一种用于检测食管鳞状细胞癌的微小核糖核酸组合及其应用的制作方法

专利名称：：一种用于检测食管鳞状细胞癌的微小核糖核酸组合及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及微小核糖核酸(microRNA，简称miRNA)的应用，具体涉及一种用于检测食管鳞状细胞癌的miRNA组合，以及包含对应于所述miRNA组合的TaqMan探针组合的试剂盒。
背景技术：
：食管鳞状细胞癌是一种原发于食管的恶性肿瘤，占食管癌90%以上，进行性吞咽困难为其典型的临床表现。食管鳞状细胞癌具有高发病率、高死亡率和低检出率的二高一低特点。目前，全球范围内食管鳞状细胞癌发病率居各种肿瘤第八位，死亡率居第六位。全球每年新增食管鳞状细胞癌人数41万，死亡约31万。我国是食管鳞状细胞癌高发区，年平均死亡率为14.59/10万，年平均死亡15万人，占消化系统肿瘤第二位，仅次于胃癌。食管鳞状细胞癌早期症状不明显，有临床症状而到医院就诊时部分患者已为中晚期。目前外科手术切除仍是治疗食管鳞状细胞癌的主要方法，我国食管鳞状细胞癌的外科手术切除率已达80%90%，术后5年生存率为25%30%，而早期食管鳞状细胞癌的5年生存率达90%以上。由此可见食管鳞状细胞癌的早期诊断是提高其存活率的关键和重要前提条件。目前临床使用的诊断方法包括影像学、内镜检查与组织活检、食管粘膜脱落细胞学检查等，但这些方法在早期诊断上都有一定的缺陷影像学对早期食管鳞状细胞癌变的诊断有一定的局限性，而组织细胞检测有其固有的缺陷，取材不当或人为经验不足等都将导致误诊。尽管已发现一些肿瘤标志物，如鳞状细胞癌抗原和癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)等，但对食管鳞状细胞癌诊断的敏感度及特异度远达不到临床要求。目前食管鳞状细胞癌临床治疗效果和中位生存期都不令人满意，防治形势异常严峻。因此，寻找特异性高和敏感性好的食管鳞状细胞癌标志物迫在眉睫。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，其主要功能是参与基因转录后水平调控。miRNA通过与靶mRNA3’端非翻译序列完全或部分互补结合，导致靶mRNA降解或转录后翻译抑制从而调控靶基因的表达。miRNA参与1/3人类蛋白编码基因调控，它与多种生理活动有关，如生长发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等；也与许多疾病的发生发展密切相关，如糖尿病、心血管疾病、肿瘤等。最近的研究显示[1_3]，miRNA在肿瘤发生、发展过程中发挥抑癌基因或癌基因样作用。已证实，肿瘤组织和肿瘤细胞中的某些miRNA表达水平发生了变化，相对于正常组织，一些miRNA表达量显著上升或下降。许多癌组织如肺癌、乳腺癌和食管癌等组织都有若干组织特异性miRNA的表达，提示miRNA有肿瘤组织特异性。另外，miRNA的表达也与肿瘤分化程度以及预后有关。大量的研究结果揭示，miRNA可作为新的肿瘤标志物，且为肿瘤的基因治疗提供新靶点。但组织标本取材属创伤性检出，且无法实现肿瘤的早期诊断和预后判断。最近报道显示[4_8]，人血清/血浆中也存在丰富、稳定的miRNA，一些肿瘤包括非小细胞肺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者血清中miRNA表达谱与正常人有显著差异，均有3各自特异的表达谱，同时这种变化还可见于早期癌中。目前尚没有利用无创伤性、取材方便的血液标本检测判断与食管鳞状细胞癌相关的特异性miRNA组合及检测试剂盒。
发明内容本发明的目的就在于通过研究食管鳞状细胞癌患者血清miRNA的特异性变化，筛选出与正常人表达差异显著的一组血清miRNA，并利用这些miRNA的TaqMan探针制备出适用于临床诊疗用途的试剂盒，为实现食管鳞状细胞癌早期诊断提供特异性的中间结果以及迅速的无创伤性检测手段。本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的一种用于检测食管鳞状细胞癌的miRNA组合，该miRNA组合包括下列miRNAmiR-22、miR-127-3p、miR-148b和miR-223。所述的miRNA组合进一步包括以下miRNA中的一种或多种miR_10a、miR-100和miR-133a。一种用于检测食管鳞状细胞癌相关的miRNA的探针组合，其特征在于该探针组合包括权利要求1所述miRNA的探针的组合。进一步，该探针组合还包括以下miRNA探针中的一种或多种miR-10a、miR-100和miR_133a。所述的探针组合为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4-M一步，该探针组合还包括以下miRNA探针中的一种或多种SEQIDNO.5、SEQIDNO.6和SEQIDNO.7。上述的任一miRNA组合或任一探针组合在制备检测食管鳞状细胞癌的试剂或工具中的应用。一种用于检测食管鳞状细胞癌的检测试剂盒，该试剂盒包含上述任意一项探针组合；所述试剂盒还可以包括Taq酶、dNTP、氯化镁和PCR缓冲液(PCR缓冲液为通用的10XPCR缓冲液，不含Mg2+)。以下是对本发明的进一步描述一种用于检测食管鳞状细胞癌的miRNA组合，其包括下列miRNA:miR_22、miR-127-3p、miR-148b和miR-223。该miRNA组合可以进一步包括以下miRNA中的一种或多种miR-10a、miR-100和miR_133a。上述miRNA组合的筛选方法包括以下步骤(见图1)(1)收集食管鳞状细胞癌患者混合血清或血浆，提取总RNA；(2)采用高灵敏度、高精确性和高重复性的Solexa测序技术(Solexasequencingtechnology)，对上述总RNA中已知的人成熟miRNA(miRBasel2.0，共692种)进行检测，与年龄、性别匹配的非癌对照组比对后初筛出食管鳞状细胞癌患者血清中表达显著升高的miRNA；(3)用实时荧光定量PCR方法(TaqMan探针法)对一组标本进行逐个检测，从Solexa方法初筛出的miRNA中复筛出表达差异显著的miRNA；(4)进一步用定量PCR方法对大批量标本进行逐个验证，筛选出稳定的表达差异显著的一组miRNA。(Solexa初筛的目的是筛选出食管鳞癌组和正常组之间有显著差异的miRNA，更侧重于定性和趋势；复筛采用的是准确的荧光定量PCR，对单个样本中每个miRNA的含量进行测定，则侧重于定量；荧光定量PCR是对Solexa初筛定性的基础上进一步精确定量，两者是一致的，只是侧重点不同)。具体来说，上述筛选方法包括以下步骤(1)分别收集正常及食管鳞状细胞癌的混合血清或血浆，并提取总RNA；(2)根据已知的人692种成熟miRNA，运用Solexa测序技术对上述RNA进行测序和检测，初筛出食管鳞状细胞癌与非癌对照组表达差异显著的一些miRNA；(3)将抽提的RNA逆转录为cDNA，采用荧光定量PCR(TaqMan探针法)对初筛出的miRNA进行复筛和验证，挑选出稳定、特异表达的一组miRNA。本发明使用的检测方法可以选自RT_PCR方法、Solexa测序技术(Solexasequencingtechnology)>Real-timePCR方法中的一种或几种。例如，血清中miRNA分子的检测方法包括以下步骤(1)使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取血清总RNA；(2)通过RNA逆转录反应得到cDNA；(3)根据人全部六百多个成熟体miRNA设计引物进行PCR反应；(4)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；(5)EB染色后在紫外灯下观察结果。在所述步骤(5)之后还可以包括下列步骤用TaqMan探针法检测并比较病人血清样本相对于正常血清中miRNA的量的变化。本发明还提供了一种用于检测食管鳞状细胞癌的miRNA的探针组合，其包括下列miRNA的TaqMan探针的组合此外，本发明提供了上述miRNA组合或上述TaqMan探针组合在制备检测食管鳞状细胞癌的试剂或工具中的用途。本发明还提供一种用于检测食管鳞状细胞癌的试剂盒，该试剂盒含有下列探针上述试剂盒可以进一步包括以下TaqMan探针中的一种或多种在本发明的一个具体实施方案中，上述试剂盒包括Taq酶和dNTP，氯化镁、10XPCR缓冲液(不含Mg2+)和包括正常血清中稳定存在且可检测到的全部miRNATaqMan探针(ABI公司提供，专用于miRNA荧光定量)。本发明所述食管鳞状细胞癌包括各种病理分化程度以及各种临床分期食管鳞状细胞癌。具体而言，所述食管鳞状细胞癌可以是高分化、中分化和低分化；可以是临床I期、II期、III期和VI期。本发明所述的miRNA组合及其对应的探针组合，以及含有所述探针组合的试剂盒可应用于食管鳞状细胞癌的检测之中。本发明的有益效果首先，血清相对其它组织较易获得，与食管组织活检相比，属于无创性检查，极大地方便了医疗人员的使用，更减轻了患者的痛苦；其次，血清中的miRNA反映的是机体整体的病理、生理情况，其检测结果具有精确而详细的指导意义；第三，所筛选出的miRNA组合对食管鳞状细胞癌诊断的灵敏度显著高于目前临床上使用的肿瘤标志物CEA，大大提高了诊断的准确性。此外，血清miRNA检测能在分子水平上反映疾病发生过程中基因转录后调控状态，并为食管鳞状细胞癌的治疗提供了潜在靶占.第四，本发明所筛选出的食管鳞状细胞癌血清miRNA组合与至今已报道[4_8]的其他肿瘤患者血清中特异变化的miRNA不尽相同；第五，本发明的试剂盒所包含的TaqMan探针同样是基于Solexa技术、定量PCR技术筛选出的在食管鳞状细胞癌与正常状态下表达差异显著的一组血清miRNATaqMan探针，这样可以增加检测的灵敏度和特异性，提高检测水平。综上所述，本发明提供的特异的miRNA组合作为诊断食管鳞状细胞癌的中间结果，有助于医师结合临床症状、病史或其他检查信息进行食管鳞状细胞癌的诊断。检测血清中的miRNA简单易行且效果优越。基于此制备的用于检测血清miRNA的试剂盒投入实践使用，仅仅需要病人的血清或血浆而不需要任何其它组织通过最精简的TaqMan探针库来检测血清miRNA水平能拓展食管鳞状细胞癌的检测指标，提高检测的灵敏度，丰富检测食管鳞状细胞癌的手段，这些血清miRNA有望成为诊断食管鳞状细胞癌的重要标志分子，具有极重要的临床应用潜力和价值。图1为本发明的主要流程图。图2为TaqMan探针定量PCR方法的标准曲线。图3为TaqMan探针定量PCR方法的重复性。A.miRNA提取方法的重复性；B.定量PCR方法的重复性。图4为筛选出的每种miRNA(A_G)、7种miRNA的组合(H)以及CEA⑴在食管鳞状细胞癌与非癌对照中的R0C曲线。食管鳞状细胞癌149例，非癌对照者100例。具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1食管鳞状细胞癌的特异miRNA表达谱初筛(1)分别收集未转移、转移食管鳞状细胞癌以及正常者血清标本86例、55例和40例，三组标本分别混合；(2)分别提取三组混合血清中的RNA，具体方案为利用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，得到的上清液使用酚氯仿三步法进一步去除蛋白等杂质提纯RNA；(3)对三组混合血清总RNA进行Solexa测序分析。具体方案为SoleXa测序法的基础是单分子克隆阵列技术，能够在整个基因组水平上区分单个碱基的差别，从而区分个体间的差异。先将接头连接到小分子RNA片段上，再经PCR扩增后制成库。随后在含有接头的芯片上加入已连接接头的小分子RNA，经反应，将不同片段扩增。在下一步反应中，四种荧光标记的染料用边合成边测序的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被CCD采集，CCD快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。最后再比对序列，筛选出所要得到的miRNA的拷贝数。(4)Solexa分析食管鳞状细胞癌与正常血清中表达差异显著的miRNA；人类miRNA数据库(miRbase12.0和Sangerdata最新版本)中包含的miRNA共有692种，采用Solexa技术检测血清中所有692种miRNA序列和拷贝数值，拷贝值反映各种miRNA的表达量。若拷贝数=0表示血清中没有该miRNA，拷贝数值越大，其相对的miRNA的表达量越多。若miRNA在三组中的拷贝数都大于50，同时与正常血清的Solexa测序结果相比，未转移及转移食管鳞状细胞癌拷贝数均上升，变化倍数大于2.0，且与对照组绝对值之差大于70时，被认为显著变化，否则视为不变化。结果发现，在检测的692种miRNA中，共有25种在患者混合血清中显著升高(详见表1)。表ISolexa测序初筛出的在食管鳞状细胞癌血清中表达上调的miRNA实施例2血清中miRNA的实时荧光定量PCR实验(TaqMan探针法)采用定量PCR方法对批量标本逐个验证，从Solexa方法初筛出的miRNA中筛选出表达差异显著miRNA。首先将提取的血清总RNA反转录成cDNA。针对每一种miRNA，设计一个含相同茎环结构的基因特异性反向引物，利用miRNA特异性反向引物进行逆转录，得到含共同茎环结构但属于特定miRNA的cDNA(ABI公司产品)。仪器使用的是ABIPrism7300荧光定量PCR仪。本实验以不同浓度人工合成的miR-16成熟体作标准曲线。人工合成的miR-16原液逆转录成cDNA，用DEPC水分别稀释成107、106、105、104和103fmol/L浓度梯度。miR-16的8cDNA需单独逆转，反应体系为2u1RNA,2u15XAMV缓冲液、1yllOmM各种dNTP混合物(Takara公司)、0.AMV(Takara公司)以及1ii1miR-16逆转录引物(美国ABI公司提供，专用于miRNA逆转录)，用3.5iUDEPC水补足体积至10yl。用作标准曲线的miR-16荧光定量PCR反应体系liilcDNA.O.3u1Taq酶(Takara公司)、0.33u1TaqMan探针(由ABI公司提供，专用于miRNA荧光定量)、1.2yl25mMMgCl2、0.4ii12.5mM各种dNTP混合物(Takara公司产品)、2ii110XPCR缓冲液以及14.77u1DEPC水。待测标本中的每种miRNA检测时所采用的逆转录体系和荧光定量PCR反应体系同用作标准曲线的人工合成的miR-16，不过每种miRNA用各自特有的逆转录引物和TaqMan探针(由ABI公司提供)。数据处理方法为相对的绝对定量法，即每次进行荧光定量PCR时，将所需检测的样本与标准曲线(人工合成miR-16的107，106，105，104和103fmol/L五个浓度梯度)同时进行PCR扩增，扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值，然后根据标准品miR-16的浓度及每个浓度对应的CT值绘制标准曲线(图2)(此标准曲线是以miR-16绘制的标准曲线；CT值的计算是公知的；图中的R指代的是pearson相关系数，可以从侧面反映出所作直线的斜率，计算方式可以通过Excel绘制散点图并添加趋势线得到，也可通过其他常用统计软件如SPSS13.0，statistics.0等计算)并根据此标准曲线及待测样本的CT值计算出该样本所需测定的miRNA相对的绝对含量。评估所采用的定量PCR方法的重复性1.miRNA提取方法的重复性取20例正常人血清，混合后分成相同的两份(每份500yl)，分别提取其总RNA，然后用定量PCR方法测定表达水平从低到高的20种miRNA(包括miR-7,10a,21，22，23a,100，127_3p，133a,148b,185，223，320a，342-5p，345，423-5p，483，484，221，222，874)这20种miRNA是随机选择的，包含表达量由低到高的三类miRNA，是为了说明提取各种浓度的miRNA都有较好的重复性)，每种miRNA重复测定3次，取平均值。相关性分析显示，两份标本所测结果的相关系数(pearson's系数)接近1(R2=0.9897)(图3A)，提示miRNA提取方法重复性好。2.定量PCR方法的重复性另取20例正常人血清，混合后提取总RNA，将RNA分成相同的两份，然后用定量PCR方法测定上述20种miRNA。同样，每种miRNA重复3次，取平均值。相关性分析显示，两份RNA所测结果的相关系数接近1(R2=0.9973)(图3B)，表明本发明所采用的定量PCR方法具有很好的重复性。实施例3定量PCR方法对初筛出的血清miRNA复筛用TaqMan定量PCR方法对一组受试者标本进行逐个检测，从Solexa方法初筛出的25种miRNA中筛选出患者组与对照组之间表达差异显著的miRNA(具体步骤参见实施例2)。该组食管鳞状细胞癌患者36例，以年龄、性别匹配的无癌33例作对照(病人详细临床信息见表2)。结果发现，初筛出的25种miRNA中有7种miRNA在患者组中表达量显著高于对照组(含量表示方法为均值士标准差；变化倍数为1.652.97倍，p<0.0001)，这7种miRNA是miR-10a、miR-22、miR-100、miR_148b、miR-223、miR_133a和miR-127_3p(见表3)。表2受试者的临床信息表3定量PCR方法复筛出的miRNA非参Mann-Whitney检验实施例4定量PCR方法对复筛出的血清miRNA的临床验证将复筛出的7种miRNA进一步用定量PCR方法在大批量临床标本中进行验证，筛选出稳定的、表达差异显著的miRNA。临床研究的受试者食管鳞状细胞癌患者113例，以年龄、性别匹配的无癌67例作对照(两组的详细临床信息见表4)。验证结果证实，复筛出的7种miRNA在大批量患者标本中表达量显著高于对照(含量表示方法为均值士标准差；是对照组的1.692.57倍，p<0.0001)(结果见表5)。表4临床验证受试者的临床信息表5定量PCR方法对复筛出的miRNA用大批量标本验证结果非参Mann-Whitney检验实施例4筛选出的miRNA临床价值评估运用不同的miRNA组合对病人与正常人之间进行聚类分析。在验证组中(患者n=113，对照=67)，miR-22、miR-127_3p、miR_148b和miR-223等4种miRNA的组合能将85.8%(97/113)的癌患者与正常对照区分开来，同时也将76.正常对照(51/67)与癌患者正确区分开。而miR-22、miR-127-3p、miR-148b、miR-223、miR-10、miR-100和miR-133a等7种miRNA的组合能将77.9%癌患者(88/113)与正常对照区分开来，同时也将80.正常对照(55/67)与癌患者正确区分开。将复筛组和验证组血清标本综合起来(患者n=149，对照n=100)对早期癌患者(包括临床I、II期，共106例)和正常对照标本聚类分析发现，7种miRNA的组合可将绝大多数早期癌患者(80.2%，85/106)与正常对照区(80.0%，80/100)分开来。说明miRNA组合可应用于食管鳞状细胞癌的早期诊断。将复筛组和验证组血清标本综合起来(患者n=149，对照n=100)，根据每份标本血清miRNA的表达量绘制R0C曲线和计算曲线下面积(AUC)评估筛选出的miRNA对食管鳞状细胞癌诊断的准确性(图4A-G)，并与目前临床上使用的肿瘤标志物CEA进行比较(图41)。结果发现这7种miRNA的AUC在0.720.84之间，均大于CEA(AUC=0.55)(见表6)。进一步将7种miRNA组合在一起，根据每份标本(包括患者和对照)的危险分数值绘制R0C曲线(图4H)，当最适cut-off为2.41时，miRNA组合对食管鳞状细胞癌诊断的敏感性(66%)是CEA(13%)的5倍(表7)。说明miRNA组合对食管鳞状细胞癌诊断的敏感性远高于目前临床上所使用的肿瘤标志物。表6筛选出的miRNA和CEA的AUC实施例5用于检测血清miRNA的试剂盒用于检测食管癌的血清miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程是基于Solexa技术和定量PCR技术所测结果，将下述TaqMan探针组合SEQIDN0:14或SEQIDN0:14+57中一种或多种分别收集到PCR试剂盒(RT-PCR或Real-timePCR)中制备特定TaqMan探针组合的食管鳞状细胞癌检测试剂盒。所述试剂盒的具体组成(检测每种miRNA)如下PCR水14.77u110Xbuffer2u1MgCl21.2u1dNTP0.4u1Taq酶0.3u1TaqMan探针0.33u1cDNA1u1所制备试剂盒的具体操作流程如下(1)收集受试者的血清样本，提取RNA后逆转录制备cDNA样品；(2)按照上述配方加样，各种miRNA分别测定，在测定时，使用各自miRNA特定的TaqMan探针。(3)进行PCR反应，条件为95°C5min,95°C15s，60°Clmin(60°Clmin这一阶段包含了退火和延伸两个步骤，该程序是ABI公司推荐的程序)，40个循环。首先通过Solexa技术初筛，然后通过定量PCR技术进一步筛选在疾病及正常生理状态下表达量差异程度大的一组血清miRNA，作为检测食管癌的TaqMan探针。该试剂盒包括本发明所提供的血清miRNA的TaqMan探针，Taq酶以及dNTP等试剂。所述试剂盒的价值在于以特定的TaqMan探针组合检测血清miRNA表达量，可提高食管鳞状细胞癌检测的灵敏度、准确性，有助于该病的早期发现。因此该试剂盒投入实践使用可以把疾病的诊断和治疗推上一个新高度。实施例6血清miRNA检测试剂盒的临床应用用制备的血清miRNA检测试剂盒对临床标本进行测定。临床研究的受试者食管鳞状细胞癌患者30例，对照组30例(两组的详细临床信息见表8)。表8临床验证受试者的临床信息(1)含TaqMan探针组合SEQIDNO14的试剂盒的临床标本检测结果含TaqMan探针组合SEQIDNO:14的试剂盒可同时测定miR-22、miR-127_3p、miR-148b和miR-223等4种miRNA的表达量。对临床标本测定结果显示，该试剂盒所检测的4种miRNA在患者中表达量显著高于对照组(p<0.0001)(见表9)。表9探针组合SEQIDNO:14的试剂盒的测定结果miR-22——345.75±128.46633.42±302.095.21xlO"6miR-127-3p321.35士189.23587.34±311.211.50xl0"5miR-148b553.15±301.241043.54±412.51l.OlxlO"6miR-22352672.35±20145.1494809.72士62530.161.58x10—5非参Mann-Whitney检验(2)含TaqMan探针组合SEQIDNO:15的试剂盒的临床标本检测结果含TaqMan探针组合SEQIDNO:15的试剂盒可同时测定miR-22、miR-127_3p、miR-148b,miR-223和miR-10a等5种miRNA的表达量。对临床标本测定结果显示，该试剂盒所检测的5种miRNA在患者中表达量显著高于对照组(p<0.0001)(见表10)。表10探针组合SEQIDN0:15的试剂盒的测定结果非参Mann-Whitney检验(3)含TaqMan探针组合SEQIDNO1含TaqMan探针组合SEQIDNO:17的试剂盒可同时测定miR-22、miR-127_3p、miR-148b、miR-223、miR-10a、miR-100和miR_133a共7种miRNA的表达量。对临床标本测定结果显示，该试剂盒所检测的7种miRNA在患者中表达量显著高于对照组(p<0.0001)(见表11)。表11探针组合SEQIDNO:17的试剂盒的测定结果非参Mann-Whitney检验参考文献1.Esquela-KerscherA，SlackFJ.Oncomirs—microRNAswitharoleincancer.NatureReviewsCancer2006；6259~69.2.CalinGA,CroceCM.MicroRNAsignaturesinhumancancers.NatureReviewsCancer2006；6:857_66.3.FeberA，XiLQ，LuketichJD，etal.MicroRNAexpressionprofilesofesophagealcancer.JThoracCardiovascSurg2008；135255~60.4.ChenX，BaY，MaLJ，etal.CharacterizationofmicroRNAsinserumanovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases.CellResearch2008；18:997_1006.5.MitchellPS,ParkinRK,KrohEM,etal.CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection.ProcNatlAcadSciUSA2008；10510513-8.6.NgEK，ChongWW,JinH，etal.DifferentialexpressionofmicroRNAsinplasmaofpatientswithcolorectalcancer:Apotentialmarkerforcolorectalcancerscreening.Gut2009；58:1357_8L7.ResnickKE，AlderH，HaganJP，etal.ThedetectionofdifferentiallyexpressedmicroRNAsfromtheserumofovariancancerpatientsusinganovelrealtimePCRplatform.GynecolOncol2009；11255-59.8.WangJ,ChenJ，ChangP,etal.MicroRNAsinplasmaofpancreaticductaladenocarcinomapatientsasnovelblood-Basedbiomarkersofdisease.CancerPrevRes2009；2:807_13o权利要求一种用于检测食管鳞状细胞癌的miRNA组合，其特征在于该miRNA组合包括下列miRNAmiR-22、miR-127-3p、miR-148b和miR-223。2.根据权利要求1所述的miRNA组合，其特征在于所述miRNA组合进一步包括以下miRNA中的一种或多种miR-10a、miR-100和miR_133a。3.一种用于检测食管鳞状细胞癌相关的miRNA的探针组合，其特征在于该探针组合包括权利要求1所述miRNA的探针的组合。4.根据权利要求3所述的探针组合，其特征在于所述探针组合进一步包括以下miRNA探针中的一种或多种miR-10a、miR-100和miR_133a。5.根据权利要求3所述的探针组合，其特征在于所述miRNA的探针的组合为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。6.根据权利要求5所述的探针组合，其特征在于所述探针组合进一步包括以下miRNA探针中的一种或多种:SEQIDNO.5、SEQIDNO.6和SEQIDNO.7。7.权利要求1或2所述的miRNA组合或权利要求3至6中任一项所述的探针组合在制备检测食管鳞状细胞癌的试剂或工具中的应用。8.一种用于检测食管鳞状细胞癌的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求3至6中任一项所述的探针组合；所述试剂盒还可以包括Taq酶、dNTP、氯化镁和PCR缓冲液。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，公开了一种用于检测食管鳞状细胞癌的微小核糖核酸组合及其应用。该miRNA组合包括miR-22、miR-127-3p、miR-148b和miR-223，还可以进一步包括miR-10a、miR-100和miR-133a中的一种或多种。所述试剂盒包括上述miRNA的探针组合。本发明提供miRNA组合及其探针组合能够用于检测食管鳞状细胞癌，以其作为诊断标志物可以提高检测的准确性，改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，结合病人的其他检测指标和临床症状，将显著提高临床检出率，成为早期诊断食管鳞状细胞癌的有效手段。本发明采用无创性的血清检查，便于临床推广使用。文档编号C12N15/11GK101851682SQ201010211270公开日2010年10月6日申请日期2010年6月25日优先权日2010年6月25日发明者吕志远,张春妮,张辰宇,王成,王琛,陈熹申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院;南京大学