专利名称：一种新型狂犬病病毒假病毒系统及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型狂犬病病毒假病毒系统及其制备与应用。
背景技术：
:狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus, RV)引起的一种人兽共患传染病，一旦发病，病死率几乎100%。发生狂犬病暴露时需要及时进行狂犬病暴露后处置，主要包括接种狂犬病疫苗和注射狂犬病免疫球蛋白制剂，使机体产生或获得狂犬病病毒中和抗体，从而阻止病毒入侵机体。国内人用狂犬病疫苗生产企业普遍应用的狂犬病病毒疫苗株为PV、CTNl、aG，然而国内对这些疫苗株抗原性和保护性的研究资料并不充分，原因在于狂犬病病毒野毒株的分离、培养需要在BSL-3级实验室进行，并且国内分离的狂犬病病毒野毒株数量有限，限制了疫苗接种后野毒攻击试验的开展范围。依据疫苗株和野毒株核酸和氨基酸序列相似性来推导抗原性相似是目前较通用的做法，然而，大量抗狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白单克隆抗体结合试验提示狂犬病病毒野毒株和疫苗株在抗原性方面存在差异，仅依靠序列相似性来推导抗原相似性的做法并不妥当。建立一种行之有效的模型在体外试验水平评估人用狂犬病病毒疫苗株免疫对野毒株的保护效果有一定意义。快速突光灶抑制试验(rapidfluorescent focus inhibition test,RFFIT)是世界卫生组织(World Health Organisation,WHO)推荐的狂犬病病毒中和抗体体外检测方法之一，该方法是在细胞培养基础上进行的微量中和试验，一个流程可在24h内完成，在96孔板上进行适合大批量样品检测，通常用于评价疫苗接种后机体对狂犬病病毒的中和能力。考虑到攻击病毒为野毒株时需要BSL-3级实验室并且野毒株数量有限，如果可以采用狂犬病病毒野毒株的模拟病毒(即狂犬病病毒假病毒)作为攻击病毒，那么一方面可以扩大验证范围，另一方面有可能降低实验所要求生物安全级别。发明内容:假病毒包装系统主要有:以鼠类白血病病毒(murine leukemia virus, MLV)为基础构建的逆转录病毒载体和包装组份；以慢病毒(Ientivirus)，如HIV-1，为基础构建的慢病毒载体和包装组份。以慢病毒载体为基础的假病毒不同于以逆转录病毒载体为基础的假病毒，对分裂期和非分裂期细胞均具有感染能力。利用假病毒模拟病毒包膜糖蛋白活性使一些没有敏感培养细胞系的病毒(如HCV)的中和抗体检测成为可能，也使一些生物安全级别要求较高的病毒(如HIV)的中和抗体检测可以在BSL-2级实验室进行。关于制备狂犬病病毒假病毒进行狂犬病相关研究的报道非常有限和缺乏系统性。为了克服目前狂犬病病毒研究的上述局限性，本发明利用逆转录病毒和慢病毒载体平台构建狂犬病病毒假病毒，并在此基础上摸索将狂犬病病毒假病毒应用于狂犬病病毒中和抗体评价、狂犬病病毒中和性单克隆抗体抗原表位筛选、抗狂犬病病毒药物(进入或融合抑制剂)高通量筛选、新型狂犬病疫苗制备，形成一套全新的狂犬病病毒假病毒构建、制备及应用技术体系。本发明的技术方案如下:一种新型狂犬病病毒假病毒系统，包括含有狂犬病病毒糖蛋白基因的pVRC-RVG系列穿梭质粒与辅助质粒所共同构成的载体系统以及宿主细胞，将载体系统中的穿梭质粒和辅助质粒共同转染宿主细胞后，即可在培养上清中获得狂犬病病毒假病毒。如上述技术方案所述狂犬病病毒假病毒系统，其中，所采用的pVRC-RVG系列穿梭质粒为分别含有狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11、疫苗株PV、CTNU aG的糖蛋白基因序列并能表达相应蛋白的质粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG, pVRC-CTNIG、pVRC-aGG。如上述技术方案所述狂犬病病毒假病毒系统，其中，优选采用慢病毒双质粒系统，慢病毒三质粒系统、逆转录病毒三质粒系统亦可采用。如上述技术方案所述狂犬病病毒假病毒系统，其中，其所述辅助质粒分别为慢病毒双质粒系统的PNL4-3.GFP/Luc.R_E_，慢病毒三质粒系统的pCS_CG+pCMV A R8.2以及逆转录病毒三质粒系统的pMLV-gagpol+pMLV-EGFP。如上述技术方案所述狂犬病病毒假病毒系统，其中，所优选采用的宿主细胞为293FT细胞。 新型狂犬病病毒假病毒的制备方法，包括如下步骤:a、采用pVRC载体构建含有狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11、疫苗株PV、CTNUaG糖蛋白基因的 pVRC-RVG 系列穿梭质粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG, pVRC-CTNIG、pVRC-aGG ；b、与优选采用的辅助质粒共转染宿主细胞；C、培养宿主细胞；d、从培养上清中分离获得假病毒。如上述技术方案所述新型狂犬病病毒假病毒的制备方法，其中，所述pVRC-RVG系列穿梭质粒中，CVS-1l糖蛋白基因(GenBank ID:GQ918139)、PV糖蛋白基因(GenBankID JX276550)、CTN-1 糖蛋白基因(GenBank ID:HQ317918)、aG 糖蛋白基因(GenBank ID:L04522)为首次应用于狂犬病病毒假病毒制备，所述宿主细胞为293FT细胞。应用狂犬病病毒假病毒进行狂犬病病毒中和抗体评价，中和性单克隆抗体抗原表位筛选,抗病毒药物的高通量筛选以及疫苗制备。具体的技术方案如下:构建狂犬病病毒新型假病毒载体、制备狂犬病病毒假病毒颗粒进行狂犬病相关研究的技术体系，包括下述步骤:1、狂犬病病毒新型假病毒系统的构建，包括如下步骤:(I)、穿梭质粒的构建:依据狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11、疫苗株PV、CTNUaG糖蛋白基因和载体PVRC8301质粒(美国国立卫生研究院疫苗研究中心Gary J.Nable教授惠赠)多克隆位点区序列设计引物(CVSG-P1/CVSG-P2、PVG-P1/PVG-P2、CTNG-P1/CTNG-P2、aGG-Pl/aGG-P2)并由北京擎科新业生物技术有限公司合成，在上游引物序列中引入Xba I的酶切序列，在下游引物中引入Bgl II的酶切序列，引物序列如下:CVSG-Pl(SEQ ID NO:1):5' -tatgctctagagcatggttcctcaggttcttttgtttg-31CVSG-P2(SEQ ID NO:2):5' -tatgaagatcttctcacagtctgatctcacctccac-31
PVG-Pl(SEQ ID NO:3):5' -tatgctctagagcatggttcctcaggctctcctg-3'PVG-P2(SEQ ID NO:4):5' -tatgaagatcttctcacagtccggtctc-31CTNG-Pl(SEQ ID NO:5):5' -tatgctctagagcatgattcctcaagctctgttgtttg-31CTNG-P2(SEQ ID NO:6):5' -tatgaagatcttcttacagcttggtctcacctccgc-31aGG-Pl (SEQ ID NO:7):5' -tatgctctagagcatggttcctcaagctcttttgcttg-31aGG_P2 (SEQ ID NO:8):5' -tatgaagatcttctcacagttcagtcacacccccaa-3'从CVS-11、PV、CTNl、aG细胞培养上清提取总RNA，采用invitrogen公司Superscript II逆转录 试剂盒构建反转录cDNA文库。以反转录cDNA为模板，PCR扩增CVS-11, PV、CTNU aG 糖蛋白基因，CVSG-PI/CVSG-P2, PVG-P1/PVG-P2、CTNG-P1/CTNG-P2、aGG-Pl/aGG-P2 成对引物PCR反应条件相同，94°C 3min ；94°C 40sec，54°C 50sec，72°C 2min,共35个循环，72°C延伸IOmin。PCR产物凝胶回收产物和PVRC8301载体质粒稀释至适宜浓度，采用限制性核酸内切酶Xba I和Bgl II进行酶切，37°C 2h，酶切后的PCR产物和pVRC8301载体以T4DNA连接酶在4°C下过夜连接，分别构建携带CVS-1l糖蛋白基因(GenBank ID:GQ918139)、PV糖蛋白基因(GenBank ID JX276550)、CTN_1 糖蛋白基因(GenBank ID:HQ317918)、aG 糖蛋白基因(GenBank ID:L04522)的穿梭质粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG、pVRC-CTNIG、pVRC-aGG (为表达方便，后文统一以pVRC-RVG代替)。(2)、狂犬病病毒假病毒包装系统的选择:依据容易获得、代表性好、操作便捷、经验成熟的原则，从实验室载体库中选择“PNL4-3.GFP/Luc.R_E_+pVRC-RVG”慢病毒双质粒系统(pNL4_3.GFP/Luc.R-E-由美国 NIH AIDS Research&Reference Reagent Program 免费提供)、“pCS-CG+pCMV A R8.2+pVRC-RVG” 慢病毒三质粒系统(pCS_CG 与 pC MV A R8.2 购自美国invitrogen公司)、“pMLV-gagpol+pMLV_EGFP+pVRC-RVG”逆转录病毒三质粒系统(pMLV-gagpol与pMLV-EGFP由法国巴斯德研究所Jacob Francois教授免费提供)用于狂犬病病毒假病毒包装。其中PNL4-3.GFP/Luc.R-E-双质粒慢病毒载体系统操作最便捷，该载体以编码HIV-1原病毒(provirus)的全长质粒pNL4_3为基础，将GFP/Luc基因插入NEF基因读码框内(5'端酶切位点NotI，3'端酶切位点XhoI)，并通过ENV和VPR基因5'端的移码突变使得ENV和VPR蛋白缺陷，需要外源膜蛋白基因共转染才能包装出子代假病毒颗粒，通过改变膜蛋白基因可产生不同特征的假病毒颗粒。(3)、转染试剂的选择:选择 Fugene HD、Nanojuice、Lipofectamine2000 三种转染试剂，比较不同转染试剂对狂犬病病毒假病毒包装效率的影响。上述技术方案中所述方法，其中，所述穿梭质粒的构建中狂犬病病毒株选择原则为兼顾国内主流疫苗株(PV、CTNl、aG)和标准攻击毒株(CVS-1l)，以便对比不同疫苗株免疫后机体中和抗体对标准攻击毒株的中和能力；所述转染试剂筛选过程为:取I u gpMLV-EGFP 质粒，分别米用 Fugene HD> Nanojuice、Lipofectamine2000 转染 293FT 细胞，转染后观察荧光显色293FT细胞比例，判定不同转染试剂对pMLV-EGFP质粒转染效率的影响。2、狂犬病病毒假病毒颗粒的制备和敏感细胞系的选择，包括如下步骤:(I)、如上采用pVRC8301载体构建含有狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11、疫苗株PV、CTNU aG 糖蛋白基因的 pVRC-RVG 系列穿梭质粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG、pVRC-CTNIG、pVRC-aGG ；(2)、与优选采用的辅助质粒共转染宿主细胞；(3)、培养宿主细胞；(4)、从培养上清中分离获得假病毒；(5)、假病毒敏感细胞系的选择:以狂犬病病毒CVS-1l假病毒感染293FT、MNA、BHK-21、BSR、Hu7-CD81、A549细胞，对比不同细胞系对狂犬病病毒CVS-1l假病毒的敏感性。本技术方案中辅助质粒为“pNL4-3.GFP/Luc.R-E-”、“pCS_CG+pCMV A R8.2”或“pMLV-gagpol+pMLV-EGFP”。上述技术方案中所述方法，其中，所述新型狂犬病病毒假病毒的制备方法过程为:将选定 的三个载体系统的各质粒按照分别按照PNL4-3.GFP/Luc.R-E-: pVRC-RVG = I: 1.5、pCS-CG: pCMV A R8.2: pVRC-RVG = I: I: 1.5 以及pMLV-gagpol: pMLV-EGFP: pVRC-RVG = I: I: 1.5 的比例共转染 293FT 细胞，48h 后收获上清，2000g离心5min，取上清分装冻存，上清中含有狂犬病病毒假病毒颗粒；所述敏感细胞系筛选过程为:将 293FT、MNA、BHK-21、BSR、Hu7-CD81、A549 细胞分别以 5，000-10, 000个细胞/孔平行接种于96孔细胞培养板，以同一批制备的狂犬病病毒CVS-1l假病毒平行感染，72h后荧光显微镜下观察，对比不同细胞系对狂犬病病毒CVS-1l假病毒的敏感性。3、狂犬病病毒假病毒在狂犬病相关研究中的应用，可能包括狂犬病病毒中和抗体评价、狂犬病病毒中和性单克隆抗体抗原表位筛选、抗狂犬病病毒药物高通量筛选、新型狂犬病疫苗制备。其中，狂犬病病毒CVS-1l假病毒应用于狂犬病病毒中和抗体评价是核心，为狂犬病病毒假病毒其它应用的基础和必备工作。狂犬病病毒CVS-1l假病毒用于狂犬病病毒中和抗体评价，包括如下步骤:(I)、验证血清样品的选择:共20份人血清样品，为5位狂犬疫苗接种者在接种前的本底血清以及免疫后7d、14d、45d采集的系列血清；(2)、以狂犬病病毒假病毒进行狂犬病毒中和抗体检测:以狂犬病病毒假病毒取代原型狂犬病病毒进行RFFIT，摸索适宜的狂犬病病毒假病毒中和用量、感染细胞系种类、细胞培养时间、结果判读方式；(3)、结果比较:所有人血清样品以狂犬病病毒假病毒进行RFFIT的检测结果和以狂犬病病毒进行RFFIT的检测结果比较，验证检测结果之间的一致性。上述技术方案中所述方法，其中，所述狂犬病病毒假病毒用于狂犬病病毒中和抗体评价的过程为:待测人血清样品做系列1: 3倍比稀释，37°C与狂犬病病毒假病毒共孵育lh，加入MNA细胞，72h后荧光显微镜下计数各孔的荧光显色细胞比例，或用Bright Glo荧光素酶检测试剂裂解细胞，GL0MAX96微孔板发光检测仪读数，套用RFFIT结果计算公式求取中和抗体效价。上述技术方案中所述方法，其中，所述采用“pNL4-3.GFP/Luc.R_E_+pVRC-RVG”慢病毒双质粒系统可以高效包装国内主流狂犬病病毒疫苗株和标准攻击毒株的假病毒颗粒，适于进行狂犬病病毒中和抗体评价，为狂犬病病毒假病毒应用于狂犬病病毒中和性单克隆抗体抗原表位筛选、抗狂犬病病毒药物高通量筛选、新型狂犬病疫苗制备奠定了基础。本发明具有以下有益效果:本发明系统构建了多个狂犬病病毒新型假病毒载体，成功制备了狂犬病病毒假病毒颗粒，该模型有四大优势:一是，即便没有分离到相应狂犬病病毒株也可以模拟研究其糖蛋白抗原性；二是，可以单因素研究外界相关因子对狂犬病病毒糖蛋白的作用，排除了狂犬病病毒其它结构蛋白的影响；三是，狂犬病病毒假病毒滴度较高，浓缩和纯化易于进行，提供了潜在的制备狂犬病疫苗的技术储备；四是，对于狂犬病病毒野毒株进行模拟可以降低实验操作的生物安全级别，便于对狂犬病病毒中和性单克隆抗体进行中和反应谱和抗原表位鉴定。本发明系统地探索了将狂犬病病毒假病毒应用于狂犬病病毒中和抗体评价，为将狂犬病病毒假病毒应用于狂犬病病毒中和性单克隆抗体抗原表位筛选、抗狂犬病病毒药物高通量筛选、新型狂犬病疫苗制备奠定了基础。
:1、图1 为 pNL4-3.GFP/Luc.R-E_+pVRC_CSVG 包装过程图；2、图 2 为 pCS-CG+pCMV A R8.2+pVRC-CSVG 包装过程图；3、图 3 为 pMLV-gagpol+pMLV-EGFP+pVRC-CSVG 包装过程
4、图4为Fugene HD对pMLV-EGFP质粒转染293FT细胞的效果图(200 X)；5、图5为Nanojuice对pMLV-EGFP质粒转染293FT细胞的效果图(200 X)；6、图 6 为 Lipofectamine2000 对 pMLV-EGFP 质粒转染 293FT 细胞的效果图(200X)；7、图7为A549细胞系对狂犬病病毒假病毒的感染效果图(200X)；8、图8为BHK-21细胞系对狂犬病病毒假病毒的感染效果图(200X)；9、图9为BSR细胞系对狂犬病病毒假病毒的感染效果图(200 X)；10、图10为293FT细胞系对狂犬病病毒假病毒的感染效果图(200 X)；11、图11为HU7-OT81细胞系对狂犬病病毒假病毒的感染效果图(200 X)；12、图12为MNA细胞系对狂犬病病毒假病毒的感染效果图(200 X)；13、图13为5名狂犬病疫苗接种者系列血清狂犬病病毒中和抗体评价。
具体实施方式
:为使本发明的技术方案便于理解，以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1:一、狂犬病病毒新型假病毒系统的构建1、穿梭质粒的构建(I)、目的基因片段的扩增:以狂犬病病毒CVS-11、PV、CTNl、aG分别感染BHK-21细胞，感染后72h常规Tizol法提取核酸；采用invitrogen公司Superscript II逆转录试剂盒构建反转录cDNA文库；以反转录cDNA为模板，以CVSG-P1/CVSG-P2、PVG-P1/PVG-P2、CTNG-PI/CTNG-P2、aGG_Pl/aGG_P2为引物(引物序列见序列表中SEQ ID NO:1 8)分别扩增CVS-1U PV、CTNU aG糖蛋白基因，PCR反应条件统一为94°C 3min ；94°C 40sec,54°C 50sec，72°C 2min，共 35 个循环，72°C延伸 lOmin。(2)、携带目的基因的pVRC8301载体的构建:PCR产物凝胶回收产物和pVRC8301载体质粒稀释至适宜浓度，采用限制性核酸内切酶Xba I和Bgl II进行酶切，37°C 2h，酶切后的PCR产物和pVRC8301载体以T4DNA连接酶在4°C下过夜连接，分别构建携带CVS-1l糖蛋白基因(GenBank ID:GQ918139)、PV 糖蛋白基因(GenBank ID JX276550)、CTN-1糖蛋白基因(GenBank ID:HQ317918)、aG糖蛋白基因(GenBankID:L04522)的穿梭质粒pVRC-CVSG、pVRC-PVG、pVRC-CTNIG、pVRC-aGG (为表达方便，后文统一以 pVRC-RVG 代替)。2、狂犬病病毒假病毒包装系统的选择选择“pNL4_3.GFP/Luc.R-E-+pVRC-RVG” 慢病毒双质粒系统、“pCS-CG+pCMV A R8.2+pVRC-RVG”慢病毒三质粒系统、“pMLV-gagpol+pMLV-EGFP+pVRC-RVG”逆转录病毒三质粒系统用于狂犬病病毒假病毒包装，以pVRC-CSVG为例的“pNL4-3.GFP/Luc.R-E-+pVRC-CSVG” 慢病毒双质粒系统、“pCS-CG+pCMV A R8.2+pVRC-CSVG” 慢病毒三质粒系统和“pMLV-gagpoI+pMLV-EGFP+pVRC-CSVG”逆转录病毒三质粒系统的包装过程见图1-图 3。3、转染试剂的选择取I ii gpMLV-EGFP 质粒，分别米用 Fugene HD > Nano juice、Lipof ectamine2000 转染293FT细胞，转然后观察荧光显色293FT细胞比例，判定不同转染试剂对pMLV-EGFP质粒转染效率的影响。结果显示3种转染试剂都显示良好的转染效果，如图4-图6所示，，图4为Fugene HD对pMLV-EGFP质粒转染293FT细胞的效果图，图5为Nanojuice对pMLV-EGFP质粒转染293FT细胞的效果图，图6为Lipofectamine2000对pMLV-EGFP质粒转染293FT细胞的效果图，后续实验常规采用Lipofectamine2000进行质粒转染。二、狂犬病病毒假病毒颗粒的制备和敏感细胞系的选择1、狂犬病病毒假病毒颗粒的制备以Lipofectamine2000作为转染试剂,将选定载体系统的各质粒按照膜蛋白质粒:包装质粒:穿梭质粒比例1:1: 1.5共转染293FT细胞，荧光显微镜下动态观察荧光显色293FT细胞比例，48h收获上清，2000g离心5min，取上清分装冻存。2、狂犬病病毒假病毒敏感细胞系的选择将293FT、MNA、BHK-21、BSR、Hu7_CD81、A549 细胞分别以 5，000-10，000 个细
胞/孔平行接种于96孔细胞培养板，细胞长至80 %满时可用。将“pNL4-3.GFP/Luc.R-E-+pVRC-RVG”慢病毒双质粒系统包被的同一批CVS-1I假病毒进行系列1: 2倍比稀释，每个稀释度每种细胞平行感染2孔，72h后荧光显微镜下观察，对比不同细胞系对CVS-1l假病毒的敏感性。结果显示293FT、MNA、Hu7-⑶81细胞系对CVS-1l假病毒敏感，结果如图7-图12所示，其中图7-12分别为A549、BHK-21、BSR、293FT、Hu7-CD81和MNA6种细胞系对狂犬病病毒假病毒的感染效果图，其中MNA为已知的对狂犬病病毒敏感的细胞系，CVS-1l假病毒1: 16稀释度显示MNA细胞80%感染，可以确定为进行狂犬病病毒中和抗体RFFIT检测的中和病毒用量。三、狂犬病病毒假病毒应用研究的技术基础=CVS-1l假病毒用于RFFIT1、采用CVS-1l假病毒进行RFFIT实验流程的建立在传统RFFIT基础上，采用CVS-1l 假病毒进行RFFIT的方法为:将待测血清样品做系列1: 3倍比稀释，37°C与1: 16稀释的0^-11假病毒共孵育111，加入1^^，7211后荧光显微镜下计数各孔的荧光显色细胞比例，或用Bright Glo荧光素酶检测试剂裂解细胞，GL0MAX96微孔板发光检测仪读数，结果见表1，套用RFFIT结果计算公式求取中和抗体效价。表1GL0MAX96微孔板发光检测仪读数结果
权利要求
1.一种新型狂犬病病毒假病毒系统，包括含有狂犬病病毒糖蛋白基因的pVRC-RVG系列穿梭质粒与辅助质粒所共同构成的载体系统以及宿主细胞，将载体系统中的穿梭质粒和辅助质粒共同转染宿主细胞后，即可在培养上清中获得狂犬病病毒假病毒。
2.如权利要求1所述狂犬病病毒假病毒系统，其特征在于，所采用的pVRC-RVG系列穿梭质粒为分别含有狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11、疫苗株PV、CTNl、aG的糖蛋白基因序列并能表达相应蛋白的质粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG, pVRC-CTNIG、pVRC-aGG。
3.如权利要求1所述狂犬病病毒假病毒系统，其特征在于，优选采用慢病毒双质粒系统，慢病毒三质粒系统、逆转录病毒三质粒系统亦可采用。
4.如权利要求1所述狂犬病病毒假病毒系统，其特征在于，其所述辅助质粒分别为慢病毒双质粒系统的PNL4-3.GFP/Luc.R-E-,慢病毒三质粒系统的pCS_CG+pCMV A R8.2以及逆转录病毒三质粒系统的pMLV-gagpol+pMLV-EGFP。
5.如权利要求1所述狂犬病病毒假病毒系统，其特征在于，所优选采用的宿主细胞为293FT细胞。
6.新型狂犬病病毒假病毒的制备方法，包括如下步骤: a、采用pVRC载体构建含有狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11、疫苗株PV、CTN1、aG糖蛋白基因的 pVRC-RVG 系列穿梭质粒 pVRC-CVSG、pVRC-PVG, pVRC-CTNIG、pVRC-aGG ； b、与优选采用的辅助质粒共转染宿主细胞； C、培养宿主细胞； d、从培养上清中分离获得假病毒。
7.如权利要求6所述新型狂犬病病毒假病毒的制备方法，其特征在于，所述pVRC-RVG系列穿梭质粒中，CVS-1l糖蛋白基因(GenBank ID:GQ918139)、PV糖蛋白基因(GenBankID JX276550)、CTN-1 糖蛋白基因(GenBank ID:HQ317918)、aG 糖蛋白基因(GenBank ID:L04522)为首次应用于狂犬病病毒假病毒制备，所述宿主细胞为293FT细胞。
8.应用狂犬病病毒假病毒进行狂犬病病毒中和抗体评价，中和性单克隆抗体抗原表位筛选，抗病毒药物的高通量筛选以及疫苗制备。
全文摘要
一种新型狂犬病病毒假病毒系统及其制备与应用，属于生物技术领域。本发明包括含有狂犬病病毒糖蛋白基因的pVRC-RVG系列穿梭质粒与辅助质粒所共同构成的载体系统以及宿主细胞，将载体系统中的穿梭质粒和辅助质粒共同转染宿主细胞后，即可在培养上清中获得狂犬病病毒假病毒。本发明可应用于狂犬病病毒中和抗体评价、狂犬病病毒中和性单克隆抗体抗原表位筛选、抗狂犬病病毒药物的高通量筛选、新型狂犬病疫苗制备，为一套全新的狂犬病病毒假病毒构建、制备及应用技术体系。
文档编号C12N7/04GK103173495SQ201310058190
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月25日 优先权日2013年2月25日
发明者谭文杰, 邓瑶, 吕新军, 唐青 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所