专利名称：一种有效的稻曲病菌分离方法
技术领域：
本发明涉及一种有效的稻曲病菌分离方法，属于微生物技术领域。
背景技术：
水稻稻曲病俗称丰收病，为水稻穗部的一种重要病害，其病原菌为半知菌亚门绿核菌氣绿核M Ustilaginoidea virens (Cook.)Tak。近年来,随着密穗型高产优质稻的大力推广，稻曲病发生面积及为害程度逐渐加重，稻曲病的发生对水稻产量和品质有明显影响，田间病穗上的稻曲球数量通常在I 10粒，多的会达到30 50粒，稻曲球厚垣孢子粉呈墨绿色或黑色，混入稻谷后严重污染稻谷，影响米质和外观，而且混杂于病稻谷中的稻曲球及病菌含有对人畜有毒害作用的毒素，稻曲病现已成为水稻生产上的重要病害，严重制约着我国水稻的安全生产。目前用于稻曲病菌分离的材料有稻曲球及菌核(由少数稻曲球产生)，但相对于菌核而言，田间稻曲球数量多，容易采集。在不同生境病菌、同一稻曲球不同单孢分离物的遗传多样性、变异机制及致病性研究方面，采用稻曲球作为病菌分离的材料显示出更为重要的作用。稻曲病菌属于一种寄生性较强腐生性较弱的真菌，稻曲球营养丰富，常伴生大量的腐生细菌、真菌及其它病原菌，加之该菌生长缓慢，分离过程中容易受到杂菌污染，分离成功率很低。目前利用稻曲球分离病菌的方法有组织分离法、孢子振落法、厚垣孢子悬浮液法，其中稻曲球内层组织分离法多被研究者所采用。然而在实际操作过程中，所需的培养时间较长，分离速度较慢，成功率较低，因其常伴随其它细菌、真菌等杂菌的出现，影响稻曲病菌进一步分离和纯化的效果。孢子振落法，是直接将稻曲球表面的厚垣孢子直接振落至分离用的培养基上，由于稻曲表面不作消毒处理，稻曲表面大量的杂菌也易被振落在培养基表面上，并快速生长，影响厚垣孢子萌发、生长及菌落的纯化。厚垣孢子悬液法，因混于培养基中的厚垣孢子须萌发成菌丝穿过培养基，延长了厚垣孢子形成单菌落的时间，易导致生长速度过快的杂菌覆盖于少量馒头状的单菌落上，加大分离纯化的难度。刘明霞2009分别采用组织分离法和厚垣孢子悬液法对稻曲球病菌进行分离，结果表明两种方法分离的成功率分别只有8.5%和5.3% (刘明霞，2009，稻曲病菌分离技术、培养条件研究，辽宁农业科学，2009.(6):20-22)。一种简便的稻曲病菌快速分离法(ZL201010301356.0)为申请者一个发明专利，其主要技术特点是稻曲球表面消毒剂处理后，用无菌水捣碎稻曲球，使捣碎液含有厚垣孢子和内层组织块，然后用捣碎液冲洗分离用的胁本哲氏培养基表面，能快速地分离出稻曲病菌，但该方法在分离过程中使用了乙醇和升汞消毒剂，由于厚垣孢子对消毒剂较为敏感(王永强，2010，稻绿核菌(稻曲病菌)分离方法的比较研究，菌物学报2010，29 (1)，采用此法对存放时间较长、厚垣孢子萌发力较低的稻曲球病菌分离有明显的影响。田间采集的稻曲球存放3个月，其表面的厚垣孢子仍具有一定的萌发能力，稻曲球表面虽有较多的杂菌伴生，但种群数量不及厚垣孢子，因此本发明的目的是在专利ZL201010301356.0技术特征基础上，利用 稻曲球厚垣孢子的萌发特性及其数量优势，通过技术改进，弱化稻曲球厚垣孢子中杂菌的干扰作用，同时避免消毒剂对厚垣孢子的杀伤作用，增加分离的成功率，减少分离过程和步骤，而提供一种更为简便、更为有效的稻曲病菌分离方法，供稻曲病研究工作者使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更为简便、有效的稻曲病菌分离方法，在短期内可从稻曲球中大量、快速地分离出稻曲病菌，为稻曲病菌的研究提供基础。本发明的目的是通过如下步骤来实现:
(1)稻曲球标样选择:选取从田间采集的新鲜的黄色、黄绿色或绿色稻曲球，或选取用纸袋分装晾干，常温或4°C冰箱保存，保存时间不超过3个月的稻曲球；
(2)厚垣孢子悬浮液的制备:用无菌挑针刮取单粒稻曲球表面上的厚垣孢子粉，置于无菌培养皿中,加入0.5mL的无菌水悬浮制成厚垣孢子悬浮液；
(3)厚垣孢子悬浮液的稀释:将厚垣孢子悬浮液与无菌水按1:5比例稀释2 3个梯度后备用；
(4)稻曲病菌分离:用移液枪吸步骤(3)已稀释好的厚垣孢子悬浮液0.2mL于分离用胁本哲氏固体培养基表面，并用无菌玻璃三角棒均匀涂抹，再将含有上述培养基的培养皿倒置放入恒温箱中28°C黑暗培养，逐日观察分离结果；
(5)稻曲病菌纯化:培养第6天后，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落移至培养用PSA固体培养基中纯化培养10天；
(6)稻曲病菌保存:依据病菌在培养基的生长特性及其显微观察结果，将稻曲病菌移至PSA斜面培养基中培养10天后，保存于4°C冰箱中。所述分离用胁本哲氏培养基的配方为:马铃薯300g、蛋白胨5g、蔗糖15g、Ca(NO3)2 4H20 0.5g、Na2HPO4 12H20 2.0g、琼脂 16g、加水定容至 lOOOmL，在 121°C下高压湿热灭菌20 25min，待培养基冷却至45°C 50°C时加入抑制细菌生长的氯霉素50 y g/ml混勾，倒入培养皿中凝固后备用。所述培养用PSA固体培养基的配方为:马铃薯200g、琼脂20g、蔗糖20g、加水定容至1OOOmL,在121°C下高压湿热灭菌20min后备用。采用本发明对于烟粉風寄生菌腊阶轮枝菌(K6 r(ici77iw Iecanii)(从被感染的烟粉風若虫体表)的分离、对于稻痕病菌iiyricuInrin grisea)(感染病菌的穗颈痕枝梗保湿24后，能产生大量分生孢子)的单孢分离也较为适用。本发明利用存放3个月之内稻曲球厚垣孢子的萌发特性及其种群数量优势，采用厚垣孢子粉的挑钍刮取和无菌水梯度稀释技术减少厚垣孢子悬浮液中杂菌数量，弱化杂菌的干扰效果，同时避免了消毒剂对厚垣孢子的杀伤作用，保障了厚垣孢子原有的萌发能力，而提供一种更为简便、省材、实用、有效的稻曲病菌分离方法。
图1为稻曲病菌的单孢分离物；A表示分离培养第6天的单孢小菌落，平皿无污染；B表示分离培养第6天的单孢小菌落，平皿有污染，但不影响菌落的纯化；C表示分离培养第10天的单孢菌落,菌落形态清晰。图2为稻曲病菌平板培养的菌落形态。
图3为稻曲病菌液体培养的形态。图4为稻曲病菌菌丝及其分生孢子。图5为稻曲病菌分生孢子萌发图，从左至右分别表不分尚病菌萌发12h、分尚病菌萌发24h、 已知病菌萌发24h。
具体实施例方式实施例1
(I)稻曲球标样来源:常温下保存3个月的稻曲球。(2)培养基配制
A:分离用的培养基采用胁本哲氏培养基:马铃薯300g、蛋白胨5g、蔗糖15g、Ca(N03) 2 4H20 0.5g、Na2HP04 12H:0 2.0g、琼脂 16g、加水定容至 IOOOmL0 培养基在121°C下高压湿热灭菌20min，待培养基冷却至45°C 50°C时加入抑制细菌生长的氯霉素(50ug/ml)混匀，并倒入培养皿中，培养基凝固后备用。B:培养用的培养基采用PSA固体培养基、PS液体培养基。PSA固体培养基为马铃薯200g、琼脂20g、蔗糖20g、加水定容至lOOOmL。PS液体培养基为马铃薯200g、蔗糖20g、加水定容至lOOOmL。以上培养基均在121°C下高压湿热灭菌20min后备用。(3)厚垣孢子悬浮液的制备:用无菌镊子夹住稻曲球，用无菌挑针将稻曲球表面某一处的厚垣孢子粉刮取少许(约0.005g),使之置于无菌培养皿(直径=8.9cm)中，加入
0.5mL的无菌水悬浮，制成厚垣孢子悬浮液。在1.8mL的Eppendorf管中，用移液枪吸取
0.1ml厚垣孢子悬浮液与0. 5ml无菌水按1:5比例稀释3个梯度后备用，使稀释液中厚垣孢子粉的最终浓度约为4.6X l(T5g/mL。(4)稻曲病菌分离:用移液枪吸已稀释好的厚垣孢子悬浮液0.2mL于分离用的胁本哲氏固体培养基表面，并用无菌玻璃弯棒均匀涂抹。将含有培养基的培养皿倒置放入恒温箱中28°C黑暗培养，逐日观察分离结果。(5)稻曲病菌纯化:培养第6天后，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落(如图1所示)移至培养用PSA培养基中纯化培养10天。(6)稻曲病菌保存:依据病菌在培养基的生长特性及其显微观察结果，将稻曲病菌移至PSA斜面培养基中培养10天后，保存于4°C冰箱中。(7)稻曲病菌生长及显微观察
取纯化培养7天的病菌进行平板培养现状观察，观察菌落形态特征及生长速度，如图2所示；挑取纯化培养的病菌菌块接种于PS液体培养基中，28°C振荡培养7 10天后，分别观察菌丝球的形态及菌丝产孢情况。(8)分生孢子萌发特性观察
吸取少量的PS液体培养基振荡培养10天的分生孢子液于PSA固体培养基表面,均勻涂抹后，将含有培养基的培养皿倒置放入恒温箱中28°C黑暗培养12h或24 h，400倍镜下观察稻曲病菌分生孢子的萌发情况，并与已知稻曲病菌的分生孢子萌发特征作比较。如图3、4、5所示，依据分离物培养特征观察、孢子形态显微观察及其分生孢子萌发特性观察结果，可鉴定出分离物为稻曲病菌。采用稻曲病室内人工接种法，供试的分离物能引起水稻产生稻曲球。(杨秀娟，2011，水稻稻曲病室内人工接种技术.植物保护学报，2011，38(5):395-400),由此表明采用本发明方法从稻曲球上能有效地分离出稻曲病菌。实施例2几种稻曲病菌分离方法结果比较
1、本发明的稻曲病菌有效分离法，其步骤如下:
1)稻曲病菌的分离 同实施例1
2)稻曲病菌生长、分生孢子萌发特性与显微观察 同实施例1
2、厚垣孢子悬液法
参照周永力1999方法(周永力，1999，稻曲病菌分离技术的初探，中国水稻科学，1999.13(3):186-188),即稻曲球用75%乙醇将消毒30s后，再用无菌水洗3次，然后置于Eppendorf管中振荡配制成厚垣孢子悬浮液，取2 3滴滴加在培养皿中，待培养基冷却至45°C 50°C时倒入培养皿中，轻轻摇动使之与孢子悬浮液混匀，待培养基凝固后置于恒温箱中28°C黑暗培养，逐日观察分离结果。3、专利 ZL201010301356.0 分离法
单粒稻曲球用75%乙醇消毒Imin、0.1%升萊消毒2min后,再用无菌水清洗3次。然后置于培养皿中(d=5cm)中，加无菌水4mL，用无菌手术刀捣碎后，即为组织捣碎液(内含厚垣孢子和组织碎块)。再用移液枪吸取捣碎液ImL (含组织碎块)冲洗于含胁本哲氏培养基的培养皿中(d=9cm )，使培养基表面有捣碎液覆盖和组织碎块分散，随后吸去残余的捣碎液。并在操净工作台无菌条件下风干培养基表面水份，风干后的培养皿置于恒温箱中28°C黑暗培养，逐日观察分离结果。4、实施效果
I)本发明的稻曲病菌有效分离法，分离培养第6天后便可见较多形态一致、清晰、无杂菌感染的黄色和白色单菌落，分离纯化容易。这些纯化物经平板培养、液体培养特征、孢子和菌丝显微观察及其分生孢子萌发特性观察均可证实为稻曲病菌。田间采集的稻曲球存放3个月后，其表面的厚垣孢子仍具有较好的萌发能力，稻曲球表面虽有较多的杂菌伴生，但种群数量不及厚垣孢子，操作过程中由于不使用稻曲球表面消毒剂，避免了消毒剂对厚垣孢子的杀伤作用，同时采用稻曲球厚垣孢子粉挑针刮取法和无菌水梯度稀释法减少厚垣孢子悬浮液中的杂菌数量，弱化了厚垣孢子悬浮液中杂菌的干扰作用，使得平板污染较少，甚至无污染，出现的单菌落形态清晰，易于纯化。且厚垣孢子是均匀扩散在培养基表面，保证了厚垣孢子萌发和菌丝生长时的氧气，因而在6天内即可快速分离到稻曲病菌。采用此法对田间刚采集的稻曲球分离效果最好，也特别适用于常温或4°C冰箱存放3个月以内的黄色、黄绿色和绿色的稻曲球病菌分离，分离的标本成功率可达85%以上。2)采用厚垣孢子悬液 法，由于稻曲病菌生长极为缓慢，混于培养基中的厚垣孢子须萌发成菌丝穿过培养基，需10天才长出少量白色单菌落(分布不均匀，菌落出现聚集)，同时出现生长较快的白色或暗绿色杂菌覆盖于馒头状的单菌落上。厚垣孢子对温度较为敏感，28°C后随温度的升高，萌发率急剧下降，45°C几乎不发芽，50°C为致死温度。采用厚垣孢子悬液法与培养基(45°C)混匀法，当培养基温度过高会对孢子有杀伤作用，温度过低引起培养基与孢子悬液法混匀不充分，导致白色单菌落分布不均匀，菌落出现聚集，培养10天时，菌落形成处常出现生长速度过快的杂菌覆盖，增加了稻曲病菌分离纯化的难度。3)采用专利ZL201010301356.0分离法，分离培养第6天后便可见较多形态一致、清晰、无杂菌污染的黄色和白色单菌落，部份组织块长有疑似稻曲病菌的白色菌丝，分离纯化培养容易。这些纯化物经平板培养特征、孢子和菌丝显微观察及其其分生孢子萌发特性观察均可证实为稻曲病菌。由于捣碎液厚垣孢子多，杂菌较少，即使有少量杂菌出现也可通过菌落优势性进行快速区分和初筛，但该方法使用了乙醇和剧毒的升汞消毒剂。厚垣孢子对消毒剂较为敏感，稻曲球表面消毒剂的处理能导致部分厚垣孢子萌发能力的丧失，稻曲球表面清洗也能引起部份具有萌发能力厚垣孢子数量的减少，采用此法对常温存放3个月的稻曲球病菌分离效果较差。从供试68个不同来源的稻曲球标样中能分离出目标菌株的标样有27个，而采用本发明的方法能有效分离出目标菌株的标样有59个。相同稻曲球采用本发明的方法分尚之后，再米用专利ZL201010301356.0分尚法分尚，发现供试的15个标样中，前者有13个标样分离成功，而后者仅7个标样分离成功，平板中分离获得单菌落数明显低于后者。表明本发明的方法更适用于稻曲球病菌的分离，操作上更为简便。本发明的方法是 在专利ZL201010301356.0技术特征基础上，通过技术改进，减少操作步骤，而提供的一种更为简便、实用、有效的稻曲病菌分离方法，具有更为省材、快捷、方便、适用等优点。
权利要求
1.一种有效的稻曲病菌分离方法，其特征在于:按照以下步骤进行: (1)稻曲球标样选择:选取从田间采集的新鲜的黄色、黄绿色或绿色稻曲球，或选取用纸袋分装晾干，常温或4°C冰箱保存，保存时间不超过3个月的稻曲球； (2)厚垣孢子悬浮液的制备:用无菌挑针刮取单粒稻曲球表面上的厚垣孢子粉，置于无菌培养皿中,加入0.5mL的无菌水悬浮制成厚垣孢子悬浮液； (3)厚垣孢子悬浮液的稀释:将厚垣孢子悬浮液与无菌水按1:5比例稀释2 3个梯度后备用； (4)稻曲病菌分离:用移液枪吸步骤(3)已稀释好的厚垣孢子悬浮液0.2mL于分离用胁本哲氏固体培养基表面，并用无菌玻璃三角棒均匀涂抹，再将含有上述培养基的培养皿倒置放入恒温箱中28°C黑暗培养，逐日观察分离结果； (5)稻曲病菌纯化:培养第6天后，用尖头挑针挑取黄色或白色小菌落移至培养用PSA固体培养基中纯化培养10天； (6)稻曲病菌保存:依据病菌在培养基的生长特性及其显微观察结果，将稻曲病菌移至PSA斜面培养基中培养10天后，保存于4°C冰箱中。
2.根据权利要求1所述的有效的稻曲病菌分离方法，其特征在于:所述分离用胁本哲氏培养基的配方为:马铃薯300g、蛋白胨5g、蔗糖15g、Ca(NO3)2 *4H20 0.5g、Na2HPO4 12H202.0g、琼脂16g、加水定容至lOOOmL，在121°C下高压湿热灭菌20 25min，待培养基冷却至45°C 50°C时加入抑制细菌生长的氯霉素50ii g/ml混匀，倒入培养皿中凝固后备用。
3.根据权利要求1所述的有效的稻曲病菌分离方法，其特征在于:所述培养用PSA固体培养基的配方为:马铃薯200g、琼脂20g、蔗糖20g、加水定容至IOOOmL,在121°C下高压湿热灭菌20min后 备用。
全文摘要
本发明涉及一种有效的稻曲病菌分离方法，属于微生物技术领域。用挑针将稻曲球表面的厚垣孢子粉刮取少许置于无菌培养皿中，加入0.5mL的无菌水悬浮厚垣孢子，然后在1.8mL的Eppendorf管中，采用梯度稀释法，使厚垣孢子悬浮液与无菌水按15比例稀释2～3个梯度后，吸0.2mL的厚垣孢子稀释液到分离用的胁本哲氏固体培养基(内含50μg/ml氯霉素)表面，涂抹均匀后，将培养皿倒置放入28℃恒温箱中黑暗培养，第6天后就能有效分离出目标病菌。本发明方法明显弱化了稻曲球厚垣孢子中杂菌的干扰作用，操作程序十分简便，适用于常温或4℃冰箱存放3个月以内稻曲球病菌的分离，对田间刚采集的稻曲球病菌的分离效果最好。
文档编号C12N1/14GK103103136SQ20131005815
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月25日 优先权日2013年2月25日
发明者杨秀娟, 何玉仙, 阮宏椿, 杜宜新, 陈福如 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所