专利名称：一种制备胸腺肽α1的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备胸腺肽a I的方法。
背景技术：
1965年Goldestein等人从动物胸腺中分离到有生物活性的多肽类分子，命名为胸腺肽(Thymosin)。1972年Goldestein等进一步纯化所得到的主要分子量在1-15KD的组分，称之为胸腺肽组分5 (Thymosin，TF5)，用于动物研究和临床观察，发现该组分有补偿胸腺功能低下作用。胸腺肽a I (Thymosin a 1，T a I)是胸腺肽组分5(TF5)多肽混合物中活性最强的多肽之一，具有促进T-淋巴细胞分化、成熟和增强细胞免疫的功能，目前国外已将其肽合成产品应用于临床，对肿瘤、乙肝、丙肝及免疫缺陷等的治疗研究并取得了良好的效果。T a I是由28个氨基酸残基组成的酸性多肽，等电点4.2，相对分子量3108。目前主要通过组织提取法和化学合成法获得TaI。组织提取法受到材料来源的限制，通常产品中有效成分含量低，从而影响治疗效果。化学合成法得到的Ta I纯度高，但成本高、价格昂贵，限制了 Ta I的临床应用。有研究人员尝试通过基因工程技术制备Ta 1，但获得的重组蛋白需要进行蛋白酶处理，而且纯化方法采用了亲和层析或离子交换等方法，所以生产成本依然居高不下。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备胸腺肽a I的方法。本发明提供的制备胸腺肽a I的方法，依次包括如下步骤:(I)培养重组菌后收集菌体并进行超声破碎；所述重组菌为将含有胸腺肽a I基因的重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌；(2)升温至75°C并静置30分钟，收集上清液；(3)用截留分子量为10000道尔顿的滤膜进行超滤，收集滤液，即为胸腺肽a I溶液；所述胸腺肽a I为如下是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有胸腺肽功能的由序列I衍生的蛋白质。所述胸腺肽a I基因可为如下I)或2)或3)或4)或5)或6)的DNA分子:I)编码区如序列表中序列2自5’末端第7至90位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5’末端第7至91位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列2自5’末端第4至90位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2自5’末端第4 至93位核苷酸所示的DNA分子；5)在严格条件下与I)至4)中任一限定的DNA序列杂交且编码具有胸腺肽功能的蛋白的DNA分子；
6)与I)至4)中任一限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有胸腺肽功能的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2XSSC、
0.1%SDS 和 1 X SSC,0.1%SDS 各洗膜一次。所述“含有胸腺肽a I基因的重组表达载体”可为将所述胸腺肽a I基因插入pET15a ( + )载体的多克隆位点(如NdeI和HindIII酶切位点之间)得到的重组质粒。所述宿主菌具体可为大肠杆菌BL21 (DE3)。所述步骤(1)中，所述“培养重组菌”的方法为:将所述重组菌在液体培养基中培养至菌液OD6tltol=1,加入诱导剂并诱导培养12小时；所述诱导剂为异丙基-D-硫代半乳糖苷。所述诱导剂的初始浓度具体可为0.15mM。所述液体培养基具体可为LB培养基。在加入所述诱导剂前，重组菌的培养条件具体可为:25°C、200转/分(旋转半径为13_)振荡培养。所述诱导培养的培养条件具体可为:25°C、200转/分(旋转半径为13_)振荡培养。所述步骤(1)中，所述超声破碎的参数具体可为:采用O 10探头处理30分钟，超声7秒间隔5秒。所述步骤(2)中，所述“收集上清液”的实现方法具体可为离心。所述离心的参数具体可为:4°C、IOOOOg离心10分钟。以上任一所述方法制备得到的胸腺肽a I也属于本发明的保护范围。本发明中，将胸腺肽a I基因导入pET15a ( + )载体，然后在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达，然后超声破碎并收集全菌蛋白，将全菌蛋白75°C处理30分钟后离心收集上清液再用10000道尔顿的滤膜过滤并收集滤液，即为含有胸腺肽a I的溶液。75°C处理30分钟可将绝大部分菌体蛋白变性并离心去除，再用10000道尔顿的滤膜进一步去杂后可以得到高纯度、高活性的终产品，与化学合成的胸腺肽a I (日达仙)生物学活性相当。与传统的化学合成法或层析纯化法相比，采用本发明提供的方法制备胸腺肽a 1，操作简单、成本大幅降低，非常适合工业生产。
图1为每天各组仔猪的体重增加比率。图2为各组仔猪IL-4的表达水平。图3为各组仔猪IFN- Y的表达水平。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。胸腺肽a I如序列表的序列I所示。胸腺肽a I基因的开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第7-93位核苷酸所示。日达仙(一种精制的、化学合成的胸腺肽aI消毒干粉制剂):购自美国赛生制药有限公司，产品目录号:H20100767。pET15a ( + )载体:购自美国Novagen公司，产品目录号:69740_3。大肠杆菌BL21 (DE3):购自中国兽医药品监察所。绵羊红细胞(产品规格:100ml/瓶):购自郑州百基生物科技有限公司。PBS 缓冲液(pH8.0):溶剂为水,含有 137mmol/L NaCl,2.7mmol/L KC1、4.3mmol/LNa2HPO4 和 1.4mmol/L KH2PO4。实施例1、制备胸腺肽a I一、构建重组质粒1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。2、用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切步骤I得到的双链DNA分子，回收酶切产物。3、用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切pET21a ( + )载体，回收约5443bp的载体骨架。4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET21-T a I。根据测序结果，对重组质粒pET21-T a I进行结构描述如下:在pET21a ( + )载体的NdeI和HindIII酶切位点之间插入了序列表中序列2自5’末端第I至91位核苷酸所示的DNA分子。二、制备胸腺肽a I1、将重组质粒pET15_Ta I导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组菌。2、将步骤I得到的重组菌接种至LB培养基，250C >200转/分(旋转半径为13mm)振荡培养至菌液OD6tltlnm=I ;加入异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(使其在体系中的浓度为
0.15mM), 25°C >200转/分(旋转半径为13mm)振荡培养12小时；5000g离心10分钟，收集菌体。三、纯化胸腺肽a I的表达1、用PBS缓冲液洗涤步骤二得到的菌体并重悬菌体，超声破碎30分钟(超声破碎仪的厂家为:南京舜玛仪器设备有限公司，型号为GL-400SD ;超声破碎采用O 10探头，超声7秒间隔5秒)。2、将步骤I得到的液相体系迅速升温至75°C，静置30分钟，然后4°C、IOOOOg离心10分钟，收集上清液。3、将步骤2得到的上清用截留分子量为10000道尔顿的滤膜进行超滤，收集滤出液，即为纯化得到的胸腺肽a I溶液。胸腺肽a I溶液的蛋白浓度为5毫克/毫升。
4、将步骤3得到的胸腺肽a I溶液进行SDS-PAGE电泳。结果表明，胸腺肽a I溶液在3kD附近处出现一条蛋白条带。四、对照处理甲1、同步骤三的I。2、将步骤I得到的液相体系迅速升温至70°C，静置30分钟，然后4°C、IOOOOg离心
10分钟，收集上清液。3、将步骤2得到的上清用截留分子量为10000道尔顿的滤膜进行超滤，收集滤出液，即为对照溶液甲。对照溶液甲的蛋白浓度为8毫克/毫升。
五、对照处理乙1、同步骤三的I。2、将步骤 I得到的液相体系迅速升温至80°C，静置30分钟，然后4°C、IOOOOg离心10分钟，收集上清液。3、将步骤2得到的上清用截留分子量为10000道尔顿的滤膜进行超滤，收集滤出液，即为对照溶液乙。对照溶液乙的蛋白浓度为2毫克/毫升。实施例2、胸腺肽a I生物学活性测定(细胞实验)采用玫瑰花结法测定实施例1制备的胸腺肽a I的生物学活性(胸腺肽a I可激活新鲜猪胸腺中的脱E胸腺细胞，使它与绵羊细胞形成玫瑰花结)。1、采集新鲜猪胸腺，用PBS缓冲液制备淋巴细胞悬液。2、将步骤I得到的淋巴细胞悬液45°C温浴Ih (每隔5分钟振摇一次)，用PBS缓冲液洗涤细胞并调整细胞浓度为(3-5 ) X IO6个/ml，分置于测试管中，每管0.2ml。3、制备各种溶液(I)用PBS缓冲液梯度稀释实施例1得到的胸腺肽a I溶液，得到各个胸腺肽a I浓度的稀释液(胸腺肽a I的浓度以溶液的总蛋白浓度计)。( 2 )用PBS缓冲液溶解并梯度稀释日达仙，得到各个浓度的日达仙溶液。(3)用PBS缓冲液梯度稀释实施例1得到的对照溶液甲，得到各个蛋白浓度的稀释液。(4)用PBS缓冲液梯度稀释实施例1得到的对照溶液乙，得到各个蛋白浓度的稀释液。4、分组处理实验组-1:在步骤2得到的每个测试管中加入0.1ml步骤3得到的胸腺肽a I溶液的稀释液；实验组-2:在步骤2得到的每个测试管中加入0.1ml步骤3得到的日达仙溶液；实验组-3:在步骤2得到的每个测试管中加入0.1ml步骤3得到的对照溶液甲的稀释液；实验组-4:在步骤2得到的每个测试管中加入0.1ml步骤3得到的对照溶液乙的稀释液；对照组:在步骤2得到的每个测试管中加入0.1ml无菌水。5、用PBS缓冲液悬浮绵羊红细胞，得到细胞浓度为(3-5) X IO7个/ml的绵阳红细胞悬液。6、在步骤4得到的每个测试管中加入0.2ml步骤5得到的绵阳红细胞悬液，摇匀，600g离心2分钟，4°C放置过夜。7、完成步骤6后，弃去测试管中的上清液，每管加入一滴固定液，轻轻摇匀并静置10分钟，然后每管加入2滴染色液,摇匀并静置15分钟。固定液的制备方法:将I体积份25%戊二醛溶液、I体积份3.5%碳酸氢钠溶液和38体积份Hank' s液混合。染色液的制备方法:将2ml姬姆萨染色液原液和6ml加Hanks液混合并摇勻，1500转/分钟离心10分钟，取上清液。
姬姆萨染色液原液的制备方法:取姬姆萨染料0.5g,加甘油33ml, 55_60°C加热至姬姆萨染料溶解，冷至室温，加入33ml甲醇，室温放置24小时后用滤纸过滤，取滤液，密封
室温保存。8、完成步骤7后，在显微镜下进行计数，计数显微镜视野里16个方格上所有淋巴细胞的个数(不少于200个)，统计其中的E玫瑰花结形成数(结合3个以上绵羊红细胞的胸腺细胞)，计算E玫瑰花结形成百分率。进行三次重复实验，结果取三次重复实验的平均值。胸腺肽a I的生物活性=实验组E玫瑰花结形成百分率-对照组E玫瑰花结百分率。测定结果见表I。表I胸腺肽a I的生物活性
权利要求
1.一种制备胸腺肽a I的方法，依次包括如下步骤: (1)培养重组菌后收集菌体并进行超声破碎；所述重组菌为将含有胸腺肽aI基因的重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌； (2)升温至75°C并静置30分钟，收集上清液； (3)用截留分子量为10000道尔顿的滤膜进行超滤，收集滤液，即为胸腺肽aI溶液； 所述胸腺肽a I为如下是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有胸腺肽功能的由序列I衍生的蛋白质。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于:所述胸腺肽aI基因为如下I)或2)或3)或4)或5)或6)的DNA分子: 1)编码区如序列表中序列2自5’末端第7至90位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2自5’末端第7至91位核苷酸所示的DNA分子； 3)序列表中序列2自5’末端第4至90位核苷酸所示的DNA分子； 4)序列表中序列2自5’末端第4至93位核苷酸所示的DNA分子； 5)在严格条件下与I)至4)中任一限定的DNA序列杂交且编码具有胸腺肽功能的蛋白的DNA分子； 6)与I)至4)中任一限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有胸腺肽功能的蛋白的DNA分子。
3.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述“含有胸腺肽aI基因的重组表达载体”为将所述胸腺肽0 1基因插入邱!15& ( + )载体的多克隆位点得到的重组质粒。
4.按权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.按权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，所述“培养重组菌”的方法为:将所述重组菌在液体培养基中培养至菌液OD6tltlnm=L加入诱导剂并诱导培养12小时；所述诱导剂为异丙基-D-硫代半乳糖苷。
6.权利要求1至5中任一所述方法制备得到的胸腺肽aI。
全文摘要
本发明公开了一种制备胸腺肽α1的方法。本发明提供的方法依次包括如下步骤(1)培养将含有胸腺肽α1基因的重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌后收集菌体并进行超声破碎；(2)升温至75℃并静置30分钟，收集上清液；(3)用截留分子量为10000道尔顿的滤膜进行超滤，收集滤液，即为胸腺肽α1溶液。75℃处理30分钟可将绝大部分菌体蛋白变性并离心去除，再用10000道尔顿的滤膜进一步去杂后可以得到高纯度、高活性的终产品，与化学合成的胸腺肽α1(日达仙)生物学活性相当。与传统的化学合成法或层析纯化法相比，采用本发明提供的方法制备胸腺肽α1，操作简单、成本大幅降低，非常适合工业生产。
文档编号C12N15/70GK103088051SQ20131005814
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月25日 优先权日2013年2月25日
发明者伏显华, 刘亭见, 岑峻宇 申请人:北京诺派生物科技有限公司