专利名称：手足口病lamp检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测手足口病病原体的试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒快速检测手足口病病原体的方法。
背景技术：
手足口病(hand，foot and mouth disease, HFMD)是由肠道病毒引起的全球性传染病，世界大部分地区均有流行报导，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹， 在少数患者中可引发心肌炎、肺水肿、脑膜脑炎等并发症。引起该病的主要病原体为柯萨奇病毒 A 组 16 型(Coxsackie A16, CAV16)和肠道病毒 71 型(Enterovirus 71，EV71)。 传统的手足口病病原体检测方法包括病毒分离与中和试验鉴定两步，大概要一周以上的时间，而且步骤繁琐，费时费力。环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)通过识别靶序列上6个特异区域的引物，在一种具有链置换特性的 DNA聚合酶作用下，能够在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA靶序列，在反应体系中加入逆转录酶，可以检测RNA靶序列。LAMP在合成DNA的同时还产生大量的焦磷酸根离子，它们能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可根据反应体系中是否形成白色沉淀来定性判断。
发明内容
本发明的目的在于利用LAMP技术，研制出适用于临床检测手足口病病原体柯萨奇病毒A16型和肠道病毒EV 71型的试剂盒及检测方法。本发明的技术方案一种手足口病病原体检测试剂盒，包括以下成分(1)病毒RNA提取试剂病毒RNA的抽提可以采用常规的Trizol法，也可使用各生物公司生产的病毒RNA 抽提试剂盒。(2) LAMP检测反应液①反应液Cox A16-用于检测柯萨奇病毒A16型含有以下成分10 χ LAMP 缓冲液(200mmol/L Tris-HCl,100mmol/L KCl,20mmol/LMgS04, 100mmol/L(NH4)S04,1. O % Tritonx-100) ；IOOmmo1/L MgS04 ；25mmol/L dNTP ；5mol/L betaine(甜菜碱)；20umol/L 引物 CoxA16_FIP ；20umol/L 引物 CoxA16_BIP ；5umol/L 引物 CoxA16-F3 ； 5umol/L 引物 CoxA16_B3 ；DEPC 处理水。其中引物序列为CoxA16-FIP 5-AAGTRGGTTTCGGAGCCCCTTTTTTAGCCAAACCCAATGGTGAG-3CoxA16-BIP
5-TTYGCTTGGCARACTGCTACCATTTTAGGGGACTGACACTTGAGC-3CoxA16-F3 5-ACATGCGCTTTGAYGCTGAA-3CoxA16-B3 5-GCACTGGCTGGTGACATG-3②反应液EV71-用于检测肠道病毒71型10 χ LAMP 缓冲液(200mmol/L Tris-HCl,100mmol/L KCl,20mmol/LMgS04, 100mmol/L(NH4)S04,1. O % Tritonx-100) ；lOOmmol/L MgS04 ；25mmol/L dNTP ；5mol/ L betaine(甜菜碱)；20umol/L 引物 EV71-FIP ；20umol/L 引物 EV71-BIP ；5umol/L 引物 EV71-F3 ；5umol/L 引物 EV71-B3 ；DEPC 处理水。其中引物序列为EV71-FIP 5-CAACTTCCCCGGTGGGTGTGTTTTCCTACATGCGCTTTGATGCA-3FV71-BIP 5-TATGTTTGTGCCACCTGGAGCCTTTTGGGGTTAGTGGCGGTTTG-3EV71-F3 5-GCGCAAATGCGTAGAAAGG-3EV71-B3 5-AGGGTCTGACAGCTTGACAA-3③酶混合液包括Bst DNA聚合酶(8U/ul)和AMV逆转录酶(8U/ul)本发明的另一技术方案是一种手足口病病原体LAMP检测试剂盒检测柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型的检测方法，其主要技术步骤包括(1)样本中RNA病毒的抽提样本采集和处理参照卫生部《手足口病实验室检测方案》的方法。样本中RNA病毒的抽提采用常规的Trizol法或使用病毒RNA抽提试剂盒。(2)手足口病病原体LAMP扩增取两只200ul PCR管，分别按照权利要求2中的试剂盒成分，配制24ul的柯萨奇病毒A16型的反应液和肠道病毒71型的反应液。每只管中加入Iul待检的RNA，于64°C的水浴锅、金属浴或PCR仪中放置90min，然后80°C放置5min。(3)扩增产物的检测方法1 取出PCR反应管，8000r/min离心15sec，观察管底是否有白色沉淀产生。 在阳性对照管有白色沉淀，阴性对照管无沉淀的条件下①待检样品中有白色沉淀的结果为阳性，②无白色沉淀的为阴性。若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，检测结果无效。方法2 取出PCR反应管，短暂离心，1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统观察是否出现梯形条带。在阳性对照管有出现梯形条带，阴性对照管无梯形条带条件下① 待检样品中有梯形条带的结果为阳性，②无梯形条带的为阴性。若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，检测结果无效。方法3 取出PCR反应管，冷却至室温，2000r/min离心15sec，分别加入1 μ L1000X SYBR Green I染料，轻轻混勻，即可观察；建议在黑色背景下观察。在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下①待检样品反应管液体呈绿色结果为阳性， ②待检样品反应管液体呈橙色结果为阴性。若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，检测结果无效。本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在本发明建立了手足口病病原体LAMP检测试剂盒及其检测方法，本试剂盒根据柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型的特异基因VPl基因保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物。本发明采用LAMP技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴箱即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用肉眼或荧光染料来观察即可，简单而快速，特别适合于基层现场应用。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是对靶基因的6个部位设定4种引物，禾IJ用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增。由于其反应是多种引物共同启动，使得反应结果比PCR更特异，另外，由于实行的是等温扩增，反应在恒温水浴箱内便可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适于现场快速检测。本发明解决了现有技术中检测手足口病病原体的方法所需周期长、灵敏度较低、成本高、现场应用困难等缺陷，提供的手足口病病原体的检测试剂盒及其检测方法，对手足口病病原体进行LAMP检测，快速、准确性高、灵敏性好、现场应用方便，可广泛应用临床检验。
具体实施例方式下列实例进一步说明本发明，但不应该当作对本发明的限制。该试剂盒包含以下成分(1)病毒RNA提取试剂病毒RNA的抽提可以采用常规的Trizol法，也可使用各生物公司生产的病毒RNA 抽提试剂盒。(2) LAMP检测反应液①反应液Cox A16-用于检测柯萨奇病毒A16型含有以下成分10 χ LAMP 缓冲液(200mmol/L Tris-HCl,100mmol/L KCl,20mmol/LMgS04, 100mmol/L(NH4) SO4,1. O % Tritonx-100) ； lOOmmol/L MgSO4；25mmol/LdNTP ；5mol/L betaine(甜菜碱)；20umol/L 引物 CoxA16_FIP ；20umol/L 引物 CoxA16_BIP ；5umol/L 引物 CoxA16-F3 ；5umol/L 引物 CoxA16_B3 ；DEPC 处理水。其中引物序列为CoxA16-FIP 5-AAGTRGGTTTCGGAGCCCCTTTTTTAGCCAAACCCAATGGTGAG-3CoxA16-BIP 5-TTYGCTTGGCARACTGCTACCATTTTAGGGGACTGACACTTGAGC-3CoxA16-F3 5~ACATGCGCTTTGAYGCTGAA~3CoxA16-B3 5~GCACTGGCTGGTGACATG~3②反应液EV71-用于检测肠道病毒71型
IOx LAMP缓冲液(200mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L KCl,20mmol/LMgS04, IOOmmol/ L(NH4)SO4,1. O % Tritonx-100) ； IOOmmo 1/L MgSO4 ；25mmol/LdNTP ；5mol/L betaine (甜菜碱)；20umol/L 引物 EV71-FIP ；20umol/L 引物 EV71-BIP ；5umol/L 引物 EV71-F3 ；5umol/L 引物EV71-B3 ；DEPC处理水。其中引物序列为EV71-FIP 5-CAACTTCCCCGGTGGGTGTGTTTTCCTACATGCGCTTTGATGCA-3EV71-BIP 5-TATGTTTGTGCCACCTGGAGCCTTTTGGGGTTAGTGGCGGTTTG-3EV71-F3 5~GCGCAAATGCGTAGAAAGG~3EV71-B3 5~AGGGTCTGACAGCTTGACAA~3③酶混合液包括Bst DNA聚合酶(8U/ul)和AMV逆转录酶(8U/ul)LAMP检测检测柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型的最佳24ul反应体系分别是①检测柯萨奇病毒A16型的反应体系为24ul，成分组成见表1表1柯萨奇病毒A16型的反应体系组成
权利要求
1.一种手足口病病原体LAMP检测试剂盒，包含以下成分(1)病毒RNA提取试剂病毒RNA的抽提可以采用常规的Trizol法，也可使用各生物公司生产的病毒RNA抽提试齐U盒。(2)LAMP检测反应液①反应液CoxA16-用于检测柯萨奇病毒A16型含有以下成分IOx LAMP 缓冲液(200mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L KCl, 20mmol/LMgS04, IOOmmol/ L(NH4)SO4,1. O % Tritonx-100) ； IOOmmo 1/L MgSO4 ；25mmol/LdNTP ；5mol/L betaine (甜菜碱)；20umol/L 引物 CoxA16-FIP ；20umol/L 引物 CoxA16_BIP ；5umol/L 引物 CoxA16_F3 ； 5umol/L 引物 CoxA16-B3 ；DEPC 处理水。 其中引物序列为 CoxA16-FIP 5-AAGTRGGTTTCGGAGCCCCTTTTTTAGCCAAACCCAATGGTGAG-3 CoxA16-BIP 5-TTYGCTTGGCARACTGCTACCATTTTAGGGGACTGACACTTGAGC-3 CoxA16-F3 5-ACATGCGCTTTGAYGCTGAA-3 CoxA16-B3 5-GCACTGGCTGGTGACATG-3②反应液EV71-用于检测肠道病毒71型IOx LAMP 缓冲液(200mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L KCl, 20mmol/LMgS04, IOOmmol/ L(NH4) SO4,1. O % Tritonx-100) ； IOOmmol/LMgSO4 ；25mmol/LdNTP ；5mol/L betaine (甜菜碱)；20umol/L 引物 EV71-FIP ；20umol/L 引物 EV71-BIP ；5umol/L 引物 EV71-F3 ；5umol/L 引物EV71-B3 ；DEPC处理水。 其中引物序列为 EV71-FIP 5-CAACTTCCCCGGTGGGTGTGTTTTCCTACATGCGCTTTGATGCA-3 EV71-BIP 5-TATGTTTGTGCCACCTGGAGCCTTTTGGGGTTAGTGGCGGTTTG-3 EV71-F3 5-GCGCAAATGCGTAGAAAGG-3 EV71-B3 5-AGGGTCTGACAGCTTGACAA-3③酶混合液包括Bst DNA聚合酶(8U/ul)和AMV逆转录酶(8U/ul)
2.根据权利要求1中所述的一种手足口病病原体LAMP检测试剂盒，其特征在于 ①检测柯萨奇病毒A16型的反应体系为24ul，成分组成见表1表1柯萨奇病毒A16型的反应体系组成
3.根据权利要求1所述的一种手足口病病原体LAMP检测试剂盒检测手足口病病原体的方法，其步骤包括(1)样本中RNA病毒的抽提样本采集和处理参照卫生部《手足口病实验室检测方案》的方法。样本中RNA病毒的抽提采用常规的Trizol法或使用病毒RNA抽提试剂盒。(2)手足口病病原体LAMP扩增取两只200ul PCR管，分别按照权利要求2中的试剂盒成分，配制24ul的柯萨奇病毒 A16型的反应液和肠道病毒71型的反应液。每只管中加入Iul待检的RNA，于64°C的水浴锅、金属浴或PCR仪中放置90min，然后 80°C放置 5min。(3)扩增产物的检测方法1 取出PCR反应管，8000r/min离心15sec，观察管底是否有白色沉淀产生。在阳性对照管有白色沉淀，阴性对照管无沉淀的条件下①待检样品中有白色沉淀的结果为阳性，②无白色沉淀的为阴性。若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，检测结果无效。方法2 取出PCR反应管，短暂离心，1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统观察是否出现梯形条带。在阳性对照管有出现梯形条带，阴性对照管无梯形条带条件下①待检样品中有梯形条带的结果为阳性，②无梯形条带的为阴性。若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，检测结果无效。方法3 取出PCR反应管，冷却至室温，2000r/min离心15sec，分别加入1μ LlOOOX SYBR Green I染料，轻轻混勻，即可观察；建议在黑色背景下观察。在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下①待检样品反应管液体呈绿色结果为阳性，②待检样品反应管液体呈橙色结果为阴性。若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，检测结果无效。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种用于检测手足口病主要病原体柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV71)的LAMP试剂盒及其建立方法和应用。该试剂盒包含检测柯萨奇病毒A16型四条LAMP引物的LAMP反应液和检测肠道病毒71型的四条LAMP引物的LAMP反应液。经检测验证，本发明试剂盒具有良好的特异性灵敏度，扩增快速、高效，且鉴定简便。本发明的检测体系在64℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型，不需要复杂仪器，能较好满足对手足口病的临床检测，易于大范围推广应用。
文档编号C12Q1/68GK102242223SQ201010170608
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者刘代新, 刘军辉, 李昂 申请人:上海吉美生物工程有限公司