专利名称：一种分级结构微载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物分析材料领域，特别是涉及一种分级结构微载体及其制备方法和应用。
背景技术：
自Willhelm Roux于1885年从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养，单层细胞培养技术已有百余年的历史。传统的单层细胞培养技术指的是适用于大多数贴壁依赖性细胞的体外细胞培养方法，这类细胞需要附着于带适量正电荷的固体或者半固体表面上生长。其主要是通过一些传统的培养瓶、多层平板进行培养，但操作比较繁琐，贴附面积有限，传质和传氧差，在实际生产使用中受到极大的限制。近年来，体外三维细胞培养的研究已受到了人们广泛的关注，三维细胞培养是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。与传统的二维-单层细胞培养相比，三维细胞培养中的药物、营养物质和气体扩散属性更接近于活体组织。目前细胞三维培养已广泛用于基础生物学和生物医学研究，它的主要优点是具有良好的结构，能直接反映结构与功能的关系，细胞的形态和微环境更接近体内的状态，而且可以与相邻的细胞建立更为紧密的联系。
很多天然材料已被用来制成细胞微载体并已成功地商业化，现有技术中大多利用球形微载体培养细胞，细胞一般是生长在微载体的表面上，细胞在大规模搅拌悬浮培养时很容易受到巨大的剪切力而发生破损。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种分级结构微载体，该载体为分级结构，能够能较好地维持细胞形态，降低成本，还能提高培养效率。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种分级结构微载体，所述分级结构微载体包括一级结构和二级结构，所述一级结构为利用单乳液微流体制备出的小液滴，所述小液滴尺寸为5-10 μ m ;所述二级结构为通过双乳液微流体内相生成的大液滴，所述大液滴尺寸为200-500 μ m。在本发明一个较佳实施例中，所述分级结构微载体为油溶性微载体，生成所述油溶性微载体的一级结构的单乳液微流控装置为水包油(W/0)型，生成所述油溶性微载体的二级结构的双乳液微流 控装置为水包油包水(W/0/W)型。在本发明一个较佳实施例中，所述分级结构微载体为水溶性微载体，形成所述水溶性微载体的一级结构的单乳液微流控装置为油包水(0/W)型，形成所述水溶性微载体的二级结构的双乳液微流控装置为油包水包油(0/W/0)。在本发明一个较佳实施例中，所述分级结构微载体选自聚二甲基硅氧烷或乙氧基
化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。
在本发明一个较佳实施例中，所述分级结构微载体选自胶原、壳聚糖、海藻酸隹丐、琼脂糖、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺中的一种或多种。在本发明一个较佳实施例中，所述分级结构微载体的二级结构为单囊或多囊。为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是:提供一种制备分级结构微载体的方法，包括以下步骤:
首次，微载体一级结构的制备:根据微载体性质，对微流控装置管道进行亲疏水性修饰，组装合适的单乳液微流控装置，配制互不相溶的分散相和连续相溶液，生成含有小尺寸液滴的乳液；
其次，微载体二级结构的制备:组装合适的双乳液微流控装置，以包含一级结构的乳液作为中间相溶液，配制与之互不相溶的内外相I溶液，通过调节各相溶液的流速，生成包裹若干大尺寸内囊且同时含有一级结构的液滴·；
再次，固化液滴，清洗后，即可获得具有分级结构的微载体。在本发明一个较佳实施例中，所述微流控装置选自协流式或汇聚式微流控装置，所述微流控装置的管道材料选用二氧化硅、特氟龙、聚二甲基硅氧烷中的一种或多种。在本发明一个较佳实施例中，所述亲疏水修饰为在表面修饰上羟基或氨基；所述疏水性修饰为在表面修饰上长链烷烃。为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是:所述分级结构微载体在细胞培养中的应用
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是:所述的分级结构微载体在蛋白质、核酸或细胞的多元检测技术领域中的应用。本发明的有益效果是:本发明将微载体制备成多孔结构，细胞便可进入微载体孔内粘附生长，即可以保护细胞免受搅拌剪切力的伤害，又可以增加细胞粘附的表面积，能够能较好地维持细胞形态，降低成本，还能提高培养效率。
图1是本发明分级结构微载体及制备方法的示意 图2是本发明为制备分级结构微载体二级结构的乳液示意 图3是本发明双乳液微流体装置示意 图4是本发明分级结构微载体示意 附图中各部件的标记如下:1、外相；2、内相；3、中间相；5、一级结构；6、二级结构。下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。请参阅图1-4，本发明实施例提供如下技术方案
在一个实施例中，提供一种分级结构微载体，所述分级结构微载体包括一级结构5和二级结构6，所述一级结构5为利用单乳液微流体制备出的小液滴，所述小液滴尺寸为5-10 μ m ;所述二级结构6为通过双乳液微流体内相2生成的大液滴,所述大液滴尺寸为200-500 μ mD优选的，所述分级结构微载体为油溶性微载体，生成所述油溶性微载体的一级结构5的单乳液微流控装置为水包油(W/0)型，生成所述油溶性微载体的二级结构6的双乳液微流控装置为水包油包水(W/0/W)型。优选的，所述分级结构微载体为水溶性微载体，形成所述水溶性微载体的一级结构5的单乳液微流控装置为油包水(0/W)型，形成所述水溶性微载体的二级结构6的双乳液微流控装置为油包水包油(0/W/0)。优选的，所述分级结构微载体选自聚二甲基硅氧烷或乙氧基化三羟甲基丙烷三丙稀Ife酷。优选的，所述分级结构微载体选自胶原、壳聚糖、海藻酸钙、琼脂糖、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺中的一种或多种。优选的，所述分级结构微载体的二级结构6为单囊或多囊。在另一个实施例中，提供一种制备分级结构微载体的方法，包括以下步骤:
首先，微载体一级结构5的制备:根据微载体性质，对微流控装置管道进行亲疏水性修饰，组装合适的单乳液微流控装置，配制互不相溶的分散相和连续相溶液，生成含有小尺寸液滴的乳液；
其次，微载体二级结构6的制备:组装合适的双乳液微流控装置，以包含一级结构的乳液作为中间相3溶液，配制与之互不相溶的内外相I溶液，通过调节各相溶液的流速，生成包裹若干大尺寸内囊且同时含有一级结构的液滴。再次，固化液滴，清洗后 ，即可获得具有分级结构的微载体。。优选的，所述微流控装置选自协流式或汇聚式微流控装置，所述微流控装置的管道材料选用二氧化硅、特氟龙、聚二甲基硅氧烷中的一种或多种。优选的，所述亲疏水修饰为在表面修饰上羟基或氨基；所述疏水性修饰为在表面修饰上长链烷烃。在另一个实施例中，本发明采用的技术方案是，所述分级结构微载体在细胞培养中的应用
在另一个实施例中，本发明采用的技术方案是，所述的分级结构微载体在蛋白质、核酸或细胞的多元检测技术领域中的应用。所述分级结构微载体的各级结构都是通过微流体的方法制备而成的；通过微流体制备所述具有分级结构的微载体的方法如下:首先利用单乳液的三维微流控装置生成含有小尺寸单分散液滴的乳液，一级结构5即为小尺寸液滴,然后将含有小尺寸液滴的乳液作为双乳液微流控装置的中间相3溶液，二级结构6即为双乳液微流体内相2生成的大尺寸液滴，由此固化后形成具有分级结构的微载体。本发明首先通过单乳液微流体制备出含有许多单分散小尺寸液滴的乳液，然后将此乳液作为双乳液微流体的中间相3溶液，通过双乳液间的剪切作用以及各相溶液流速的控制，形成包裹了若干个大尺寸内囊(二级结构6)的微载体，这些微载体中同时还含有许多作为一级结构5的小尺寸液滴。这样具有分级结构的微载体是一种能符合细胞培养，蛋白质，核酸以及细胞多元检测等要求的复合微载体。本发明设计组装合适的单乳液微流控装置，形成许多单分散的小尺寸液滴，然后此乳液作为双乳液微流体的中间相3溶液，通过调节各相溶液的流速，生成包含若干个大尺寸内囊的液滴，同时含有许多小尺寸内囊。固化清洗后，即可形成符合细胞培养以及蛋白质、核酸及细胞检测等要求的聚合物微载体。
本发明分级结构微载体及其制备方法包括设计组装合适的单乳液微流控装置，生成包含许多单分散小尺寸液滴的乳液，以此作为双乳液微流体的中间相3溶液，利用各相溶液之间的剪切作用和各相溶液流速的控制，生成包含若干个大尺寸内囊的液滴，这些液滴内同时含有小尺寸内囊，固化液滴，清洗后即可得到具有分级结构的微载体，该微载体能符合细胞培养及蛋白质、核酸、细胞等多元检测的要求。分级结构微载体及其制备方法，应根据微载体的性质，选择相应的微流体。可为油溶性微载体，选择水包油(w/0)单乳液微流体生成一级结构5，选择水包油包水(W/0/W)双乳液微流体形成二级结构6。也可为水溶性微载体，应选择对应相反的微流体。该具有分级结构的微载体具有一定的生物学应用。通过调节制备一级结构5和二级结构6微流体各相溶液的流速，可控制其在固化后形成大小不一的贯穿多孔分级结构，这样的分级微载体可用于细胞培养及蛋白质、核酸及细胞的多元检测中。微载体大小不一的多孔结构可以粘附细胞或固定生物分子，便于结合、反应或进一步的检测。具有分级结构的微载体在进行生物学应用时，细胞可以通过其大小不一的孔洞进入微载体内部，大尺寸孔洞可以作为细胞粘附、生长和增殖的支架，小尺寸孔洞可以为细胞提供营养物质及氧气，由此，该具有分级结构的微载体可以成为一种优良的细胞培养支架材料。本发明分级结构微载体及其制备方法，由于其可通过微流体准确的调节各相流速，控制生成小尺寸及大尺寸内囊的大小和数量，因此能制备出具有分级结构的微载体，并在固化后形成具有大小不一的贯穿多孔微载体。在生物学应用中，一般的球载体培养细胞时，细胞通常是生长在微载体的表面，呈单层生长，细胞易受搅拌悬浮培养时巨大的剪切力而发生破损。而利用具有分级结构的微载体培养细胞时，细胞可以通过其大小不一的内囊进入微载体内部，大尺寸内囊可以作为细胞粘附、生长和增殖的支架，小尺寸内囊可以为细胞提供氧气及营养物质，如此可以实现贴壁细胞的悬浮化大规模培养，并且在大尺寸内囊中细胞有生成团聚体的机会，因此，这种具有分级结构的微载体可成为一种优良的细胞培养支架材料。本发明分级结构微载体是通过微流体技术制备而成的，其材料本身选择范围广，可以选择易获得、生物相容性良好的天然材料，也可选择易合成、可控性强的人工合成材料。由于微流体技术的高 度可控性，能够制备出具有分级结构的微载体，在固化后形成大小不一的贯穿多孔结构，可作为一种优良的细胞培养支架材料。同时，这种微载体还能够通过一些物理或化学方法对其表面进行改性，不仅可更好的适用于生物分析，还适用于蛋白质、核酸或细胞的多元检测等领域。
具体实施例方式应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例1乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(ETPTA)分级结构微载体的制备:
1.ETPTA微载体一级结构5的制备:选择W/，单乳液玻璃毛细管微流控装置，用十八
烷基三甲氧基硅烷的2%-10%丙酮溶液对外相I玻璃毛细管作疏水处理。利用玻璃毛细管、载玻片、盖玻片、点样针头和速干胶组装玻璃毛细管微流控芯片。内相2为2wt%的F108溶液，外相I为含有1%光引发剂的ETPTA溶液。将装有两相溶液的注射器连接至微流控芯片上相应的玻璃毛细管通道。调节好两相流速，生成含有5-10 μ m小水滴的ETPTA乳液，收集保存。2.ETPTA微载体二级结构6的制备:选择W/0/W型的双乳液玻璃微流控装置，对中间相3毛细管作疏水处理，用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的2%-10%乙醇溶液进行对外相I毛细管作亲水处理。内相2为2wt%的F108溶液，中间相3为含有许多5_10 μ m小水滴的ETPTA乳液，外相I为2wt%PVA和2%wt F108以1:1体积比的混合溶液。微流控装置用黑胶带或锡纸将芯片和所有通中间相3ETPTA的管道和注射器包裹起来，防止紫外固化时，堵塞装置。将装有各相溶液的注射器连接至微流控芯片上相应的玻璃毛细管通道。调节三相流速，至微流体能稳定生成包裹若干个大尺寸内囊，且同时含有许多小水滴的ETPTA液滴。3.ETPTA分级结构微载体的制备:在收集管末端放置收集容器，其中预先放入外相I溶液，并使收集管末端浸入液面以下，在实验人员穿戴好紫外光防护用品后，打开紫外光点固化系统光源，照射收集管。可以根据需要调整紫外光的强度与照射距离，以使收集的载体完全固化。收集到的ETPTA分级结构微载体利用纯水、乙醇多次清洗后保存。实施例2聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)分级结构微载体的制备:
1.PEGDA微载体一级结构5的制备:选择0/W单乳液玻璃毛细管微流控装置，利用玻璃毛细管、载玻片、盖玻片、点样针头和速干胶组装玻璃毛细管微流控芯片。内相2为粘度较低的KF-96 (0.65CST)与表面活性剂KF6015的混合溶液，外相I为含有1%光引发剂的PEGDA水凝胶聚合前体溶液。将装有两相溶液的注射器连接至微流控芯片上相应的玻璃毛细管通道。调节好两相流 速，生成含有5-10 μ m小油滴的PEGDA乳液，收集保存。2.PEGDA微载体二级结构的制备:选择0/W/0型的双乳液玻璃微流控装置，用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的2%-10%乙醇溶液进行对中间相3毛细管作亲水处理，十八烷基三甲氧基硅烷的2%-10%丙酮溶液对外相I毛细管进行疏水处理。内相2为粘度较低的KF-96 (0.65CST)与表面活性剂KF6015的混合溶液；中间相3为含有5_10 μ m小油滴的PEGDA水凝胶聚合前体溶液；外相I为粘度较高的KF-96 (50CST)和表面活性剂KF6011的混合溶液。微流控装置用黑胶带或锡纸将芯片和所有通中间相3PEGDA的管道和注射器包裹起来，防止紫外固化时，堵塞装置。将装有各相溶液的注射器连接至微流控芯片上相应的玻璃毛细管通道。调节三相流速，至微流体能稳定生成包裹若干个大尺寸内囊，且同时含有许多小油滴的PEGDA液滴。3.PEGDA分级结构微载体的制备:在收集管末端放置收集容器，其中预先放入外相I溶液，并使收集管末端浸入液面以下，在实验人员穿戴好紫外光防护用品后，打开紫外光点固化系统光源，照射收集管。可以根据需要调整紫外光的强度与照射距离，以使收集的载体完全固化。收集到的PEGDA分级结构微载体利用纯水、乙醇多次清洗后保存。实施例3 ETPTA分级结构微载体用于三维细胞培养
1.ETPTA分级结构微载体的制备:利用0/W型单乳液微流体制备包含许多小水滴的ETPTA乳液，并以此作为W/0/W型双乳液微流体的中间相3溶液，制备包裹若干个大水滴，同时含有许多小水滴的ETPTA分级结构微载体，固化后微载体成为大小不一的贯穿多孔分级结构。
2.ETPTA分级结构微载体的消毒灭菌:利用氧等离子体处理仪使微载体表面羟基化，然后将其浸泡于75%酒精溶液中过夜，再用无菌的PBS (PH=7.4)反复清洗，并浸泡在PBS中紫外照射3h。3.细胞接种:将无菌的ETPTA分级结构微载体置于六孔板中，将消化好的细胞接种至六孔板内，轻微摇晃六孔板:T4h，使细胞与微载体充分接触，将其置于细胞培养箱(37 0C，5%C02)，培养24-48h。也可直接放入微载体培养瓶中进行大规模悬浮培养。4.细胞观察:经过培养之后，利用光学显微镜观察细胞是否已粘附于ETPTA分级结构微载体孔内生长。5.细胞表征和生物学功能的检测:对细胞进行染色，利用荧光显微镜判断细胞的存活率；或利用扫描电子显微镜观察细胞生长的形态和趋势。利用试剂盒对细胞的各项生物学指标进行测定，以评价这种分级结构微载体培养细胞对细胞生物学功能的影响。本发明通过分级结构微载体，能够能较好地维持细胞形态，降低成本，还能提高培
养效率。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范 围内。
权利要求
1.一种分级结构微载体，其特征在于，所述分级结构微载体包括一级结构和二级结构，所述一级结构为利用单乳液微流体制备出的小液滴，所述小液滴尺寸为5-10 μ m ;所述二级结构为通过双乳液微流体内相生成的大液滴，所述大液滴尺寸为200-500 μ m。
2.根据权利要求1所述的分级结构微载体，其特征在于，所述分级结构微载体为油溶性微载体，生成所述油溶性微载体的一级结构的单乳液微流控装置为水包油(W/0)型，生成所述油溶性微载体的二级结构的双乳液微流控装置为水包油包水(W/0/W)型。
3.根据权利要求1所述的分级结构微载体，其特征在于，所述分级结构微载体为水溶性微载体，形成所述水溶性微载体的一级结构的单乳液微流控装置为油包水(0/W)型，形成所述水溶性微载体的二级结构的双乳液微流控装置为油包水包油(0/W/0)。
4.根据权利要求2所述的分级结构微载体，其特征在于，所述分级结构微载体选自聚二甲基硅氧烷或乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。
5.根据权利要求3所述的分级结构微载体，其特征在于，所述分级结构微载体选自胶原、壳聚糖、海藻酸钙、琼脂糖、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的分级结构微载体，其特征在于，所述分级结构微载体的二级结构为单囊或多囊。
7.一种制备权利要求1-6任一所述的分级结构微载体的方法,其特征在于,包括以下步骤: 首先，微载体一级结构的制备:根据微载体性质，对微流控装置管道进行亲疏水性修饰，组装合适的单乳液微流控装置，配制互不相溶的分散相和连续相溶液，生成含有小尺寸液滴的乳液； 其次，微载体二级结 构的制备:组装合适的双乳液微流控装置，以包含一级结构的乳液作为中间相溶液，配制与之互不相溶的内外相I溶液，通过调节各相溶液的流速，生成包裹若干大尺寸内囊且同时含有一级结构的液滴； 再次，固化液滴，清洗后，即可获得具有分级结构的微载体。
8.根据权利要求7所述的制备权利要求1所述的分级结构微载体的方法，其特征在于，所述微流控装置选自协流式或汇聚式微流控装置，所述微流控装置的管道材料选用二氧化硅、特氟龙、聚二甲基硅氧烷中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的制备权利要求1所述的分级结构微载体的方法，其特征在于，所述亲疏水修饰为在表面修饰上羟基或氨基；所述疏水性修饰为在表面修饰上长链烷烃。
10.如权利要求1-6任一所述的分级结构微载体在细胞培养中的应用。
11.如权利要求1-6任一所述的分级结构微载体在蛋白质、核酸或细胞的多元检测技术领域中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种分级结构微载体及其制备方法和应用，所述分级结构微载体包括一级结构和二级结构，所述一级结构为利用单乳液微流体制备出的小液滴，所述小液滴尺寸为5-10μm；所述二级结构为通过双乳液微流体内相生成的大液滴，所述大液滴尺寸为200-500μm；制备方法包括首先，微载体一级结构的制备；其次，微载体二级结构的制备；再次，固化液滴；所述微载体在细胞培养中及蛋白质、核酸或细胞的多元检测技术领域中的应用。
文档编号C12Q1/02GK103146636SQ20131005838
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月25日 优先权日2013年2月25日
发明者赵远锦, 刘玮, 商珞然, 程瑶, 顾忠泽 申请人:东南大学