和变化，而不脱离本发明的宗旨和范围。应当理解的是， 前面的概括描述和下面的详细说明、权利要求和附图仅是示范性的，仅用来解释，旨在提供 对本教导内容中各实施方式的解释。仅仅通过实例的方式提供了在此描述的特定实施方 式，而不认为是以任何方式作出了限制。


图1显示了本发明第一实施方式的横截面视图。
图加和2b显示了本发明附加的实施方式的横截面视图。
图3显示了本发明中图1的第一实施方式处于卸载位置的横截面视图。
图4显示了本发明一连串的第一实施方式在堆叠构造时的横截面视图。
图5A-E显示了根据本发明的多个侧壁的实施方式的自上而下的横截面视图。
图6A-6B显示了本发明附加的实施方式的透视图。
图7显示了本发明附加的实施方式的透视图。
图8显示了本发明附加的实施方式的另一透视图。
图9显示了本发明附加的实施方式的透视图。
图10显示了图10的实施方式的各个组件的透视图。
图11显示了在图10中描述的本发明的附加实施方式的分解图。
图12a显示了在图11中描述的本发明的实施方式的侧视图。
图12b显示了在图11中描述的本发明的实施方式的横截面视图。
图13显示了本发明附加的实施方式的透视图。
图14显示了本发明附加的实施方式的透视图。
图15显示了本发明附加的实施方式填充了细胞培养基时的透视图。
图16a显示了本发明附加的实施方式含有等量地填充托盘的细胞培养基时的透视图。
图16b显示了为使细胞培养基贯通托盘，图15中描述的本发明处于倾侧位置时的透视图。
详细描述
出于说明书和所附的权利要求书的意图，除非另有指示，所有表示成分数量、百分
比或原料比例、反应条件的数字，以及用在说明书和权利要求书中的其它数值，在所有例子 中应理解为加上术语“大约”来修饰。因此，除非有相反的指示，在下列说明和所附的权利要求中展示的数值参数均为 近似值，其可根据通过本发明寻求获得的期望特性而变化。至少，不是企图将等同原则的应 用限制在权利要求范围，每个数值参数应至少按照所记述的有效位数字，及采用普通四舍 五入方法来解释。尽管阐明本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但在特定实例中阐明的数 值则记述得尽可能精确。然而，任何数值固有地含有因各个试验测量结果中所导致的普通 偏差而必然引入的某些误差。此外，在此公开的所有范围应理解为包含任一数值，以及所有归入其中的子范围。例如，范围“1到10”包括任一数值，以及在最小值1和最大值10之间 (及包括)的所有子范围，也就是说，任一数值，以及具有等于或大于1的最小值和等于或小 于10的最大值的所有子范围，例如，5. 5到10。在此描述的，单数形式“a”、“an”以及“the”包括复数指称对象，除非文中明确作 出了其它规定。图1显示了本发明的实施方式，其中，颈瓶2优选包括透明、半透明或不透明的玻 璃或塑料材质。颈瓶2具有顶部器壁4、底部器壁6以及3个或更多个侧壁8，该侧壁8基 本上垂直顶部器壁4和底部器壁6并在顶部器壁4和底部器壁6之间延伸，从而界定出内 部空间10。如图所示，底部器壁6和侧壁8作为一体形成。如果需要，它们可由单件形成。 顶部器壁4不透液体地密封到侧壁8的上边缘12，例如通过热粘合、熔粘合、声振动焊接或 黏合。如在这个实施方式中，可选择侧壁的上边缘12具有一特征，就是脊状突起14，其与相 应的特征，也就是在顶部器壁4的底面或内表面18中的沟槽16相配合，这样器壁恰好对齐 并密封在一起。如果想要移走顶部器壁，通过其它众所周知的方式，例如螺丝、夹具、滑动楔 形榫头以及类似方式(未显示)，将顶部器壁4紧固到侧壁8上。顶部器壁4具有端口 20，其能选择性地打开和关闭。一种选择性打开和关闭端口 20的装置是盖子22，盖子22优选具有通气孔M，通气孔M允许在无污染的情况下传递气 体进出内部10。这可通过使用玻璃原料，金属，例如不锈钢，或塑料，例如P0REX 玻璃原料， 或疏水薄膜或滤器来实现，上述材料具有设计好的孔径大小来阻挡细菌、灰尘和其它这样 的污染物。在这种玻璃原料或滤器或薄膜中采用的通常的孔径尺寸小于约0. 65微米，优选 小于约0. 4微米，更优选为约0. 22微米。如图所示，本实施例中的底部器壁6具有基本上平坦的第一部分M和基本上平坦 的第二部分沈，通过基本上平展的相互连接部分观相互连接，相互连接部分观以一定的角 度，以便将M和26两部分连接在一起。第一部分M位于一个预定的水平面上，其在第二 部分沈的第二水平面之下。这意味着当处在如图1所示的使用位置时，第一部分M是装 置2的内部10中最低的部分。内部10的一部分容纳一个或多个细胞生长托盘30。这些托盘具有基本上平坦的 底部32和侧壁34，侧壁34围绕托盘30的周边。托盘30的侧壁34的数量与颈瓶2的侧壁 的数量在数目上相等。托盘的前侧壁36与托盘30的其它侧壁34的不同在于，其以向上角 度离开每个托盘30的基本上平坦的底部32。当托盘30布置在颈瓶2中时，前侧壁36或唇 提供了细胞、液体和气体进入每个托盘的开口。图中还显示出了在每个托盘30上具有一个 可选的特征38，其为从每个托盘30的前侧壁36向外延伸而来的足部。底部器壁从外底部平展表面延伸出一段距离来形成周围裙部。该周围裙部形成到 底部器壁的线性过渡部分。线性裙部的过渡部分产生一角度，当细胞培养系统在适当的位 置时，过渡裙部平直放置于工作面上，使得所有的内部平面部分(一、二、三和四)处于正 角，这样，这些平面上的液体会朝向细胞培养系统的入口端排尽。该特征使得在培养基更换 中能够完全回收消耗了的培养基，并在培养后完全地回收细胞。托盘30与颈瓶2的底部器壁6之间具有间隔，这样底部器壁的内表面44起托盘 的作用。在该实施方式中，通过在相对侧壁8上形成的定位凹槽，托盘与底面44间隔开来。 这些定位凹槽或支撑物向外延伸进入内部10，直到足够支撑内部10内的托盘的程度。通常地，它们可从侧壁向空间内外延出一段大约3mm到大约7mm的距离。可选地，最底部的托盘 30可具有在其底面32上形成的足部(未显示)，以提供与内部10的内底面44之间的必要 的间隔。在另一实施方式中，如果不希望底面44作为细胞生长层，则不需要定位凹槽或足 部，托盘底部32可与底面44相接。优选地，托盘30简单地相互堆叠，并保持在颈瓶中，间距的考虑是要使其足够窄， 以便托盘30 —旦插入则彼此不能分离。可选地，它们可相互密封，例如通过使用黏合剂或 热粘合及其它类似方式，或者它们可具有带子，例如一个或多个扎带或缆带(未显示)置于 它们周围，或它们可在相邻表面之间含有滑动楔形榫头或搭扣接头(未显示)来将它们结
合在一起。相互连接部分观的角度等于或大于每个托盘30的前侧壁36的角度，以便当移到 如图2所描述的装载/卸载位置时，液体和细胞可流向其合适的位置。通常地，相互连接部 分观的角度在约10度到约60度间，其通过在第一部分M的第一平面和相互连接部分观 的外底面48之间的角α 46来测量。优选角α 46在约10度和约45度之间，更优选在约15 度到约30度之间，最优选约22度。如上描述的前侧壁36的角度与角α 46相等或小于角 α 46，但优选不大于角α 46。此外，顶部器壁4可选择地具有相似的第三部分四(如图所 示)，以与角α相当的角度，直接置于第一部分M和底部器壁6的相互连接部分观之间的 内表面之上。这是优选的方案，这样顶部托盘和顶部器壁4的内表面之间的间距与任何其 它托盘(如果使用了不止一个)和其上的相邻表面(例如其上的托盘的底面)之间的间距 相同。可替代地，顶部器壁4在整个长度上可基本上是平展的，且如果需要提供适当的液体 和气体流进入该托盘(未显示)，顶部托盘和顶部器壁之间的间距可适当扩大。托盘30容纳在内部10中，至第一部分24和优选的至少底部器壁6的相互连接部 分观的一部分所限定的区域内。这样就在内部10里留了一个开放区域41，其围绕并邻近 端口 20，以供液体、细胞和气体进出。在托盘30没有粘合或以别的方式紧固到颈瓶2的侧 壁6、8的底部的实施方式中，当倾斜颈瓶用以卸载时，足部38起到阻止托盘移到开放区域 41中的作用，或者如果需要装载也一样。图2显示了处于其卸载位置的颈瓶2。这也可以是所希望的装载位置。如图所示， 颈瓶2抬起其后部50，并向前倾到其足部42，足部42从邻近的端口 20的侧壁8向下延伸。 移液管或注射器或漏斗(显示为移液管5 可插到端口 20中，并具有通向内部10的开放 区域41的通道。第二部分沈在卸载或装载位置时变成了颈瓶2的低点。这使得操作者容 易回收细胞或更换培养基或添加新的培养基或细胞至开放区域41中，而无需打乱托盘，或 像现有技术要求的那样需要操作者去垂直地倾斜瓶子。图3显示了图1和2的设计的可替代实施方式。在该实施方式中，第二部分变成 相互连接部分观的一部分，这样就有了底部6的平坦的第一部分，和唯一的成角度的相互 连接部分观，其与前侧壁M相交并终止于此。实际上第二部分沈变成了相互连接部分观 与前侧壁M的相交点。装置2与图2描述的装置的使用方式相同。所有与图1和3相同 的元件保留相同的参考编号，执行相同的功能，并具有如图1的实施方式所描述的相同的 特性。图4显示了根据本发明的一连串的颈瓶2。由于其带有相对平坦的底面部分M和 顶部器壁4的设计，它们可以在彼此顶部交替堆叠，以在培育及生长期间节约地面或外罩
9的空间。如前描述，颈瓶可具有3个或更多个侧壁8。图5A-D显示了颈瓶2的三种不同侧 壁的实施方式来说明该特征。图5A显示了具有3个侧壁8A的三角形状的颈瓶2。图5B显 示了具有4个或更多个侧壁的多边形侧壁的构造，其侧壁8B和8D是线性或直的侧壁，侧壁 8C是成角度的或锥形的或成曲线形的侧壁。侧壁8C可为侧壁8B的延伸，此时具有3个侧 壁，或者它们可成为分离的侧壁部分，在此实施方式中，颈瓶具有5个侧壁。图5C显示了具 有4个侧壁8D-8G的矩形设计。图5D显示了具有5个侧壁8I-8M的另一设计。图5E显示 了单个圆形的侧壁8N。在使用时，本发明的培养系统包括通过移液管、注射器或相似的设备来填充和/ 或清空的颈瓶，培养系统置于工作平面上，并且颈瓶在向上位置处具有螺纹状的开口。研究 人员将培养基和细胞分配到该系统中。培养基的量可以根据所培养的细胞类型而变化，例 如，高代谢细胞如干细胞需要更多培养基。研究人员用可透气的封口，例如具有疏水抗菌的 多微孔填料(microporous matrix)的螺纹帽来密封系统，使得气体能够从系统的外部向内 部自由地交换。培养系统倾斜到一侧，以便培养基自由地填充培养层，确保每个托盘之间有 相同的量。系统倾斜到与封口相对的侧壁，再向前倾，导致培养系统安置成第一部分和第三 部分表面与工作面基本平展。在这种位置时，培养基和细胞均勻地分散在每个培养层和第 一部分平面。在细胞培养阶段，通常将这种准备好的培养系统放进环境控制室、培养箱。在生长阶段，研究人员需要周期性地监测培养状态。该工作通常包括将培养系统 从培养箱移出，并转到可能或可能不靠的很近的显微镜下。在一个实施方式中，如图6A和 6B所示，颈瓶2附加地带有可被嵌入顶部器壁或底部器壁(未显示)的透镜M，焦点平面 为第一个相邻的培养层。理想地，低水平观察细胞培养透镜的放大率是IOX到40X。优选 放大倍率是25X到40X，这样细胞生长状态的观测和细胞回收时的细胞分离可用肉眼看 见。此外，相机系统56，如Dino-Lite系统(BigC. com Corp.，iTorrance, Ca)，可通过藕联机 构或镶嵌系统52紧固到顶部器壁4或底部器壁(未显示)上，以提供图像捕捉。理想地， 该构造保存在培养箱里，以便研究人员在无需进入培养箱及干扰细胞生长阶段的情况下可 以进行监测。此外，无线连接的使用使远程监测细胞培养成为可能(未显示)。在另一实施方式中，如图7所示，颈瓶2还可包括一个或多个下述特征a)环绕瓶 子周围的外模密封塑料封条57 ；b)防滑的、优选塑料的钮扣55来紧固颈瓶2，在失去效能 的培养基的回收、细胞后培养或类似过程中当颈瓶倾斜时防止其打滑；c)为使用者提供防 滑抓取或把持表面的外模塑料肋骨或其它这样的特征。在优选的实施方式中，为了给使用 者提供抓取或把持颈瓶时适合的触感，用以产生这些特征塑料包括具有硬度大于49邵氏 硬度A的热塑性弹性体(TPE)。在另一可替代的实施方式中，如图8所示，颈瓶2也可在侧壁8之一中包括容易打 开撕掉的元件60或类似物，其中容易打开撕掉的元件60优选为外模封条57 —部分。在另一可替代的实施方式中，如图9和11所示，多层细胞培养的多层颈瓶100包 含盖子94，其包括顶板98、侧壁96和可重复密封的端口 20 ；用来接收细胞及细胞培养基 105的中间托盘92，中间托盘具有底板95、侧壁97，以及缺口区域89，其形成于在设置在底 板内部的具有俯冲曲线内缘99的内部向上成角度的唇78与底板的邻近向外成角度的侧壁 87之间；接收细胞及细胞培养基的底部托盘90，包括底板93和侧壁91，其中，托盘位于盖和底部托盘之间，使得该托盘的底板的缺口区域与位于盖上的端口对齐，导致盖、托盘和底 部托盘之间互相以流体连通，这使得使用者可直接地介入位于托盘和底部托盘上的每层细
胞培养基。在如图9-16所描述的另一可替代的实施方式中，细胞培养颈瓶100包括盖子94， 其具有顶板98，一个或多个侧壁96和可重复密封的端口 20 ；用于接收细胞及细胞培养基 105的多个中间托盘92，每个中间托盘92具有底板95，一个或多个侧壁97，和缺口区域89， 其形成于位于底板内部的具有俯冲曲线内缘99的内部向上成角度的唇78与底板的邻近向 外成角度的侧壁87之间；以及用于接收细胞及细胞培养基的底部托盘90，其具有底板93 和一个或多个侧壁91。多个中间托盘92位于盖子94和底部托盘90之间，使得多个中间托 盘在彼此顶部堆叠，且每个中间托盘的底板95的缺口区域相互对齐，并且还与位于盖上的 端口对齐，导致端口，多个中间托盘和底部托盘之间相互以流体连通，这使得使用者可利用 普通的吸液装置及类似物直接介入位于多个中间托盘和底部托盘上的每层细胞培养基。如图13所示，在彼此顶部堆叠的每个中间托盘92的侧壁97优选合并形成不透液 体的密封135，直至下一个相邻中间托盘上的侧壁97的下侧。在一个实施方式中，在彼此顶 部堆叠的每个中间托盘的侧壁是超声焊接135到下一个相邻中间托盘92的侧壁的下侧；邻 近盖子94的中间托盘92的侧壁超声焊接145到盖子94侧壁的下侧，底部托盘90的侧壁 超声焊接155到相邻中间托盘92的侧壁的下侧。可重复密封的端口 20能选择性地打开和关闭。一种这样的可选择地打开和闭合 端口 20的装置是盖子22，其可具有螺纹，并优选具有通气孔M，其允许在无污染的情况下 传递气体进出内部10。这可通过使用玻璃原料、金属，例如不锈钢，或塑料，例如P0REX 玻 璃原料，或疏水薄膜或滤器来完成，上述材料具有设计好的孔径大小来阻挡细菌、灰尘和其 它这样的污染物。在这样的玻璃原料或滤器或薄膜中采用的通常的孔径尺寸小于约0. 65 微米，优选小于约0. 4微米，更优选为约0. 22微米。在另一可替代的实施方式中，如图9-16所示，多层细胞培养颈瓶100、110、115包 括基板90的底部器壁88，其具有基本上平坦的第一部分86和基本上平坦的第二部分84， 两者之间通过基本上平展的相互连接部分81来连接，相互连接部分81处于一定的角度，以 便将84和86两部分连接在一起。如图1 和12b所描述的，基板90包括构造成基本水平面的第一部分86，其在第 二部分84的第二基本水平面之下，使得培养基、细胞及类似物105可均勻地沿着基板90的 上表面扩散，因为成角度部分81阻止了细胞和培养基105在部分84上汇聚。当如图12a、 12b和15所示，颈瓶110处于使用状态时，基板90的第一部分86是装置110的内部120的 最低部分。如图16a和16b所描述的，当颈瓶110置于如图16a所示的一侧时，每个托盘均等 地填充培养基105。可替代地，当颈瓶110置于如图16b所示的垂直位置时，每个托盘也均 等地填充培养基105。如图10、1 和12b所示，内部120的一部分容纳一个或多个细胞生长托盘92。这 些托盘具有基本上平坦的底部部分76，以向上成角度地离开每个托盘92的基本平坦底部 76的基本平展的唇部分78，以及围绕托盘92周围的侧壁97。唇部分78具有内部边缘部分 99。托盘92的侧壁97的数量与颈瓶110的侧壁的数量在数目上相同。托盘的前侧壁87与托盘92的其它侧壁97的不同在于，其为向外成角度并远离托盘底面部分的唇78的内部 俯冲曲线边缘99。当托盘布置在颈瓶110中时，前侧壁87以及唇部分78的内部曲线边缘 99提供了细胞、液体和气体105进入每个托盘的开放或缺口区域89。
上面阐明的公开内容可包含多个具有独立实用性的不同发明。虽然每一个发明已 以其优选的形式公开，但是由于多种变化都是可能的，所以其中在此公开和阐明的特定实 施方式不认为有限制意义。发明的主题包括在此公开的多种元件、特征、功能和/或特性的 所有新颖的和非显而易见的组合及子组合。下面的权利要求特别指出了认为是新颖及非显 而易见的特定组合及子组合。在特征、功能、元件和/或特性的其它组合和子组合中包含的 发明可在从本申请或相关申请中要求优先权的申请中声明。这些权利要求，无论关注于不 同的发明还是相同的发明，无论与原始权利要求的范围相比更宽、更窄、相同或不同，也都 认为包括在现在公开的发明的主题中。
权利要求
1.一种细胞培养颈瓶，其包括盖子，其包括顶板、侧壁和可重复密封的端口 ；用于接收细胞及细胞培养基的中间托盘，其具有底板、下侧、上侧、侧壁，以及缺口区 域，所述缺口区域形成于设置在底板内部的具有向外曲线边缘的内部向上成角度的唇与底 板的邻近向外成角度的侧壁部分之间；以及用于接收细胞及细胞培养基的底部托盘，其包括底板、上侧和侧壁，其中，所述中间托盘置于所述盖子和底部托盘之间，所述中间托盘的缺口区域与所述 盖子上的端口对齐，导致所述端口、中间托盘和底部托盘相互间以流体连通，从而提供了通 向位于每个中间和底部托盘上的细胞及细胞培养基的直接通道。
2.如权利要求1所述的颈瓶，其特征在于，所述颈瓶进一步包括在彼此顶部堆叠的附 加的一个或多个中间托盘，每个中间托盘的缺口区域相互对齐，并且其还与所述盖子上的 端口之间对齐，导致所述端口、堆叠的中间托盘和底部托盘相互间以流体连通，从而提供了 通往位于每个中间和底部托盘上的细胞及细胞培养基的直接通道。
3.如权利要求2所述的颈瓶，其特征在于，在彼此顶部堆叠的每个中间托盘的侧壁不 透液体地密封合并到下一个相邻的中间托盘的下侧。
4.如权利要求2所述的颈瓶，其特征在于，在彼此顶部堆叠的每个中间托盘的侧壁超 声焊接到下一个相邻的中间托盘的下侧，邻近所述盖子的中间托盘的侧壁超声焊接到所述 盖子的下侧，并且所述底部托盘的侧壁超声焊接到相邻的中间托盘的下侧。
5.如权利要求1所述的颈瓶，其特征在于，所述可重复密封的端口由螺纹帽构成。
6.如权利要求5所述的颈瓶，其特征在于，所述螺纹帽包括与内部空间交流的气体可 透过的结构。
7.如权利要求1所述的颈瓶，其特征在于，移液管类装置或注射器用来向中间或底部 托盘添加或从中间或底部托盘移除细胞及细胞培养基。
8.如权利要求7所述的颈瓶，其特征在于，所述颈瓶由聚合物、玻璃或其组合物制成。
9.一种细胞培养颈瓶，包括盖子，其包括顶板、侧壁和可重复密封的端口 ；多个中间托盘，其用来接收细胞及细胞培养基，并且在彼此顶部堆叠，每个托盘具有底 板、下侧、上侧、侧壁，以及缺口区域，所述缺口区域形成于设置在底板内部的具有曲线边缘 的内部向上成角度的唇与底板的邻近向外成角度的侧壁部分之间；和用于接收细胞及细胞培养基的底部托盘，其包括底板、上侧和侧壁，其中，所述多个中间托盘位于所述盖子和底部托盘之间，每个中间托盘的缺口区域彼 此对齐，并且还与所述盖子上的端口之间对齐，导致所述端口、堆叠的多个中间托盘和底部 托盘相互间以流体连通，从而提供了通向位于中间和底部托盘上的细胞及细胞培养基的直 接通道。
10.如权利要求9所述的颈瓶，其特征在于，在彼此顶部堆叠的每个中间托盘的侧壁通 过不透液体的密封封条或粘合剂合并到下一个相邻的中间托盘的下侧；邻近所述盖子的中 间托盘的侧壁通过液体密封封条或粘合剂合并到所述盖子的下侧；并且所述底部托盘的侧 壁通过液体密封封条或粘合剂合并到相邻的中间托盘的下侧。
11.如权利要求9所述的颈瓶，其特征在于，所述可重复密封的端口由螺纹帽构成。
12.如权利要求11所述的瓶子，其特征在于，所述螺纹帽包括与所述内部空间交流的 气透性结构。
13.如权利要求9所述的颈瓶，其特征在于，移液管类似装置或注射器用来向中间或底 部托盘添加或从中间或底部托盘移除细胞及细胞培养基。
14.如权利要求9所述的颈瓶，其特征在于，所述颈瓶由选自包括聚合物、玻璃或其组 合物的组中的材料制成。
15.如权利要求14所述的颈瓶，其特征在于，所述材料是透明、半透明、不透明、单色、 多色或其组合。
16.一种使用多层细胞培养颈瓶的方法，包括a)提供多层细胞培养颈瓶，其包括，i)盖子，其具有顶板、侧壁和可重复密封的端口 ； )用于接收细胞培养基的中间托盘，其具有下侧、上侧、侧壁，以及缺口区域，所述缺 口区域形成于设置在底板内部的具有向外俯冲曲线边缘的内部向上成角度的唇与底板的 邻近向外成角度的侧壁部分之间；和iii)用于接收细胞培养基的底部托盘，其包括底板和侧壁，其中，所述中间托盘位于所述盖子和底部托盘之间，所述中间托盘的缺口区域与盖子 上的端口对齐，导致所述端口、中间托盘和底部托盘相互间以流体连通，从而提供了通向位 于每个中间和底部托盘上的细胞培养基的直接通道；b)提供细胞和细胞培养基；c)采用移液管类装置或注射器通过端口添加细胞及细胞培养基到颈瓶；d)在设定量的时间和设定条件下，细胞在颈瓶中生长，和e)经移液管类装置或注射器通过端口从颈瓶中移除细胞和/或培养基。
全文摘要
本发明是一种细胞培养容器或装置，例如单层或多层颈瓶，包括盖子，接收细胞及细胞培养基的中间托盘，以及底部托盘，其中，所述盖子具有顶板、侧壁和可重复密封的端口；所述中间托盘具有底板、侧壁，以及缺口区域，所述缺口区域形成于设置在中间托盘底板内部的内部向上成角度的唇与中间托盘底板的邻近向外成角度的侧壁部分之间，其中，该唇具有向外的俯冲曲线边缘特征，所述用于接收细胞及细胞培养基的底部托盘包括底板和侧壁。所述中间托盘置于盖和底部托盘之间，以便中间托盘底板的缺口区域与位于盖上的端口对齐，导致所述端口、中间托盘和底部托盘相互间以液体连通，这就提供了直接通道，例如由使用者来移除和/或添加位于每个中间和/或底部托盘上的细胞、细胞培养基和营养物。可替代地，细胞培养颈瓶包括多个在彼此顶部堆叠的多个中间托盘，并且每个中间托盘的缺口区域彼此之间，以及与盖上的端口之间对齐。
文档编号C12M1/24GK102099459SQ200980128086
公开日2011年6月15日 申请日期2009年7月16日 优先权日2008年7月16日
发明者C·斯科特, K·格里尼曾, M·埃梅里克, P·克拉克 申请人:米利波尔公司