专利名称：一种制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的发酵工艺，属于生物工程技
术领域。
背景技术：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)是广泛存在于绝大部分需氧生物 体内的一种蛋白酶。它的主要功能是能特异性地清除体内生成过多的强氧化性物质和致衰 老因子超氧自由基，调节体内的氧化代谢和抗衰老功能。超氧化物歧化酶(SOD)为自由基 清除剂，可催化超氧自由基发生歧化反应202—+2H+ — 02+H202。 按照超氧化物歧化酶(SOD)的化学结构和所携带的金属离子，它可以分为3 类铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)，锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)，铁超氧化物歧化酶 (Fe-SOD)。其中Fe-SOD主要存在于原核生物中，Mn-SOD存在于高等生物的线粒体及细菌 中，而Cu/Zn-SOD主要存在于包括人类在内的所有高等真核生物中。因此，最适合人体使用 的SOD为Cu/Zn-SOD。 Cu/Zn-SOD来源多种多样，目前大多采用动物血液或植物提取。随着国际上疯牛 病、口蹄疫等疾病的蔓延，各种病毒的污染，动物来源的Cu/Zn-SOD给使用者带来了很多不 可预料的危险；而植物来源的Cu/Zn-SOD与人类自身的Cu/Zn-SOD有一定的差异，因此对人 类有一定的免疫原性。因此，利用生物工程技术生产人源铜锌超氧化物歧化酶是解决Cu/ Zn-SOD来源、降低生产成本、获得高活性、无免疫原性Cu/Zn-SOD的有效途径。目前虽有 利用大肠杆菌表达发酵生产人源Cu/Zn-SOD的先例，但由于原核表达平台缺少表达后的修 饰，所生产的Cu/Zn-SOD与人体自身Cu/Zn-SOD在分子结构上仍有细微的差异性，在体内易 于降解，且残留一定的细菌内毒素，实际应用中仍存在一定的局限性。 自80年代酵母基因工程技术建立以来，经过10多年的不断研究，至今已使酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统达到了较高的水平。但是，人们也发现酿酒酵母 表达系统存在某些局限性，如工程菌难以达到很高的生长密度，蛋白分泌能力不够强等。因 此，人们逐渐转向酿酒酵母以外的其他酵母中去寻找、开发更理想的表达系统。脆壁克鲁维 酵母(Kluyveromyecs fragilis)就是近年来日益受到重视的酵母之一。脆壁克鲁维酵母 是食品工业中一种重要的生产菌株，传统应用于生产乙醇、乳糖酶和单细胞蛋白等产品。至 今的研究发现，这种酵母菌具有生长迅速、生物量大、生长温度适应范围广(25 46°C )、营 养要求简单、蛋白分泌能力强及对人类无致病性等生理特点，因此逐渐发展成为一种大量 表达异源蛋白的生物工程生产菌株。但如何采用脆壁克鲁维酵母表达体系发酵制备重组人 源铜锌超氧化物歧化酶，至今未见有关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用脆壁克鲁维酵母表达体系发酵制备重组人源铜锌 超氧化物歧化酶的工艺，以填补现有技术的空白，为制备人源铜锌超氧化物歧化酶提供一条新途径。 为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下 本发明的制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的发酵工艺，包括如下具体操作步 骤 a)将含有重组人源铜锌超氧化物歧化酶基因的重组表达载体导入脆壁克鲁维酵 母，构建获得重组人源铜锌超氧化物歧化酶菌种； b)进行菌种筛选，获得重组人源铜锌超氧化物歧化酶工程菌种；
c)取上述工程菌种一支接种在YEPD平皿上划线，并在3(TC培养18 26小时；
d)挑取单菌落接种于YEPD液体培养基中，在摇床中以3(TC、200rpm的转速振荡培 养18 24小时，得到一级种子液；取一级种子液，以1 : 10的接种比例接入YEPD液体培 养基中，在摇床中以3(TC、200rpm的转速振荡培养14 18小时，得到二级种子液；
e)用火圈接种法，以1 : 10的接种比例将二级种子液接入含有YEPD液体培养基 的发酵罐中，在如下培养条件pH 7.0、温度3(TC、溶氧(DO) > 30X、通气量2L/min、转速 180rpm 600rpm下进行培养30 36小时； f)添加终浓度为2%的灭菌半乳糖进行诱导表达，诱导条件如下pH 7. 0、温度 30。C、溶氧(DO) 〉30X，诱导64 74小时后，在4。C以5000rpm离心15min，收集上清液；
g)向收集的上清液中加入固体硫酸铵至60X饱和度，在4t:静置3小时后，在 4°C以8000rpm离心15min，弃去沉淀，收集上清液，再向收集的上清液中加入固体硫酸铵至 80X饱和度，在4t:静置过夜后，在4t:以8000rpm离心15min，收集沉淀；
h)将收集的沉淀用2. 5mM pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液(PB)溶解后，在同种缓冲溶 液中进行透析，其间每隔6 8小时更换一次缓冲溶液，透析24小时后，在4°C以10000rpm 离心20min，收集上清液； i)将收集的上清液加入经过2. 5mM pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液(PB)预平衡的 DEAE-S印harose-A，阴离子交换柱上，用2. 5mM pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液(PB)和含 0. 3mol/L NaCl的2. 5mM pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液(PB)进行线性梯度洗脱，流速为2. 4ml/ min，收集具有酶活性的洗脱液部分； j)再向收集的具有酶活性的洗脱液中加入固体硫酸铵至饱和度为50%， 然后立即加入经50%硫酸铵饱和的2.5mM pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液(PB)预平衡的 Phenyl-S印harose-A，疏水柱中，用经50%硫酸铵饱和的2. 5mM pH8. 0的磷酸盐缓冲溶 液(PB)和不含硫酸铵的2. 5mM pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液(PB)进行线性梯度洗脱，流速为 2. 5ml/min，收集具有酶活性的洗脱液部分； k)进行冷冻干燥处理，即得重组人源铜锌超氧化物歧化酶冻干纯品。 所述YEPD固体培养基的配方如下1%酵母抽提物(Yeast Extract) ， 2%蛋白胨
(P印tone)，2X葡萄糖(glucose)及2%琼脂粉。 所述YEPD液体培养基的配方如下1%酵母抽提物(Yeast Extract) ， 2%蛋白胨
(P印tone)及2%葡萄糖(glucose)。 与现有技术相比，本发明的有益效果如下 1)实现了高效表达，表达水平高达50%，明显高于传统经典方法。
2)工艺简单，生产过程环保，制备成本低，稳定性好，适合规模化生产。
3)产品纯度高，可高达98%，比活性可高达20000u/mg，不仅可用于化妆品、医药 保健品，还可用作试剂盒或生化试剂。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明
实施例 仪器超净工作台、恒温培养箱、振荡恒温培养箱、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、 电子天平、冷冻干燥机。 试剂Yeast Extract (OXOID公司生产)、P印tpne (日本制药株式会社生产)、 Dextrose(国药集团生产)、氨水(国药集团生产)、半乳糖(国药集团生产)、硫酸铵(国 药集团生产)、化1^04(国药集团生产)、化,04(国药集团生产)、去离子水(自制)。
1.培养基的配方 本发明工艺所用培养基均为YEPD培养基，配方如下1% Yeast Extract (酵母 膏)，2% P印tone (蛋白胨)，2% Dextrose (glucose)(葡萄糖)，若制固体培养基，加入2% 琼脂粉。采用高压蒸汽灭菌法，葡萄糖需单独以115t:，20min灭菌，其余物质混合以121°C， 20min灭菌，灭菌后在超净工作台中将两者混合。
2.平板菌的制备 按照YEPD琼脂培养基配方配制100mlYEPD固体培养基，灭菌后取出，冷却至60°C 左右后倒制5个YEPD琼脂平板，每个平板约16ml，冷却凝固后待用。取一支SOD甘油菌菌 种，室温下溶解。在经过紫外消毒的超净工作台中，用无菌操作方法进行菌种的平板划线。 画完线的平板倒置于恒温培养箱中，3(TC，约经过18 26小时培养，形成肉眼可见的单克 隆。取出用封口膜封口后，放入4°C的冰箱中冷藏保存备用。
3.种子液的制备 按培养基配方配制50ml YEPD于250ml三角烧瓶中作为一级种子培养基，灭菌混 合后待用。在经过消毒的超净工作台中，取出一单克隆分布均匀的平板菌，严格按照无菌操 作法挑取一颜色、大小、形状菌正常的单克隆接入到一级种子培养基中。在摇床中以3(TC， 200rpm的转速震荡培养18 24h，待转二级。 按培养基配方配制250ml YEPD于1000ml三角烧瓶中作为二级种子培养基，灭菌 混合后待用。在经过消毒的超净工作台中，用灭菌量筒量取25ml—级种子液，以l : 10的 接种比例接入二级种子培养基中。在摇床中以30°C ， 200rpm的转速震荡培养14 18h，待 上罐接种。 4.发酵罐调试 所用发酵罐为NBS-BI03000发酵罐。按配方配制2. 4LYEPD罐上培养基，用氨水调 节pH至7.0，倒入清洁过后的发酵罐中(葡萄糖需单独灭菌后加入)。按使用说明校准pH 电极，插上各种电极、废气管，向罐中通入一定量的压縮空气，用止血钳夹住废气管，密闭好 罐体。将罐体置入装满水的水槽中，进行密闭性检验，若无气泡冒出说明密闭良好；若有气 泡冒出，则需重新安装罐体，并做密闭性检验，直到合格为止。检验合格之后卸去废气管，用 纱布封住接口 ，将罐放入灭菌锅中，121°C ， 20min灭菌，葡萄糖单独灭菌并冷却后加入。
取出罐体后立即安装到罐座上，迅速接上空气管道，打开空气阀通气，并依次安装好废气管、转动马达、冷凝水管及各种电极电路。打开控制器，参数设置如下控制参数如
下pH 7.0、温度3(TC，转速500rpm。当罐体温度下降到3(TC并保持稳定之后，校准100%溶氧。 5.发酵罐培养 用火圈接种法，以l : 10的接种比例将培养完成的二级种子液倒入发酵罐中， 开始培养。控制参数调整如下pH 7.0、温度30。C、 D0> 30%，通气量为2L/min，转速为 180rpm 600rpm。在培养初始阶段，由于菌体的增长繁殖，培养基中的养分和溶氧不断消 耗，转速逐步提高，当转速达到极限后，可通过添加适当比例的纯氧来提高溶氧。当养分耗 尽后，溶氧会突然升高，这时需要开始添加补料。补料同样采用YEPD液体培养基，初始转度 为5. 0，以后随着菌体的生长量而逐步提高。
6.发酵罐诱导 培养30 36小时左右，用一次性注射器添加终浓度为2%的灭菌半乳糖进行诱 导表达。控制参数如下pH 7.0、温度3(TC、D0〉30^，诱导后每隔4小时留样25ml，4。C， 5000rpm， 15min离心后留上清，-2(rC冻存，诱导72小时结束。
7.收罐 诱导结束后，用止血钳夹住废气管，打开取样阀，利用压力差将发酵液收集到大烧
杯中。依次关闭空气阀和冷凝水以及控制机。将发酵液分装到各个离心杯中，配平后以4t:，
5000rpm， 15min离心，留上清，将沉淀进行高温高压灭活处理。将上清液立即进行纯化处理， 若暂时不能进行纯化则需放入-S(TC进行保存。
8.发酵液SOD活性检测 将各时间段所取样品10000rpm离心10min，弃去沉淀，留上清进行邻苯三酚自氧 化法测定SOD活性。测活性采用的工作Buffer为pH8. 0的10mM的Tris-Hcl，底物为邻苯 三酚，定义在lml体系内SOD抑制邻苯三酚自氧化速率达到50%时所需的酶量为一个活性 单位。 9. SOD的纯化 1)预装DEAE-S印harose阴离子交换柱层析柱和Phenyl-S印harose疏水柱层析 柱。 2)用硫酸铵沉淀发酵上清液将发酵上清液加入固体硫酸铵至60%饱和度，4°〇 静置3小时后，离心(8000rpm，4t:， 15分钟)，弃去沉淀；上清液中继续加入固体硫酸铵至 80%饱和度，41:静置过夜，离心(8000rpm，4°C， 15分钟)，收集沉淀。 3)透析将沉淀用2. 5mM的PB溶解后，在同缓冲液中透析24h，其间更换3 4次 缓冲液。离心(10000rpm，4。C，20分钟)收集上清液。 4)DEAE-S印harose阴离子交换柱层析将收集的上清液逐步添加到经过PB缓冲 液(pH8. 0， 2. 5mM)预平衡的DEAE-S印harose层析柱上，酶蛋白先用约5倍柱体积的缓冲液 洗脱至A28。不变后，再用100ml PB缓冲液(pH8. 0， 2. 5mM)和100ml含0. 3mol/L NaCl的相 同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为2. 4ml/min，2. 5min收集1管。收集具有酶活性的洗脱 液部分。 5) Phenyl-S印harose疏水柱层析将收集的酶液加入固体硫酸铵至饱和 度为50 %后，立即施于经50 %硫酸铵饱和的PB缓冲液(pH8. 0， 2. 5mM)预平衡的Phenyl-S印harose疏水柱，进行疏水层析。酶蛋白用约5倍柱体积的经50%硫酸铵饱和的 PB缓冲液(pH8. 0， 2. 5mM)洗脱至A28。不变后，再用100ml经50%硫酸铵饱和的PB缓冲液 (pH8. 0，2. 5mM)和100ml不含硫酸铵的同一缓冲液进行线性梯度洗脱，最后用200ml PB缓 冲液(pH8. 0，2. 5mM)洗脱，流速为2. 5ml/min，2min收集1管。收集具有酶活性的洗脱液部 分，对其进行SDS-PAGE确认纯度。 10.冻干处理对SOD纯液进行冷冻干燥处理，制得SOD冻干纯品。
权利要求
一种制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的发酵工艺，其特征在于，包括如下具体操作步骤a)将含有重组人源铜锌超氧化物歧化酶基因的重组表达载体导入脆壁克鲁维酵母，构建获得重组人源铜锌超氧化物歧化酶菌种；b)进行菌种筛选，获得重组人源铜锌超氧化物歧化酶工程菌种；c)取上述工程菌种一支接种在YEPD平皿上划线，并在30℃培养18～26小时；d)挑取单菌落接种于YEPD液体培养基中，在摇床中以30℃、200rpm的转速振荡培养18～24小时，得到一级种子液；取一级种子液，以1∶10的接种比例接入YEPD液体培养基中，在摇床中以30℃、200rpm的转速振荡培养14～18小时，得到二级种子液；e)用火圈接种法，以1∶10的接种比例将二级种子液接入含有YEPD液体培养基的发酵罐中，在如下培养条件pH 7.0、温度30℃、溶氧(DO)＞30％、通气量2L/min、转速180rpm～600rpm下进行培养30～36小时；f)添加终浓度为2％的灭菌半乳糖进行诱导表达，诱导条件如下pH 7.0、温度30℃、溶氧(DO)＞30％，诱导64～74小时后，在4℃以5000rpm离心15min，收集上清液；g)向收集的上清液中加入固体硫酸铵至60％饱和度，在4℃静置3小时后，在4℃以8000rpm离心15min，弃去沉淀，收集上清液，再向收集的上清液中加入固体硫酸铵至80％饱和度，在4℃静置过夜后，在4℃以8000rpm离心15min，收集沉淀；h)将收集的沉淀用2.5mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液(PB)溶解后，在同种缓冲溶液中进行透析，其间每隔6～8小时更换一次缓冲溶液，透析24小时后，在4℃以10000rpm离心20min，收集上清液；i)将收集的上清液加入经过2.5mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液(PB)预平衡的DEAE-Sepharose-A280阴离子交换柱上，用2.5mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液(PB)和含0.3mol/L NaCl的2.5mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液(PB)进行线性梯度洗脱，流速为2.4ml/min，收集具有酶活性的洗脱液部分；j)再向收集的具有酶活性的洗脱液中加入固体硫酸铵至饱和度为50％，然后立即加入经50％硫酸铵饱和的2.5mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液(PB)预平衡的Phenyl-Sepharose-A280疏水柱中，用经50％硫酸铵饱和的2.5mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液(PB)和不含硫酸铵的2.5mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液(PB)进行线性梯度洗脱，流速为2.5ml/min，收集具有酶活性的洗脱液部分；k)进行冷冻干燥处理，即得重组人源铜锌超氧化物歧化酶冻干纯品。
2. 根据权利要求l所述的制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的发酵工艺，其特征 在于，所述YEPD固体培养基的配方如下1%酵母抽提物(YeastExtract) ， 2 %蛋白胨 (P印tone)，2X葡萄糖(glucose)及2%琼脂粉。
3. 根据权利要求l所述的制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的发酵工艺，其特征 在于，所述YEPD液体培养基的配方如下1 %酵母抽提物(YeastExtract) ， 2 %蛋白胨 (P印tone)及2%葡萄糖(glucose)。
全文摘要
本发明公开了一种制备重组人源铜锌超氧化物歧化酶的发酵工艺，其包括构建菌种、筛选菌种、培养、发酵、纯化和冻干处理等步骤，主要特征是采用脆壁克鲁维酵母表达体系进行分泌表达。与现有技术相比，本发明实现了高效表达，表达水平高达50％；工艺简单，生产过程环保，制备成本低，稳定性好，适合规模化生产；产品纯度高，可高达98％，比活性可高达20000u/mg，不仅可用于化妆品、医药保健品，还可用作试剂盒或生化试剂，具有广阔的市场前景。
文档编号C12N9/02GK101736027SQ20101002733
公开日2010年6月16日 申请日期2010年1月21日 优先权日2010年1月21日
发明者刘霞 申请人:上海玉华生命科技发展有限公司