用于预防或治疗正义单链rna病毒感染的大形式的人2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶oas3的制作方法

专利名称：用于预防或治疗正义单链rna病毒感染的大形式的人2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶oas3的制作方法
用于预防或治疗正义单链RNA病毒感染的大形式的人2’， 5’ -寡聚腺苷酸合成酶0AS3本发明涉及作为药物用于预防或治疗正义单链RNA病毒(positive-sense single-stranded RNA virus)感染的大形式的人2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶0’， 5' -OligoAdenylate Synthetase, 0AS3)。本发明还涉及作为标志物用于确定对正义单链RNA病毒感染之遗传易感性的大 形式的人2’，5’ -寡聚腺苷酸合成酶(0AS3)。黄病毒科(Flavivirida)和披膜病毒科(Togaviridae)是两个正义单链 (single-stranded, ss) RNA病毒科，其包括在世界范围内可影响人和动物健康的病原体。 这些病毒的实例包括黄病毒属(Flavivirus)(黄病毒科)的登革病、黄热病(YF)、日本 脑炎(JE)和蜱媒脑炎(tick-borne encephalitis, TBE)抗原性复合物的成员；甲病毒 属(Alphavirus)(披膜病毒科)的东方型马脑炎(EEE)病毒/委内瑞拉马脑炎(VEE)病 毒、Semliki森林(SF)病毒和辛德毕斯(Sindbis，SIN)病毒的成员；以及丙型肝炎病毒属 Ofepacivirus)(黄病毒科)的成员，如丙型肝炎病毒(HCV)和G型肝炎病毒(HGV)。登革病毒(DV ；黄病毒属的DEN抗原性复合物)是热带地区大多数城市中心的地 方性病毒，这是由于城市化步伐的加快为蚊媒登革病的加速传播提供了理想的条件。登革 病毒的4种血清型(DV-1至DV-4)通过蚊载体埃及伊蚊(Ae.aegypti)传播到人。DV感染 导致一系列疾病，从流感样疾病(登革热，DF)到登革出血热(DHF)，其可发展为登革休克综 合征(DSQ乃至死亡。迄今，登革病是人类中最重要的虫媒病毒病，估计每年有1亿病例和 超过500，000例DHF/DSS发生，其中包括约25，000个死亡病例(主要为年龄低于15岁的 儿童)。高DHF/DSS发病率的流行病继续在亚洲和南美洲地理性蔓延。尽管对健康和经济 的影响越来越大，但是目前对登革病的致病机理却了解甚少。尚没有可用的抗登革疫苗或 治疗登革病毒感染的特异性疗法。西尼罗病毒(WNV ；黄病毒属的JE抗原性复合物)在包括蚊(库蚊(Culex)种) 和鸟类的天然传播圈中循环，而马和人是其偶然宿主。由于1998年在以色列出现了高度神 经侵袭性毒株(来自WN病毒谱系I的Ia进化支的Isr98/NY99变种)(Ceccaldi等，FEMS Microbiol. Lett.，2004，233，1-6)，因此动物源性的WNV在北美、中东和欧洲成为主要的健 康问题。WNV感染中枢神经系统并在多个动物物种中导致病毒性脑炎。在人中，临床感染 的严重程度可从无并发症的西尼罗热到致命的脑膜脑炎。已将WNV的出现与人感染严重性 的显著升高联系起来，这使病毒性脑炎作为公共健康问题受到人们的关注。在过去的10年 中，WNV已传播到西半球和加勒比海地区。美国的WNV爆发已牵涉到数千患者，引起了严重 的神经性疾病(脑膜脑炎和脊髓灰质炎样综合征)，并导致了数百例的相关死亡。尽管WNV 的蚊媒传播为主要模式，然而也认识到通过输血、器官捐献以及跨胎盘传播到胎儿的WNV 感染。对于WNV相关疾病尚没有可用的疫苗或抗病毒疗法。基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV ；甲病毒属的SF组)在非洲、东南亚、印 度和西太平洋地区广泛传播，且在这些地区已有多次流行的报道。临床上，CHIKV感染导致 发热、发疹以及强烈的、使人丧失劳动能力的并且有时持久的关节痛。在2005-06年，CHIK病毒已传播到南印度洋南部地区，特别是留尼旺岛(La Reunion)(法国)(此处的爆发波及 了成百上千的患者)。最近，该病毒在意大利东部出现，感染了超过200个人。丙型肝炎病毒(HCV)是世界范围内很常见的，据估计全世界约3%的人口携带 HCV，且仅在欧洲就有约4百万携带者。20 30%的这些个体会发生肝硬化及其长期后遗 症(如肝细胞癌)。用PEG化干扰素α (IFN-α)与病毒唑联合治疗HCV感染可在感染了 HCV病毒基因型2或3的患者中实现持久的应答(80% )，但是在感染了 HCV病毒基因型1 的患者中应答率低得多(42% )。由I型干扰素(IFN- α/β)介导的先天抗病毒机制可能是宿主细胞防御限制病毒 复制的最重要途径。事实上，IFN-α/β能够触发导致诱导IFN刺激基因(IFN-stimulated gene, ISG)之特定信号转导途径的激活，所述IFN刺激基因负责建立抗病毒状态。认为在 单个细胞中影响RNA病毒复制的ISG包括RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)、粘病毒抵抗蛋白 (Mx)家族的蛋白、双链RNA依赖性蛋白激酶(H(R)以及与内切核糖核酸酶RNase L相关的 2，，5，-寡聚腺苷酸合成酶(2，，5，-OAS或OAS)家族。OAS/RNase L系统是已知在已建立的内源抗病毒途径中起重要作用的RNA衰减途 径。具有酶活性的OAS与激活物双链(ds)病毒RNA的结合产生2’ -5’连接的寡聚腺苷 酸0-5幻。通过与2-5A寡聚物结合所诱导的同二聚化，无活性的单体RNase L被酶促激 活。一经激活，RNase L就降解单链RNA分子(包括mRNA和病毒RNA)，从而抑制病毒复制 (Silverman, J.Virol.81 :12720,2007)。人OAS是由染色体12q24. 2上3个紧密相连的基因编码的酶家族，其次序如下小 片段(0ASl，p40/46)、中片段(0AS2，p69/71)和大片段(0AS3,plOO) OAS 同工型(Hovnanian 等，Genomics,1998,52, 267-277 ；Rebouillat, D.禾口 Hovanessian, A.G., Journal of Interferon and Cytokine Research,1999,19,295-308 ;Rebouillat 等，Genomics,2000, 70,232-240 Justesen等，Cellular and Molecular Life Sciences，2000，57，1593-1612 ; Rebouillat ；Hovanessian, A. G. , Cytokine and Growth Factor Reviews,2007,18, 351-361)。每个OAS基因由包含5个翻译外显子(外显子A_E)的保守OAS单元所组成。 OASl具有一个单元，而0AS2和0AS3分别有两个和三个单元，并且所有这3个基因编码活 性的2’，5’ -寡聚腺苷酸合成酶。另一基因OASL(OAS样)编码单个单元的OAS样蛋白， 然而其缺乏 2，-5，合成酶活性(Hartmann 等，Nucleic Acids Res.，1998，26，4121-4128 ； Rebouillat等，Eur. J. Biochem.，1998 ；257，319-330)。在每个大小类型中，原始转录物经 可变剪接而产生多个成员。OAS蛋白共有由约350个氨基酸组成的保守单元/结构域(OAS 单元)；0ASl(p40/p46)、0AS2(p69/71)和0AS3(pl00)分别含有一个、两个和三个OAS单元 串联拷贝。每种OAS蛋白在细胞中的不同位置聚集，需要不同量的dsRNA来激活，且催化不 同大小的2-5A产物形成。OASl以四聚体发挥作用，0AS2只在二聚体时有活性，而0AS3只作 为单体被观察到。此外，推测大形式的人OAS不参与RNase L活化(综述可见，Rebouillat， D.禾口 Hovanessian, A. G. , Journal of Interferon and Cytokine Research,1999,19, 295-308)。通过用2，，5，-寡聚腺苷酸合成酶(OAS)cDNA转染细胞，提供了 OAS家族参与IFN 所显示的抗病毒作用的第一个直接证据。OASl或0AS2的过表达导致细胞对小核糖核酸 病毒复制的抗性(Hovanessian, A. G.，Cytokine and Growth Factor Reviews，2007，18，351-361)。以下发现也支持了 OASl体内清除WNV感染的重要性鼠Oaslb (人OASl的直 系同源基因)可在小鼠对WNV诱导之脑炎的易感性/抗性表型中起关键作用(Mashimo， Τ.等，Proc. Natl. Acad. ki. USA，2002，99，11311-11316 ；Lucas 等，Immunol. Cell. Biol.， 2003，81，230-236 ；Kajaste-Rudnitski等，Journal of Biological Chemistry,2006, 281, 46244637 ；国际PCT申请WO 02/081741)。对人中OAS遗传多态性的分析表明OAS基因中 的遗传标志物与酶活性的关联最大。考虑到OASl是影响宿主对病毒感染之易感性的极佳 候选人类基因(Bonnevie-Nielsen 等，Am. J. Hum. Genet.，2005，76，623-633)，人 OASl 以及 OASL基因的遗传改变与病毒性脑炎、1型DM、HCV相关疾病和其它病毒感染的风险相关。特 别强调一下HCV疾病，已报道了一系列OASl基因型与HCV感染的结局有关(国际PCT申请 WO 03/089003 和 WO 2005/040428)。OAS家族的抗病毒活性是否对正义ssRNA病毒具有选择性是仍待研究的重要问 题。据报道，OASl的异位表达导致对脑心肌炎病毒(小核糖核酸病毒)复制的抗性，但对 VSV病毒复制则无抗性。然而，认为OAS在用IFN-α治疗的患者的HCV清除中无作用，而 这与另一些ISG(如IFN可诱导的RNA依赖性蛋白激酶(I3KR)和粘病毒抵抗蛋白1 (MxA)基 因)不同。在非人灵长类动物模型中，DV感染后0AS、PKR和Mx的转录水平均上调(Sariol 等，Clinical and Vaccine Immunology，14，2007，756-766)。对登革休克综合征相关的基 因转录模式的分析显示，与非DSS患者相比，0AS3基因转录物在DSS登革病患者中的丰度 较低(Simmons等，J. Infect. Dis.，195 1097，2007)。然而，对这些ISG在DV感染致病机理 中的作用仍了解甚少。据报道，CHIKV对I型干扰素(IFN-α/β)的抗病毒活性作用具有高度敏感性 (Couderc等，PloS Pathogens，2007，4，e29) 在甲病毒的情形中，一系列证据表明IFN 介导的病毒生长抑制不需要RNase L(Ryman等，J. Virol.，2005，79，1487-1499 ；综述见， Silverman, J. Virol.，2007，81，12720-9)。人 ISG 的任何成员(如 OAS 家族)是否可表现 抗甲病毒活性是仍待研究的重要问题。本发明人首次证实0AS3在针对正义ssRNA病毒(如甲病毒(CHIKV、SINV和SFV)) 的公认内源抗病毒途径中有作用。他们显示，0AS3通过在被感染的人上皮细胞中阻止病毒 蛋白质合成和病毒RNA复制而对CHIKV生长阶段起作用。针对甲病毒感染的人遗传易感性， 几乎没有可用的信息。在健康的白种人个体中筛查0AS3基因的多态性，在密码子CGA-844 的第一位鉴定出单核苷酸多态性(SNP)，其中用T替换C得到无义突变(0AS3. R844X)。预 计该0AS3. R844X位置的SNP将产生0AS3蛋白的截短形式，在羧基端缺失约20%。与全长 的0AS3蛋白相比，0AS3突变体的异位表达对CHIKV的抑制效力降低。0AS3的遗传多态性 可控制其抗甲病毒活性的观点表明，人OAS基因在甲病毒相关疾病(如基孔肯雅热)的致 病机理中起作用。本发明人首次证实0AS3在感染了 DV (肝癌细胞)和WNV (肝癌和上皮细胞)的人 细胞中表现出抗黄病毒活性。在DSS患者和非DSS登革患者中检查完整的0AS3基因鉴定 出在密码子AGG-381的第三位具有SNP rs2285993，其中用C替换G使氨基酸从精氨酸变为 丝氨酸。我们的遗传学数据表明，在泰国登革患者中Ser-381变体与对DSS风险的显性保 护作用有关。本发明人在本文中证明具有kr-381的0AS3是人肝细胞中DV生长的强效抑 制物。
本发明人还证实YFV的减毒活疫苗株17D_204(STAMARIL，Sanofi-Pasteur)在被 感染的人上皮和肝癌细胞中对0AS3介导的抗病毒途径具有固有的抗性。然而，在人细胞中 IFN- α能建立针对YFV的17D-204疫苗株的抗病毒状态。这些发现可用于开发针对有重大医学意义的正义ssRNA病毒(包括CHIKV、WNV 和DV)的基于0AS3的预防和治疗。它们还可用于开发预测人对以下病毒感染易感性的基 于0AS3的新型分子工具，所述病毒包括甲病毒、黄病毒和其它具有重大医学意义的正义 ssRNA病毒，特别是预测登革、西尼罗和基孔肯雅患者的严重疾病形式。本发明的一个主题是用作药物的分离的2 ’，5 ’ -寡聚腺苷酸合成酶3蛋白或分离 的编码所述2’，5’ -寡聚腺苷酸合成酶3蛋白的多核苷酸。定义-“多核苷酸”是指基因组DNA片段、cDNA片段或RNA分子。- “2，，5，-寡聚腺苷酸合^_3”、“0AS3”、“0AS 3”、“2，，5，-寡聚腺苷酸合成 _ 3 (IOOkD) ”、“(2-5，)-寡聚(A)合成_ 3”、“寡聚腺苷酸合成_ D100”、“D1000AS” 或 “D1000AS”是指由哺乳动物0AS3基因编码的蛋白质，其具有2’ -5’ -寡聚腺苷酸合成酶活 性，并且指衍生的变体，包括由0AS3基因中多态性导致的天然变体以及由0AS3基因/开放 读码框(ORF)序列中一个或多个核苷酸的突变(插入、缺失、替换)导致的人工变体，只要 所述变体具有2’ -5’ -寡聚腺苷酸合成酶活性并能够抑制正义单链RNA病毒复制即可。优 选地，所述变体含3个OAS结构域。可在序列数据库中获得多种哺乳动物的0AS3基因和推 导出的0AS3 ORF以及氨基酸序列，其它0AS3基因/ORF序列可经本领域技术人员已知的标 准克隆和测序技术来确定。-“人0AS3基因”是对应于GenBank序列登记号NC_000012的111860632至 111895437位的34806bp的序列。人0AS3基因位于12号染色体上(12qM. 2)，并包括16 个外显子外显子1 :1至264位；外显子2 3127至3409位；外显子3 :6033至6208位；外 显子4 8300至8538位；外显子5 :9503至9656位；外显子6 :10418至10762位；外显子 7 12250至12532位；外显子8 22628至2沘03位；外显子9 :24209至24459位；外显子 10 24870至25014位；外显子11 :25792至25965位；外显子12 :27301至27586位；外显 子13 28975至29150位；外显子14 :29493至29731位；外显子15 :31165至31312位；外 显子 16 :31519 至 34806 位。-“人0AS3开放读码框(ORF)”是序列SEQ ID NO 1，其对应于6646bp的人cDNA序 列(GenBank 登记号:NM_006187 (SEQ ID NO :27))的 88 至 3351 位。在 cDNA 序列 NM_006187 上外显子1至16的位置分别为1至264位，265至547位，548至723位，7 至962位， 963 至 1116 位，1117 至 1461 位，1462 至 1744 位，1745 至 1920 位，1921 至 2171 位，2172 至 2316 位，2317 至 2490 位，2491 至 2776 位，2777 至四52 位，2953 至 3191 位，3192 至 3339 位，3340 至 6627 位。-“ 人 0AS3 蛋白”是对应于 GenBank 登记号 NP_006178 或 SEQ ID NO 2 的 1087 个氨基酸的序列；其3个OAS结构域分别对应于6至343位(SEQ ID NO 3)、411至742位 (SEQ ID NO 4)和 750 至 1084 位(SEQ ID NO 5)。- “0AS3活性”是指2’ _5’ -寡聚腺苷酸合成酶活性以及正义单链RNA病毒复制 抑制活性。
本发明0AS3蛋白的2’，5’ -寡聚腺苷酸合成酶活性可利用层析或电泳方法通 过确定所形成的寡聚腺苷酸的终点量来测定(St Laurent等，Cell, 1983, 33,95-102 ； Johnston 等，In Interferon 3 :Mechanisms of Production and Action,1984,189-298, Friedman, R. Μ. , Ed, Elsevier, Amsterdam ；Justesen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 1980, 77,4618-4622 Justesen 等，Nucleic Acids Res. ,1980,8,3073-3085 Justesen, J.和 Kjelgaard, N. 0.，Anal.Biochem.，1992，207，90—93)。-“本发明的0AS3蛋白对ιΗ义ssRNA病毒复制的抑制”是指当外源0AS3蛋白(不是 由所述细胞基因组编码，例如重组0AS3蛋白)存在于被病毒感染细胞中时，病毒生长(病 毒增殖)的部分或完全降低。该抑制可通过用正义单链RNA病毒感染表达0AS3蛋白的合 适重组细胞系来测定。使用经病毒感染的同一类型的非重组细胞作为对照。然后，可通过 已知的任何病毒滴度测定来检测经病毒感染细胞的上清液中病毒后代的产生。或者，可通 过病毒抗原的Astern印迹或免疫标记来分析病毒蛋白的产生，或者通过Northern印迹或 RT-PCR来分析病毒基因组或亚基因组RNA的产生。- “ ιΗ义ssRNA病毒，，是指以ιΗ义单链核糖核酸(ssRNA)作为遗传物质并且不用 DNA中间体进行复制的病毒。正义ssRNA病毒属于病毒分类的巴尔的摩分类系统中的组IV。-与氨基酸序列和核酸序列有关的“同一性”是指基于序列比对(其尽可能增大所 比对氨基酸残基或核苷酸的同一性)对两个序列同一性程度的测量，其是一致残基或核苷 酸数、总残基(在本发明中为1087个残基)或核苷酸(在本发明中为3261个核苷酸)数 以及序列比对中空位的存在和长度的函数。已有多种比对算法和/或计算机程序采用标准 参数来确定序列同一性，包括FASTA或BLAST (其为GCG序列分析软件包的一部分(威斯康 星大学，Madison, Wis.)),并可采用如默认设置。与SEQ ID NO :2的1至1087位残基有75%同一性的蛋白质是当将该蛋白序 列与SEQ ID NO :2的1至1087位残基进行比对并比较时，该蛋白质的序列可包含至多 (25X 10. 87 = 271)个变化。一个变化是指与SEQID NO :2的1至1087位残基比较时，一个 氨基酸的缺失、替换或插入。例如，与SEQ ID NO 2的前1080个残基相比具有50个变化的 含1080个氨基酸的序列，与SEQ ID NO :2的同一性为1080-50/10. 87 = 94. 75%。例如， 与SEQ ID NO :2的1至1087位残基相比具有50个变化的含1090个氨基酸的序列，与SEQ ID NO 2 的同一性为 1087-50/10. 87 = 95. 4% - “相似件”是指基于序列比对(其尽可能增大所比对氨基酸残基的相似性)对两 个氨基酸序列的相似性程度的测量，其是一致或相似的残基数、总残基数(在本发明中为 1087个残基)以及序列比对中空位的存在和长度的函数。已有多种比对算法和/或计算机 程序采用标准参数来确定序列相似性，包括FASTA或BLAST (其为GCG序列分析软件包的一 部分(威斯康星大学，Madisonjis.))，并可采用如默认设置。相似的残基是指具有相当的 化学性质(大小、电荷(中性、碱性、酸性)、亲水性/疏水性)的残基。
-包括哺乳动物，以及其它脊椎动物(如，鸟类、鱼类和爬行动物)。本文
所用术语“哺乳动物”是指哺乳其子代并且生出活的幼体(真兽亚纲(eutharian)或胎盘 类哺乳动物)或产卵(后兽亚纲(metatharian)或非胎盘类哺乳动物)的任何脊椎动物， 包括单孔类动物、有袋类动物和胎盘类动物。哺乳动物物种的实例包括人和其它灵长类动 物(例如，猴和黑猩猩)、啮齿类动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠)和其它动物(例如牛、猪和马)。-“突变”意指在多核苷酸(cDNA、基因)或多肽序列中一个或多个核苷酸/氨基 酸的替换、缺失、插入。所述突变可影响基因的编码序列或其调控序列。它还可影响基因组 序列的结构或所编码mRNA的结构/稳定性。本发明涵盖经修饰的0AS3蛋白，其包含选自以下的一个或多个修饰0AS3氨基酸 序列中一个或多个氨基酸的突变(插入、缺失、替换)、氨基酸融合部分的添加、用非天然的 氨基酸(D-氨基酸或非氨基酸类似物)替换氨基酸残基、对肽键的修饰、环化、向侧链加入 化学基团(脂质、寡糖或多糖)以及与适当载体偶联。通过本领域熟知的方法引入的这些 修饰得到仍具有2’ -5’ -寡聚腺苷酸合成酶活性以及对正义单链RNA病毒复制具有抑制活 性的经修饰0AS3蛋白。根据本发明的一个优选实施方案，所述2’ -5’ -寡聚腺苷酸合成酶3(OAS;3)是人 2’ -5’ -寡聚腺苷酸合成酶3。根据本发明另一优选实施方案，所述0AS3蛋白与SEQ ID NO :2的1至1087位残 基具有至少70%氨基酸序列同一性或80%氨基酸序列相似性，优选地具有至少80%氨基 酸序列同一性或90%氨基酸序列相似性。根据本发明的一个更优选的实施方案，所述0AS3蛋白在SEQ ID N0:2的第381位 包含丝氨酸。优选地，所述0AS3蛋白包含选自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 7的氨基酸序列 或由其组成。根据本发明的另一优选实施方案，所述0AS3多核苷酸编码上述蛋白质，更优选地 其包含选自以下的核苷酸序列或由其组成编码蛋白质SEQ ID NO :2的SEQ ID NO=I以及 编码蛋白质 SEQ ID NO 7 的 SEQ ID NO :6。根据本发明的另一优选实施方案，所述多核苷酸被插入表达载体中。载体是指能够转运连接其上的另一核酸的核酸分子。本发明中可用的载体包括但 不限于病毒载体、质粒、RNA载体或者线性或环状DNA或RNA分子，其可由染色体的、非染 色体的、半合成的或合成的核酸组成。优选的载体能进行自主复制(附加型载体)和/或 能表达与其连接的核酸(表达载体)。大量的合适载体已为本领域技术人员所知并可购得。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒或AAV)、冠状病 毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病毒和水泡性口炎 病毒)、副粘病毒(例如麻疹病毒和仙台病毒)、正链RNA病毒(如细小核糖核酸病毒和甲病 毒)以及双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、EB病毒、 巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘、禽痘和金丝雀痘))。其它病毒包括例如诺沃克病毒、 披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例 包括禽白细胞组织增生肉瘤病毒、哺乳动物C型病毒、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、 慢病毒、泡沫病毒(Coffin, J. Μ. , Retroviridae :The viruses and their replication, Fundamental Virology,第三版，B. N. Fields 等编，Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia,1996)。优选地，所述载体为表达载体，其中编码本发明0AS3蛋白的序列置于适当的转录 和翻译控制元件的控制下，以允许产生或合成所述蛋白质。因此，所述多核苷酸包含在表达 盒中。更具体地，所述载体包含复制起点、与所述编码多核苷酸有效连接的启动子、核糖体结合位点、RNA剪接位点(当采用基因组DNA时)、多聚腺苷酸化位点和转录终止位点。其 还可包含增强子。启动子的选择将取决于多肽所表达的细胞。合适的启动子包括组织特 异性启动子和/或可诱导的启动子。可诱导启动子的实例包括重金属水平升高诱导的真 核金属硫蛋白启动子、温度升高诱导的热休克启动子。组织特异性启动子的实例包括骨骼 肌肌酸激酶、前列腺特异性抗原(PSA)、α-抗胰蛋白酶、人表面活性剂(SP)A和B蛋白以 及β-酪蛋白。载体可包含选择标记，例如用于真核细胞培养的新霉素磷酸转移酶、组胺 醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶、腺苷脱氨酶、 谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶；用于酿酒酵母(S. cerevisiae)的 TRPl, URA3和LEU2 ；用于大肠杆菌(E. coli)中的四环素、利福平或氨苄青霉素抗性。载体的选择取决于它们的用途(稳定表达或瞬时表达)或/和宿主细胞；病毒载 体和“裸”核酸载体为哺乳动物细胞(人和动物)中表达的优选载体。可采用病毒载体(如 腺病毒、逆转录病毒、慢病毒和AAV)等，其中预先将目的序列插入所述载体中。本发明的主题还包括药物组合物，其特征为包含至少一种0AS3蛋白或一种0AS3 多核苷酸(优选地插入到上述表达载体中)，以及至少一种可用载体、运载体(carrier)、添 加剂和/或免疫刺激剂。可将本领域普通技术人员已知的任何合适的运载体用于本发明的药用组合物中， 运载体的类型取决于施用模式。对于肠胃外施用(如皮下注射)，运载体优选地包含水、 盐水缓冲液、乳糖、甘露醇、谷氨酸盐，脂肪或蜡，注射用药物组合物优选为等渗溶液(约 300-320毫渗透摩尔)。对于口服施用，可采用任何上述运载体或固体运载体，如甘露醇、乳 糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁。还可用生物可降解的微球 (例如，polylactic galactide)作为本发明药物组合物的运载体。已公开了合适的生物可 降解微球，如美国专利4，897，268和5，075，109中的微球体。添加剂可选自抗凝集剂、抗氧 化剂、染料、增味剂或者光滑、聚集或分离剂，以及一般来讲在制药工业中常规采用的任何 赋形剂。在本发明的组合物中可采用多种免疫刺激剂中的任意种来增强免疫应答。所述药物组合物可采用适于口服施用的形式。例如，所述组合物采用口服施用的 以下形式片剂、普通胶囊剂、明胶胶囊剂或糖浆剂。这些明胶胶囊剂、普通胶囊剂和片剂形 式可包含药物制剂中常规采用的赋形剂，如辅药或粘合剂(如淀粉、树胶或明胶)、辅药(如 磷酸钙)、崩解剂(如玉米淀粉或海藻酸)、润滑剂(如硬脂酸镁)、甜味剂或调味剂。可通 过在水性介质或非水性介质中加入药理学相容性溶剂来制备溶液和悬液。这些包括乙二 醇、聚乙二醇、丙二醇、聚乙二醇醚、DMSO和乙醇。通过本领域技术人员熟知的适用于特定细胞类型的任何便捷手段，将0AS3蛋白 或0AS3多核苷酸(分离的或插入载体中的)在体外、离体或体内引入细胞中，可单独引入 或与至少一种适当的载体和/或运载体一起引入。例如，0AS3蛋白/多核苷酸可与以下 物质结合，所述物质能在机体中对所述序列提供保护或能使其穿过宿主细胞膜。0AS3可 有利地与脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)和/或膜转位肽相结合(Bonetta, The Scientist, 2002，16，38 ；Ford 等，Gene Ther. ，2001，8，1-4 ；Wadia 禾口 Dowdy，Curr. Opin. Biotechnol.， 2002,13,52-56 ；Langel,U. In Handbook of cell penetrating peptides (第二版)，2006, Lavoisier ；法国)；在后一情形中，0AS3蛋白序列与膜转位肽的序列融合(融合蛋白)。编 码0AS3的多核苷酸(分离的或插入载体中的)可通过多种方法引入到细胞中(例如，注射、直接摄取、射弹攻击、脂质体、电穿孔)。可使用上述合适的表达载体将0AS3蛋白稳定或瞬 时地表达在细胞中。在本发明的一个实施方案中，0AS3蛋白/多核苷酸基本无免疫原性，即不引起或 基本不引起不良免疫应答。可依照本发明采用多种改善或消除此种有害免疫反应的方法。 在一个优选的实施方案中，0AS3蛋白基本不含N-甲酰甲硫氨酸。避免不期望的免疫反应 的另一种方法是将蛋白质/多核苷酸与聚乙二醇(“PEG”)或聚丙二醇(“PPG”)(优选的 平均分子量(MW)为500至20，000道尔顿)缀合。本发明的另一主题是上述0AS3蛋白或编码所述0AS3蛋白的多核苷酸，其用于预 防或治疗正义单链RNA病毒的感染。根据一个更优选的实施方案，所述病毒属于甲病毒属。更优选地，其选自基孔肯 雅(CHIK)病毒、辛德毕斯(SIN)病毒、Semliki森林(SF)病毒、东方型马脑炎(EEE)病毒、 西方型马脑炎(WEE)病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、罗斯河(RR)病毒、奥-奈氏(ONN) 病毒和Barma森林(BF)病毒。根据另一更优选的实施方案，所述病毒属于黄病毒属。更优选地，所述病毒选自 登革病毒、日本脑炎病毒、Kyasanur森林病病毒、墨莱溪谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱 媒脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒和鄂木斯克出血热(OHF)病毒。根据另一优选的实施方案，所述病毒属于丙型肝炎病毒属。更优选地，所述病毒为 丙型肝炎病毒。本发明的主题还包括至少含有上述0AS3蛋白或0AS3多核苷酸(优选地插入表达 载体中)的产品，以及与前一产品不同的第二产品，所述第二产品选自抗病毒、抗炎和免 疫调节药物，其可作为联合制剂同时、分开或依次用于预防或治疗正义单链RNA病毒感染。本发明的主题还包括在有此需要的个体中预防或治疗正义单链RNA病毒感染的 方法，所述方法包括以任何方式向所述个体施用上述组合物的步骤。一般来讲，所述组合物可通过以下方式施用肠胃外注射(例如，真皮内、肌内、静 脉内或皮下)、鼻内(例如，通过吸入或喷雾)、口服、舌下或局部(通过皮肤或通过直肠)。本发明组合物中存在的0AS3(蛋白质/多肽)的量为治疗有效量。0AS3(蛋白质 /多肽)的治疗有效量为0AS3蛋白实现其抑制正义单链RNA病毒复制的作用而不在施用该 组合物的对象中导致过度副作用的必要量。所用0AS3(蛋白质/多肽)和待施用组合物的 准确量将根据如下因素而不同正义单链RNA病毒物种、接受治疗的个体物种(人、动物)、 施用方式、施用频率以及该组合物中的其它成分。优选地，所述组合物包含约IOyg至约IOmg(更优选约IOOyg至约Img)的 0AS3(蛋白质/多肽)。“约”是指0AS3所述量(yg或mg)的值可在特定范围内变化，这取 决于评估该量所使用的方法的误差限度。例如，当口服施用本发明的组合物时，待治疗的个体可以连续3天每天接受约 IOyg至约IOmg 0AS3(蛋白质/多肽)的单剂量。该治疗可在一周后重复1次。对于肠胃外施用(例如皮下注射)，待治疗的个体可接受约10 μ g至约IOmg (更优 选约IOOyg至约lmg)0AS3(蛋白质/多肽)的单剂量。可在一周后重复该治疗1次。本发明的主题还包括在体外评估个体对以上定义的正义单链RNA病毒之易感性 的方法，其包括检测从所述个体获得的核酸样品中0AS3基因的多态性。
所述核酸样品可以是基因组DNA、总mRNA或cDNA。多态性可用本领域已知的可检测核酸序列中突变的任何方法来检测，例如在 Current Protocols in Human Genetics, 2008, John Wiley & Sons, Inc.中所表述地。基 因分型测定的实例包括但不限于RAPD、RFLP, AFLP、序列特异性寡核苷酸杂交、SnapShot PCR、连接酶检测反应、PCR和Maldi-TOF、焦磷酸测序。这些测定可使用表II和III中的 0AS3特异性引物，特别是引物SEQ ID NO :11、12、62至86以及118至142。根据所述方法的一个优选实施方案，所述正义单链RNA病毒为甲病毒(如基孔肯 雅病毒)或黄病毒(如登革病毒)。根据所述方法的另一优选实施方案，所述多态性为Arg844密码子突变为终止密 码子(R844X)；在白种人群中检测到的所述多态性与对正义单链RNA病毒感染(特别是基 孔肯雅病毒感染)的易感性提高相关。R844X突变可如下检出使用引物对(SEQ ID NO=Il 和 SEQ ID NO 12)进行 PCR-RFLP，之后用 BglII 消化 183bp 的 PCR 产物；115bp 和 68bp 的 两种片段的存在表明存在0AS3. R844X突变。根据所述方法的另一优选的实施方案，所述多态性为381位密码子第三位的单核 苷酸多态性(SNP)。优选地，所述SNP为密码子AGG-381由G替换为C，其使氨基酸由精氨 酸变为丝氨酸(R381Q。遗传学数据显示变体Ser-381与登革患者针对DSS风险的显性保 护作用有关(表VI)。该SNP可通过如上所述的任何合适的基因分型测定来检测。例如，该 测定可包括对用成对的0AS3特异性引物(例如在表III中给出的特异性针对0AS3外显子 6的PCR引物(SEQ ID NO 70和126))扩增的基因组DNA进行直接测序。本发明的主题还包括分离的0AS3蛋白，其包含序列SEQ ID NO :7或SEQ ID N0: 30，或由其组成。本发明的主题还包括分离的0AS3蛋白片段，其包含序列SEQ ID NO :9或由其组 成；该0AS3片段(包括SEQ ID NO :7的1至843位残基)包括0AS3的第一个和第二个OAS 结构域，但缺少第三个(C^g)OAS结构域的大部分。本发明的主题还包括-分离的多核苷酸，其包含序列SEQID NO 6或由其组成，其编码SEQID NO 7的 0AS3蛋白，-分离的多核苷酸，其包含序列SEQID NO 8或由其组成，其编码SEQID NO 9的 0AS3蛋白片段，-分离的多核苷酸，其包含序列SEQID NO 观或四或由其组成，其编码SEQ ID NO 30的0AS3蛋白变体。本发明的主题还包括重组载体，优选包含如下多核苷酸的表达载体，所述多核苷 酸具有选自以下的序列SEQ ID NO 6, SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :28 禾口 SEQ ID NO :29。本发明的主题还包括经如下多核苷酸转染或转化的宿主细胞，所述多核苷酸包含 选自以下的序列SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO :29，或由其组 成。根据本发明的一个优选实施方案，其为表达重组人0AS3的HeLa-Tet-Off细胞 系，称为HeLa-iTet-Off/0AS3#C417-l，该细胞系于2008年2月洸日保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,25rue du Docteur Roux,75724 ParisCedex 15，登记号为 1-3927。根据本发明的另一优选实施方案，其为表达截短的重组人0AS3的a-Tet-Off细胞 系,称为 HeLa-I^et-Off/OASS/delta/lC，该细胞系于 2008 年 4 月 17 日保藏于 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,25 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15，登记号为 1-3968。根据本发明的一个优选实施方案，其为表达重组人0AS3的H印G2-Tet-0ff 细 胞系，称为HeLa-Tet_0ff/0AS3#F8，该细胞系于2009年5月15日保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15，登记号为 1-4158。这些源于HeLa或!fepG2细胞的细胞系(可被多种病毒感染)可用于测定病毒对 0AS3介导的抗病毒活性的敏感性。本发明的主题还包括包含上述多核苷酸的非人转基因动物。本发明的主题还包括包含上述多核苷酸的转基因植物。本发明的0AS3蛋白/多核苷酸使用众所周知的重组DNA技术和遗传改造技术来 制备。例如，使用特异性引物通过聚合酶链式反应由DNA模板扩增得到含0AS30RF的序列。 然后通过使用适当的限制位点将PCR片段用克隆进表达载体中。0AS3蛋白在适合于0AS3 蛋白表达的条件下，在该表达载体修饰的宿主细胞或转基因动物/植物中表达，并且从宿 主细胞培养物或转基因动物/植物中回收0AS3蛋白。除非另外指明，本发明的实施将采用本领域技术人员已知的以下范畴中 的常规技术细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组 DNA和免疫学。这些技术在文献中有充分的解释。例如见，Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA) ；Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第三版，(Sambrook 等， 2001, Cold Spring Harbor, New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press)； Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait 编，1984) ；Mullis 等，美国专利 No. 4，683，195 ； Nucleic Acid Hybridization(B. D. Harries & S. J. Higgins 编，1984) ；Transcription And Translation(B. D. Hames & S.J. Higgins 编，1984) ；Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc.,1987) ；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986) ；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984) ；the series,Methods In ENZYM0L0GY (J. Abelson 和 M. Simon，主编，Academic Press, Inc. ,New York)，特别是 154 和 155 卷(Wu 等编)以及 185 卷，〃 Gene Expression Technology" (D. Goeddel 编)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller 和Μ· P. Calos编，1987，Cold Spring Harbor Laboratory) ；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer 禾口 Walker 编，Academic Press, London,1987) ；Handbook Of Experimental Immunology, I-IV 卷(D.M. Weir 和 C. C. Blackwell 编，1986)；以及 Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1986)。Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons，hc，2008)，特别是第 12 章“Vectors For Gene Therapy，，禾口第 13 章"Delivery Systems for Gene Therapy，，)。-

图1示意带有c-myc表位标签的人重组0AS3(克隆0AS3C 17. 1)的核苷酸(A)和氨基酸(B)序列。这些核苷酸和氨基酸序列分别对应于SEQ ID N0:23和24。0AS3 mRNA 参照序列(SEQ ID NO ,21)与克隆的0AS3 cDNA之间的差异用下划线(如果为同义)或粗 体(如果不同义)表示。翻译起始和终止密码子用粗体表示。对应于C端c-myc表位的额 外的核苷酸和氨基酸序列用下划线表示。5’ NotI和3’ EcoRV限制位点用斜体显示。-图2示意表达重组人0AS3的可诱导HeLa-Tet-0ff/0AS3#C417_l细胞系的构建。-图3示意在HeLa细胞中检测0AS3。在(A)中，以每个细胞不同的病灶形成单位 (AP61FFU)用 CHIK病毒株06-49 (CHIK 06-49)感染HeLa. Tet-Off 细胞。感染后(p. i. )20 小 时，将感染细胞上清液中产生的病毒颗粒在假鳞斑伊蚊(Aedes pseudoscutellaris)AP61 细胞中用病灶免疫测定进行滴定。在⑶中，在加入CHIKV (每个细胞1个AP6IFFU的感染 复数(1M0I))前5小时，用1, 000IU/ml的人IFN-α处理HeLa. Tet-Off细胞或进行模拟处 理(对照)。在感染后18h，如上所述测定病毒后代的产生。在(C)中，示意全长和截短形 式的0AS3。在(D)中，使用0AS3特异性抗体通过免疫印迹分析了经诱导的(-Tet)或未诱 导的(+Tet) Tet-Of f/0AS3 细胞中 0AS3 的异位表达，用 1, 000IU/ml 的 IFN-α (+IFN)处理 HeLa. Tet-Off细胞或模拟处理(模拟)。以β -肌动蛋白为看家蛋白对照。-图4示意在表达0AS3的HeLa细胞中CHIKV的生长抑制。在(A)中，用 CHIKV (IMOI)感染细胞18小时，并用抗CHIK. Ε2单克隆抗体3Ε4通过流式细胞术对其进行 分析。在以下细胞中进行分析模拟感染的细胞(无病毒)、在病毒加入前证用1，OOOIU/ ml的人IFN- α孵育的经CHIKV感染之HeLa. Tet-Off细胞(+IFN)或模拟处理的细胞(对 照)以及在四环素存在(+tet)或不存在(_tet)下经CHIKV感染的Tet-Off/0AS3细胞。在
(B)中，用CHIKV以不同的MOI感染细胞，在感染后18和M小时测定病毒后代的产生。在
(C)中，在感染后的不同时间监测CHIKV的生长抑制。在(D)中，用SINV或SFV以IMOI感 染细胞，在感染后18小时测定病毒后代产生。-图5示意WN病毒对0AS3抗病毒活性的敏感性。用每个细胞0.1、1. O或 10AP61FFU 的 WN 病毒株 IS-98-ST1 感染 HeLa. Tet-Off 和经诱导的 HeLa. Tet-Off/ 0AS3#C417-1。在感染后48小时将感染细胞上清液中产生的感染性病毒颗粒在假鳞斑伊蚊 AP61细胞中用病灶免疫测定进行滴定。-图6示意在表达0AS3的细胞中WN病毒的生长抑制。用每个细胞0.1AP61FFU的 WN 病毒株 IS-98-ST1 感染 HeLa. Tet-Off 和经诱导的 HeLa. iTet-Off/0AS3#C417_l，并在感 染后的不同时间04、48和72小时)将感染细胞上清液中产生的感染性病毒颗粒在假鳞斑 伊蚊AP61细胞中用病灶免疫测定进行滴定。-图7示意0AS3表达对CHIKV复制的影响。在(A)中，用抗CHIKHMAF抗体(左) 或抗CHIKV E2单克隆抗体3E4(右)对以CHIKV(病毒)感染或模拟感染(mock infected, m. i.)的HeLa. Tet-Off细胞(对照)和HeLa. Tet-Off/0AS3 (0AS3)细胞的细胞提取物进 行免疫印迹测定。使用β-肌动蛋白作为蛋白对照。在(B)中，在用CHIKV(1Μ0Ι)感染的 HeLa. Tet-Off细胞(对照)和HeLa. Tet-0ff/0AS3细胞(0AS3)后8小时，对其病毒RNA产 生进行实时RT-PCR分析。-图8示意截短形式的0AS3的抗甲病毒活性。用1M0I的CHIKV感染HeLa. iTet-Off (对照)、HeLa. Tet-Off/0AS3 (0AS3)和 HeLa. Tet-0ff/0AS3/delta/lC(0AS3^*^) 细胞，并在感染后18小时测定病毒后代产生。按照Mudent's t检验对数值进行统计学比较(*** :P < 0. 001)。-图9示意截短形式的0AS3的抗黄病毒活性。用IMOI的WNV感染HeLa. iTet-Off (对照)、HeLa. Tet-Off/0AS3 (0AS3)和 HeLa. Tet-Off/0AS3/delta/lC (0AS3 ) 细胞，并在感染后18小时测定病毒后代产生。按照Mudent's t检验对数值进行统计学比 较(*** :P < 0. 001)。-图10示意DV-I病毒对I型IFN途径的敏感性。A:H印G2. Tet-Off细胞系对DV 感染的易感性。用递增量(AP61FFU/每细胞)的DV-I病毒株FGA/NA did感染细胞。在感 染后40小时，利用单克隆抗体4E11(其对DV E糖蛋白具有反应性)通过流式细胞术分析细 胞。B =DV-I病毒对I型IFN途径的敏感性。在DV感染(10M0I) 5小时前，用1, 000IU. mL"1 人IFN- α (+IFN)预处理H印G2. Tet-Off细胞或不进行处理(模拟处理)。在感染后40小 时，如前所述测定病毒后代产生(Duarte dos Santos等，Virology，2000，274，292_)。-图11表达0AS3的H印G2细胞中登革病毒的生长抑制。在2 μ g. ml/1四环素存在 (未诱导)或不存在(经诱导)的情况下，用不同感染复数的1型登革病毒株FGA/NA did 感染亲代H印G2. Tet-Off细胞和H印G2. Tet-0ff/0AS3#F8细胞克隆。在感染后40小时，用 甲醇/丙酮在_20°C固定细胞20分钟。用缀合有FITC的抗登革E单克隆抗体4E1进行免 疫荧光测定。用DAPI对细胞核染色。一式三份实验来确定对病毒抗原呈阳性的H印G2细 胞的百分数。在感染复数为25时测定病毒后代产生。如前所述进行病毒滴定(Duarte dos Santos 等，Virology,2000，274，292-)。-图12:表达0AS3的!fepG2细胞对登革病毒感染显示抗性。用感染复数为 30AP61FFU/细胞的 1 型登革病毒株 FGA/NA did (Duarte dos Santos 等，Virology，2000， 274，292-)感染亲代H印G2. Tet-Off细胞和经诱导的H印G2. Tet-0ff/0AS3#F8细胞克隆或 进行模拟感染。在感染后40小时，如图11的图注中所述进行免疫荧光测定。-图13表达0AS3的HepG2细胞对西尼罗病毒感染显示抗性。用感染复数为 1AP61FFU/细胞的西尼罗病毒株 IS-98-ST1 (Lucas 等，Virology J. ,2004,1,9-)感染亲代 H印G2. Tet-Off和经诱导的H印G2. Tet-0ff/0AS3#F8细胞克隆，或进行模拟感染。在感染后 40小时，用甲醇/丙酮在_20°C下固定细胞20分钟。用缀合有cy3的抗西尼罗E单克隆抗 体EM进行免疫荧光测定。用DAPI对细胞核进行染色。-图14显示IFN-α能够在人上皮HeLa细胞中建立针对YFV 17D的抗病毒状态。 用IPFU/细胞的YFV 17D感染HeLa细胞，然后在感染后的多个时间点用1，000IU/ml的人 IFN-α处理或进行模拟处理(对照)。在感染后72小时测定病毒后代产生。-图15显示，无论感染后的时间点或感染复数为何，YFV的17D减毒活毒株均显 示出对人细胞中0AS3介导之抗病毒作用的预料之外的抗性。将HeLa(对照)和经诱导的 HeLa. Tet-Off/0AS3 (0AS3)细胞暴露于低(图A ； IPFU/细胞)或高(图B ； 10PFU/细胞) 病毒输入的YFV毒株17D。-图16表达0AS3的!fepG2细胞对黄热病疫苗17D-204无抑制作用。用在Vero E6细胞中培养一次的STAMARIL黄热病减毒活疫苗(Sanofi-Pasteur)感染亲代H印G2. Tet-Off细胞和经诱导的H印G2. Tet-0ff/0AS3#F8细胞克隆或进行模拟感染。在感染后40 小时，用甲醇/丙酮在-20°C下固定细胞20分钟。用抗法国嗜神经病毒HMAF和缀合有FITC 的山羊抗小鼠Ig进行免疫荧光测定。用DAPI对细胞核染色。
-图17示意截短的人重组0AS3(0AS3I_843)的核苷酸(A)和氨基酸(B)的序列。 这些核酸和氨基酸序列分别对应于SEQ ID N0:25和SEQ ID NO :26。0AS3 mRNA参照序列 与克隆的0AS3 cDNA片段之间的变化用下划线(如果为同义)或粗体(如果不同义)表示。 翻译起始和终止密码子用粗体表示。对应于C端c-myc表位的额外的核苷酸和氨基酸序列 用下划线表示。5’ NotI和3’ EcoRV限制位点用斜体显示。实施例1 :HeLaTet-0ff/0AS3细胞系的建立和评估1)材料和方法a)细胞培养HeLa. iTet-Off 细胞系购买自 BD BIOSCIENCES CL0NTECH。将 HeLa. iTet-Off 细胞 在添加了 10%热灭活胎牛血清(FCS)、4mM L-谷氨酰胺、100UI/ml青霉素、10 μ g/ml链霉素 和 200 μ g. mL_1 G418 (INVITR0GEN)的 DMEM(INVITROGEN)中、于 37°C在 5% CO2 下培养。HeLa. Tet-0ff/0AS3 细胞系(CNCM 1-3927)在添加了 10 % FCS、4mM L-谷氨 酰胺、100UI/ml 青霉素、10 μ g/ml 链霉素、200 μ g. mL—1 G418、100 μ g. ml/1 潮霉素 B(BD BIOSCIENCES CL0NTECH)禾P2yg. mL-1 四环素(SIGMA-ALDRICH)的 DMEM 中培养。细胞以单 层生长；预期细胞密度为80%至100%;细胞倍增时间约为2天。经胰蛋白酶消化收集细胞； 每周取其1/10进行传代培养。细胞的寿命有限(15至20代)。在添加了 20% FCS、10% DMS0、4mM 谷氨酰胺、100UI/ml 青霉素、10 μ g/ml 链霉素、200 μ g. mL—1 G418、100 μ g. mL-1 潮 霉素B和2 μ g. mL-1四环素的DMEM中冷冻细胞。HeLa. Tet-0ff/0AS3/delta/lC(0AS3^*^)细胞系(CNCM 1-3968)在添加了 10% FCS、20mM L-谷氨酰胺、10，000UI/ml 青霉素、10 μ g/ml 链霉素、200 μ g. mL—1 G418U00y g. 111171潮霉素8出0 BIOSCIENCES CL0NTECH)和 10 μ g. ml/1 四环素(SIGMA-ALDRICH)的 DMEM 中 培养。细胞以单层生长；预期细胞密度为90%;细胞倍增时间约为2天。经胰蛋白酶消化收 集细胞；每周取其1/10进行传代培养。细胞的寿命有限(25代)。在添加了 20% FCS、10% DMS0、4mM 谷氨酰胺、10，000UI/ml 青霉素、10 μ g/ml 链霉素、200 μ g. mL_1 G418、100 μ g. mL_1 潮霉素B和10 μ g. mL—1四环素的DMEM中冷冻细胞。b)建立表达0AS3蛋白的HeLa. Tet-Qff细胞系用在PCR4-T0P0载体(INVITR0GEN)中分别克隆的人0AS3的两个重叠cDNA片段 作为表达全长0AS3蛋白(SEQ ID NO : 的1至1，087位氨基酸和图1)或截短形式0AS3"G 末端(或0AS3[1侧，SEQ ID NO 26的1至843位氨基酸和图3C、9和17)的模板。在表I中 列出了参照0AS3序列(GenBank登记号NM-006187 ；SEQ ID NO 27)与本研究中所用的0AS3 cDNA(图1)的核苷酸和氨基酸的不同。表I :0AS3 mRNA参照序列与克隆的0AS3 cDNA之间核苷酸和氨基酸变化
OAS3OAS3蛋白NM一006187OAS3克隆的OAS3-AC 末端mRNA(NP—00617(6646bp)cDNA (3264bp(2532bp)
权利要求
1.分离的2’-5’ -寡聚腺苷酸合成酶3蛋白或编码所述2’ -5’ -寡聚腺苷酸合成酶3 蛋白的分离的多核苷酸，其作为药物。
2.权利要求1的蛋白质或多核苷酸，其具有人2’-5’ -寡聚腺苷酸合成酶3的序列。
3.权利要求1或2的蛋白质，其与SEQID NO :2的1至1087位残基具有至少70%的 氨基酸序列同一性或80%的氨基酸序列相似性。
4.权利要求1至3中任一项的蛋白质，其在SEQID NO 2的第381位包含丝氨酸。
5.权利要求4的蛋白质，其包含选自SEQID NO :2和SEQ ID NO 7的氨基酸序列。
6.权利要求1或2的多核苷酸，其编码权利要求3至5中任一项所定义的蛋白质。
7.权利要求6的多核苷酸，其包含选自SEQID NO 1和SEQ IDNO 6的序列。
8.权利要求1、2、6和7中任一项的多核苷酸，其被插入到表达载体中。
9.权利要求1至8中任一项定义的分离的2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3蛋白或多核苷 酸，其用于预防或治疗正义单链RNA病毒感染。
10.权利要求9的蛋白质或多核苷酸，其用于治疗甲病毒属(Alphavirus)病毒的感染。
11.权利要求10的蛋白质或多核苷酸，其中所述病毒选自基孔肯雅病毒、辛德毕斯病 毒、东方型马脑炎病毒、西方型马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、罗斯河病毒、Semliki森 林病毒、Barma森林病毒禾口 0 ‘ nyong ‘ nyong病毒。
12.权利要求9的蛋白质或多核苷酸，其用于治疗黄病毒属(Flavivirus)病毒的感染。
13.权利要求12的蛋白质或多核苷酸，其中所述病毒选自登革病毒、日本脑炎病毒、 Kyasanur森林病病毒、墨莱溪谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱媒脑炎病毒、西尼罗脑炎 病毒、黄热病毒和鄂木斯克出血热病毒。
14.权利要求9的蛋白质或多核苷酸，其用于治疗丙型肝炎病毒感染。
15.至少包含权利要求1至8中任一项所定义的2’-5’ -寡聚腺苷酸合成酶3的产品 和不同于前一产品的第二产品，所述第二产品选自抗病毒、抗炎和免疫调节药物，其作为同 时、分开或依次应用以预防或治疗权利要求9至14中任一项定义的正义单链RNA病毒感染 的联合制剂。
16.用于体外评估个体对权利要求9至14中任一项定义的正义单链RNA病毒感染之易 感性的方法，其包括在从所述个体获得的核酸样品中检测所述2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶 3基因的多态性。
17.权利要求16的方法，其中所述检测使用选自以下序列的0AS3特异性寡核苷酸SEQ ID NO :11,12,62 至 86 以及 118 至 142。
18.权利要求16或17的方法，其中所述多态性选自密码子Arg844突变为终止密码 子(R844X)，以及381位精氨酸密码子突变为丝氨酸密码子(R381S)。
19.权利要求18的方法，其中采用PCR-RFLP测定来检测R844X突变，其包括a)使用引物对SEQID NO 11和12通过PCR扩增183bp产物，以及b)用BglII核酸内切酶消化PCR产物，其中115bp和68bp两种片段的存在表明存在 R844X突变。
20.权利要求18的方法，其中所述S381变体与登革病毒感染患者中针对登革休克综合 征风险的显性保护作用相关。
21.分离的0AS3蛋白，其包含选自SEQID NO 7和SEQ ID NO 30的序列。
22.分离的0AS3蛋白片段，其由SEQID NO 9序列组成。
23.分离的多核苷酸，其包含选自以下的序列编码0AS3蛋白SEQID N0:7的序列SEQ ID NO :6、编码0AS3蛋白SEQ ID NO 30的序列SEQ ID NO 28或四以及编码0AS3蛋白片 段 SEQ ID NO 9 的序列 SEQ ID NO :8。
24.重组载体，其包含权利要求23所定义的多核苷酸序列。
25.用权利要求23中定义的多核苷酸序列或权利要求M中定义的重组载体转染或转 化的宿主细胞。
26.权利要求25的宿主细胞，其为表达重组人2’-5’ -寡聚腺苷酸合成酶3的 HeLa-Tet-Off 细胞系，称为 HeLa-iTet-Off/0AS3#C417_l，于 2008 年 2 月洸日保藏在 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15，登记号为 1-3927。
27.权利要求25的宿主细胞，其为表达截短的重组人2’-5’ -寡聚腺苷酸合成酶3 的 HeLa-iTet-Off 细胞系，称为 HeLa-I^et-Off/OASS/delta/lC，于 2008 年 4 月 17 日保藏 在 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15，登记号为 1-3968。
28.权利要求25的宿主细胞，其为表达重组人2’-5’ -寡聚腺苷酸合成酶3的 HepG2-Tet-0ff 细胞系，称为 H 印 GZ-iTet-Of f/0AS3#F8，于 2009 年5月 15 日保藏在 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15，登记号为 1-4158。
全文摘要
大形式的人2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶(OAS3)在诊断、预防和治疗正义单链RNA病毒感染中以及在预测人对正义单链RNA病毒相关疾病的遗传易感性中的用途。
文档编号C12Q1/68GK102124101SQ200980128348
公开日2011年7月13日 申请日期2009年5月20日 优先权日2008年5月20日
发明者伊莎贝尔·卡萨德蒙特, 塞西尔·朱利耶, 安妮-克莱尔·布雷安, 普里达·玛拉实, 菲利普·德普雷斯, 西尔维·波卢斯, 阿姆帕万·川萨姆里特, 阿纳瓦伊·萨昆塔巴伊 申请人:巴斯德研究所