一种新的发酵方法

专利名称：一种新的发酵方法
技术领域：
本发明属于微生物培养领域，具体地是涉及一种微生物新的发酵方法。
背景技术：
目前工业发酵中，主要采用的发酵工艺统统可归类为固态发酵和液体发酵两种。液体发酵是把菌种接种到发酵罐中，使菌体细胞游离悬浮在液体发酵培养基中， 并通过控制温度、搅拌、空气、压力、营养物质浓度等参数，使其进行生长的一种培养方法。 深层液体培养一般需要通入空气并进行搅拌，是传统的微生物发酵培养方法。其主要存在 设备昂贵，操作复杂、单位培养基产生菌体数量的浓度较低、菌液分离的成本较高等缺点。固体发酵，包括广义和狭义两种，广义的为微生物生长于不溶于水的基质，且基 质上含有不同量的自由水(free water) 0狭义的为微生物生长在潮湿不溶于水的基质进 行发酵，在固体发酵过程中不含任何自由水，随着微生物产出的自由水的增加，固体发酵范 围延伸至黏稠发酵(slurry fermentation)以及固体颗粒悬浮发酵。固体发酵法，常规工艺，包括在适合的槽罐设备中，承载已消毒的、充分浸润培养 基营养成分的惰性载体，并在其上接种微生物，并通过控制温度和其他一些相关条件，实现 目标微生物的大量繁殖。发酵完成后收集菌体或发酵产物等，通常为全部收集作为产品，并 进一步进行干燥破碎等后加工期处理。固体发酵主要具有以下优点1.培养基单纯，例如谷物类、小麦麸、小麦草、大宗谷物或农产品等均可被使用，发 酵原料成本较经济。2.基质前处理较液体发酵少，例如简单加水使基质潮湿，或简单磨破基质增加接 触面积即可，不需特殊仪器，一般家庭即可进行步骤。3.能产生一些液体发酵不能产生的特殊产物，如红麴产生的红色色素是液体发酵 的十倍，又Aspergillus在固体发酵所产生的glucosidase较液体发酵产生的酵素更具耐 热性。4.下游的回收纯化过程及废弃物处理通常较简化或单纯，常是整个基质都被使 用，废弃物较少。5.固体发酵可食品产生特殊风味，并提高营养价值。目前，固体发酵虽然具有以上优点，但也存在以下缺点1.物料的灭菌和消毒很难做的彻底，成本也较高，极易造成杂菌污染，影响产品质量。2.限于低湿状态下生长的微生物，故可能的流程及产物较易受限制，一般较适合 于真菌。3.不易以搅拌方式进行物质和能量的均勻分布，因此发酵期间，物质的添加无法 达到均勻，进而使发酵效果也不均勻。4.在较致密的环境下发酵，其散热常造成问题，而且物料下部往往通氧不足，在搅
3拌不均勻的情况下，耗氧菌生长情况不佳，尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能。5.不易于提取纯菌体，常常与载体混杂。6.后续的干燥工艺通常采用热风干燥，令活菌数量造成较大损失。7.成品的含菌量数量级最大一般不超过1000亿/克左右，通常都很难达到1000
亿/克左右。

发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种新的发酵方法，该方法具有原料耗费最 小、单位培养基产菌量极高的优点。解决上述技术问题的技术方案如下一种新的发酵方法，主要包括以下步骤(1)种子制备先进行常规的菌种筛选及活化，然后接种于常规三角瓶液体培养 基中，在培养箱中培养，得到液体种子；(2)固体平板的制备在非严格厌氧菌的对应的每1000ml液体发酵培养基中，加 入18-32g琼脂，灭菌后倒入平板中，利用琼脂对液体的凝固能力，冷却后即可制成含液体 培养基成份的固体平板培养基；(3)放大发酵将步骤(1)中得到的对应的发酵种子均勻喷在固体平板表面，然后 放置于35°C _37°C恒温发酵室内封闭发酵培养，根据菌种的不同，培养24-72小时，微生物 将会在平板培养基表面慢慢生长成一层菌泥；(4)收集菌泥放大发酵完后，将平板取出发酵室，然后用灭菌的硬薄片(例如硬 胶片或硬金属片)，将平板培养基上的菌泥刮下来，收集，得到所需的菌泥。所述发酵方法还包括将得到的菌泥与水按质量比1 0. 8-1. 2在搅拌混勻后，再 按质量比为菌泥二氧化硅=1 7. 5-8. 5逐步添加干燥二氧化硅，再进行吸附干燥，过60 目筛，将筛上物进行粉碎后再次过60目筛，得到高浓缩纯菌粉。优选地，所述非严格厌氧菌为反硝化假单胞菌，其固体平板培养基的组成为 1000mL中主要具有葡萄糖4-5g、面粉1. 5-2. 5g、鱼粉13_17g、硝酸钾4_6g、磷酸氢二钾 0. 8-1. 2g、磷酸二氢钾 0. 8-1. 2g、硫酸镁 0. 4-0. 6g、酵母膏 0. 15-0. 25g、琼脂 18_22g。优选地，所述非严格厌氧菌为枯草芽孢杆菌，其固体平板培养基的组成为 1000mL中主要具有废糖蜜18-22mL、面粉1.5-2. 5g、鱼粉13_17g、液体蛋白9_llmL、硫 酸锰0. 8-1. 2g、磷酸氢二钾0. 8-1. 2g、磷酸二氢钾0. 8-1. 2g、硫酸镁0. 4-0. 6g、酵母膏 0. 15-0. 25g、琼脂 18-22g。优选地，所述非严格厌氧菌为嗜酸乳杆菌，其固体平板培养基的组成为1000mL 中具有鱼粉18-22g、葡萄糖18-22g、乳清粉8-12g、琼脂28_32g、磷酸氢二钾1. 8-2. 2g、硫 酸锰0. 2-0. 4g、乙酸钠1. 5-2. 5g、硫酸镁0. 5-0. 7g、酵母膏1. 8-2. 2g、吐温 801_2mL。本发明所述的发酵方法，通过对常规的液体发酵培养基进行改进，做成固体平板 培养基进行平板发酵培养，其更适合于收集菌体为主要目的的发酵生产，且具有以下优占.1、所述方法成本低、操作简单、能适用于多数工业微生物菌种(非食品和非医药 类——非致病性的、非严格厌氧菌的微生物)的生产。
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2、可轻易的分离出纯菌泥，后续的保存和加工工艺将变得极其简单、高效和廉价。3、生产出大大突破现有微生物制剂产品含菌浓度上限的产品，可得到达10000亿
/克左右菌粉产品。4、收集菌泥后剩下的固体培养基，不仅水分较低，而且富含大量的代谢产物，可视 需要，简单加工成粉体，添加于最终产品中，又或者用于精炼提取代谢产物。5、进一步减少费水、废物的排放，降低环境污染。
具体实施例方式以下通过具体实施例，对本发明做进一步的描述，但本发明的保护范围不受以下 实施例的限制。实施例1 反硝化假单胞菌的发酵生产一、培养基的制备1、种子培养基(按1000mL计)葡萄糖10g、磷酸氢二钾lg、磷酸二氢钾lg、柠檬酸钠10g、硝酸钾5g、硫酸镁 0. 2g、酵母膏lg，加水至总体积为lOOOmL，pH调至8。用500mL三角瓶分装，每个三角瓶分装400mL液体；灭菌40min。2、发酵培养基的固体平板(按1000mL计)葡萄糖5g、面粉2g、鱼粉15g、硝酸钾5g、磷酸氢二钾lg、磷酸二氢钾lg、硫酸镁 0. 5g、酵母膏0. 2g、琼脂20g，加水至总体积为lOOOmL, pH调至8. 0。鱼粉处理鱼粉用定量的水煮沸并持续20 30min，水的量需要计算到培养基里 面；经过处理的鱼粉用40目的筛网过滤，滤液直接加到培养基。其余难溶成分另行加热溶 解后加入培养基中，发酵培养基即配即灭菌即用；121°C灭菌20min。制备固体平板培养基将不锈钢板洗净，晾干，在烘箱110°C干热灭菌1小时，冷却待用。此步骤在接种前 2个小时完成。发酵培养基即配即灭菌即用，在灭菌完之后，将灭菌后平板平放于无菌操作室桌 面上，然后往平板定量注入250mL左右的培养基，待琼脂冷却凝固后即可以接种。每升发酵 培养基约可以制备4个平板。二、发酵生产1.种子制备无菌操作，将菌种进行活化后，取2 3环菌泥接入种子培养基三角瓶中，37°C恒 温摇床中速培养24 30h，得种子液。合格种子的特征菌液浊度较高，菌体分分布均勻，有明显产气；镜检时(石炭酸 复红染色)，菌体正处于旺盛分裂期，形态一致，表现为细小杆菌，菌体稍长，分裂节点多，无 明显杂菌。2.固体平板发酵建立一个或多个恒温发酵室，每个约4-8平方米大，2. 5米高左右，密闭性和隔热 性良好，内装紫外线灯和熏蒸器，便于消毒。室内放置一个适当大小的多层不锈钢焊架，用 于叠放不锈钢托盘。此外还要建立一个无菌操作室，用于发酵前操作的工序。
将种子液均勻喷于上述每一块固体平板培养基上，轻轻摇动至种子液已铺满平板 表面，(100个不锈钢盘共需400ml种子液左右)。然后倒置层叠平板于培养室恒温37°C培 养。开始每隔12h对平板进行观察，对菌体生长情况进行记录。12h之后每3h镜检一次。 接种后24h左右，反硝化菌已在平板表面生成红色的菌泥，镜检合格后，此时可以收集了。3、菌体收集取出平板，用消毒好的硬塑胶片或金属片将平板上的菌泥刮下来，收集到烧杯等 器皿中。将收集好的菌泥与水按比例1 1(质量比)在小型液体搅拌机中充分搅拌混勻， 搅拌20min后按比例菌泥水二氧化硅=1 1 8 (质量比)逐步添加干燥二氧化硅， 在带有振动筛的搅拌机中进行吸附干燥，同时不断搅拌混勻和过筛(60目)，将筛上物进行 粉碎后再次过筛，即可形成高浓缩纯菌粉，此时水分含量约为10% 15%，菌含量可达10 万亿/克，添加0. 5%的丙酸钙作为防霉剂后，可密封常温长期放置。该菌粉可进一步稀释 制成最终产品。实施例2 枯草芽孢杆菌平板发酵生产工艺一、培养基的制备1、种子培养基(按1000mL计)牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、葡萄糖10g、加水至lOOOmL，调节pH8。用500mL三角瓶分装，每个三角瓶分装250mL液体；灭菌30min。2、发酵培养基(按1000mL计)废糖蜜20mL、面粉2g、鱼粉15g、液体蛋白10mL、硫酸锰lg、磷酸氢二钾lg磷酸二 氢钾lg、硫酸镁0. 5g、酵母膏0. 2g、琼脂20g，加水至1000ml，pH调至8。鱼粉的处理和平 板培养基的制备如实施例1。二、发酵生产1.种子制备无菌操作，将菌种进行活化后，取2 3环菌泥接入种子培养基三角瓶中，37°C恒 温摇床中速培养24 30h。合格种子的特征菌液浊度较高，菌膜较少，菌体分分布均勻；镜检时(石炭酸复 红染色)，菌体正处于旺盛分裂期，形态一致，可以见到以菌团为主，表现为粗长杆菌，菌体 很长，分裂节点多，无明显杂菌。此时为最佳接种发酵时间。2.固体平板发酵将种子液均勻喷于上述每一块固体平板培养基上，轻轻摇动至种子液已铺满平板 表面，(100个不锈钢盘共需400ml种子液左右)。然后倒置层叠平板于培养室恒温37°C培养。开始每隔12h对平板进行观察，对菌体生长情况进行记录。12h之后每3h镜检一 次。接种6h后，平板表面开始看到少量菌落，分布均勻，有轻微芽孢杆菌气味；镜检时 可以看到菌体变短变粗(与液体种子的长度比较)，分裂相当旺盛，菌团较多，此时应注意 杂菌的污染，尽量少打开培养箱。接种12h后，此时芽孢杆菌菌体浓度差不多达到平衡状态，同时水份和营养物质 消耗也接近低水平，菌体开始产生芽孢；平板表面会明显出现白色菌膜(菌泥)，菌膜表面比较粗糙，分布均勻，无明显突出单菌落，亲水性较差，水珠在菌膜表面不能够渗透，培养箱 有较强烈的芽孢杆菌的气味；镜检取样时，菌膜比较容易与培养基脱离，粘性较大则不正 常，杂菌较多；100X油镜观察时，菌体开始停止分裂，且菌体分散程度较高。此时菌体可能 内已经产生芽孢，若有单独芽孢分布，则需要计算芽孢率；当芽孢率达到7成以上，或者菌 体(染色完全不透明)较少则可以收集菌泥，不需等到下一步。接种15h到18h，基本上此时芽孢母体已经和芽孢分离，芽孢独立存在，视实际情 况而定立即收集菌泥。注意令芽孢杆菌产生芽孢的重要原因是水分的减少。因此在产生较多芽孢时 应当收集菌泥，时间过长会因此滋生杂菌，同时部分芽孢杆菌生长强力吸收固体培养基内 水分，造成培养基过度干燥，影响菌泥的收集。3.菌体收集步骤同实施例1，可得到高浓缩纯菌粉，此时水分含量约为10% 15%，菌含量可 达10万亿/克，添加0.5%的丙酸钙作为防霉剂后，可密封常温长期放置。该菌粉可进一步 稀释制成最终产品。实施例3 嗜酸乳杆菌平板发酵生产工艺一、培养基的制备1、种子培养基(按1000mL计)牛肉膏10g、蛋白胨10g、乳清粉10g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、硫酸锰0. 3g、 柠檬酸二铵:10g、乙酸钠:2g、硫酸镁0. 6g、酵母膏:5g、吐温801mL，加水至1000mL, pH调 至 6. 2 6. 4。用500mL三角瓶分装，每个三角瓶分装300mL液体；灭菌20min。2、发酵培养基(按1000mL计)鱼粉20g、葡萄糖20g、乳清粉10g、琼脂30g、磷酸氢二钾2g、硫酸锰0. 3g、乙酸 钠2g、硫酸镁0. 6g、酵母膏2g、吐温801-2mL，加水至1000mL pH调至6. 2 6. 4。鱼粉的处理和平板培养基的制备如实施例1。二、发酵生产1.种子制备无菌操作，将菌种进行活化后，取2 3环菌泥接入种子培养基三角瓶中，37°C恒 温摇床中速培养24 30h，得种子液。合格种子的特征菌液浊度较高，菌体分分布均勻，pH明显下降，产生明显的酸香 气味；镜检时(石炭酸复红染色)，菌体正处于旺盛分裂期，形态一致，表现为中等大小的杆 菌，两头圆段，菌体较粗，无明显杂菌。2.固体平板发酵将种子液均勻喷于上述每一块固体平板培养基上，轻轻摇动至种子液已铺满平板 表面，(100个不锈钢盘共需400ml种子液左右)。然后倒置层叠平板于培养室恒温37°C培养。开始每隔12h对平板进行观察，对菌体生长情况进行记录。12h之后每3h镜检一 次。接种后48h左右，嗜酸乳杆菌已在平板表面生成白色的菌泥，镜检合格后，此时可以收集了。3.菌体收集步骤同实施例1，得到高浓缩纯菌粉，此时水分含量约为10% 15%，菌含量可达 10万亿/克，添加0. 5%的丙酸钙作为防霉剂后，可密封常温长期放置。该菌粉可进一步稀 释制成最终产品。以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的 专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
权利要求
一种新的发酵方法，其特征是，主要包括以下步骤(1)种子制备先进行常规的菌种筛选及活化，然后接种于常规三角瓶液体培养基中，在培养箱中培养，得到液体种子；(2)固体平板的制备在非严格厌氧菌的对应的每1000ml液体发酵培养基中，加入18-32g琼脂，灭菌后倒入平板中，冷却后即可制成含液体培养基成份的固体平板培养基；(3)放大发酵将步骤(1)中得到的对应的液体种子均匀喷在固体平板培养基表面，然后放置于35℃-37℃恒温发酵室内封闭发酵培养，根据菌种的不同，培养24-72小时；(4)收集菌泥放大发酵完后，将平板取出发酵室，然后用灭菌的硬薄片，将平板培养基上的菌泥刮下来，收集，得到所需的菌泥。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征是，所述发酵方法还包括将步骤(4)所 得到的菌泥与水按质量比1 0.8-1.2在搅拌混勻后，再按质量比为菌泥二氧化硅= 1 7. 5-8. 5逐步添加干燥二氧化硅后，进行吸附干燥，过60目筛，将筛上物进行粉碎后再 次过60目筛，得到高浓缩纯菌粉。
3.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征是，所述非严格厌氧菌为反硝化假单胞 菌，其固体平板培养基的组成为IOOOmL中主要具有葡萄糖4-5g、面粉1. 5-2. 5g、鱼粉13_17g、硝酸钾4_6g、磷酸氢二 钾 0. 8-1. 2g、磷酸二氢钾 0. 8-1. 2g、硫酸镁 0. 4-0. 6g、酵母膏 0. 15-0. 25g、琼脂 18_22g。
4.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征是，所述非严格厌氧菌为枯草芽孢杆 菌，其固体平板培养基的组成为IOOOmL中主要具有废糖蜜18-22mL、面粉1. 5-2. 5g、鱼粉13_17g、液体蛋白9_llmL、 硫酸锰0. 8-1. 2g、磷酸氢二钾0. 8-1. 2g、磷酸二氢钾0. 8-1. 2g、硫酸镁0. 4-0. 6g、酵母膏`0.15-0. 25g、琼脂 18-22g。
5.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征是，所述非严格厌氧菌为嗜酸乳杆菌， 其固体平板培养基的组成为IOOOmL中具有鱼粉18-22g、葡萄糖18_22g、乳清粉8_12g、琼脂28_32g、磷酸氢二钾`1.8-2. 2g、硫酸锰0. 2-0. 4g、乙酸钠1. 5-2. 5g、硫酸镁0. 5-0. 7g、酵母膏1. 8-2. 2g、吐 温 80 l-2mL。
全文摘要
本发明公开了一种新的发酵方法，该方法主要包括以下步骤(1)液体种子制备(2)固体平板的制备在严格厌氧菌的对应的每1000ml液体发酵培养基中，加入18-32g琼脂，灭菌后倒入平板中，利用琼脂对液体的凝固能力，冷却后即可制成含液体培养基成份的固体平板培养基；(3)放大发酵将步骤(1)中得到的对应的液体种子均匀喷在固体平板表面，然后放置于35℃-37℃恒温发酵室内封闭发酵培养，根据菌种的不同，培养24-72小时；收集菌泥。所述方法成本低、操作简单、后续加工容易，能适用于多数微生物菌种的生产。并可生产出大大突破现有微生物制剂产品含菌浓度上限的产品，可得到达10000亿/克左右菌粉产品。
文档编号C12R1/38GK101864382SQ20101017029
公开日2010年10月20日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者张子曦 申请人:广州市佰沃生物科技有限公司