专利名称：人心肌肌钙蛋白t/人心肌肌钙蛋白i融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，利用基因工程技术生产人心肌肌钙蛋白 T-人心肌肌钙蛋白I双功能融合蛋白。
背景技术：
肌钙蛋白是肌肉收缩的调节蛋白，包括三种亚型骨骼股快肌型、骨骼股慢肌型和 心肌型，由三个亚基组成肌钙蛋白C(Troponin C，TnC)、肌钙蛋白T(Troponin Τ, TnT)和 肌钙蛋白I (Troponin I，TnI)。肌钙蛋白C在骨骼肌和心肌中是相同的，但心肌肌钙蛋白 T (cardiac troponin T，cTnT)和心肌肌钙蛋白 I (cardiac troponin I，cTnI)是心肌特有 的，与两种骨骼肌亚型的氨基酸序列不同。cTnT和cTnl以两种形式存在游离形式存在于 胞浆中，结合形式存在于心肌肌纤维上。在心肌细胞膜完整状态下，cTnT和cTnl不能透过 细胞膜进入血循环，故健康人血内不含或含极低量的cTnT和cTnl。心脏损伤早期，心肌细 胞未坏死，但细胞膜破坏，游离形式的cTnT和cTnl进入组织间隙，经淋巴回流入血。急性 心肌梗死患者发生不可逆性心肌缺血，心肌细胞坏死，肌纤维降解，可导致结合池cTnT和 cTnl释放，血中cTnT和cTnl可显著升高，并维持很长时间。cTnT和cTnl具有心肌特异性，是目前最好的特异性标志物，现已取代CK-MB成为 心肌损伤的诊断“金标准”。本研究利用基因工程技术生产人心肌肌钙蛋白T-人心肌肌钙 蛋白I融合蛋白，作为检测CTnI、CTnT的通用参考标准品。
发明内容
本发明要解决的技术问题研制时间分辨荧光免疫分析(time-resloved immunofIuorometricassay, TRFIA)检测 cTnT 和 cTnl 试剂盒的参考标准品。本发明解决上述技术问题的技术方案是利用基因工程技术生产人心肌肌钙蛋白T-人心肌肌钙蛋白I融合蛋白。本发明融合蛋白通过将人心肌肌钙蛋白T和人心肌肌钙蛋白I通过基因重组、转 化构建工程菌表达获得，其中基因重组和转化的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技 术。人心肌肌钙蛋白T和人心肌肌钙蛋白I通过Leu-Asp进行连接。为了便于融合蛋白的 分离纯化，本发明所述的融合蛋白的C端连接有组氨酸标签。本发明还提供一种编码本发明融合蛋白的多核苷酸，该多核苷酸由人心肌肌钙蛋 白TcDNA、人心肌肌钙蛋白I cDNA通过CTCGAC连接而成；该多核苷酸人心肌肌钙蛋白I cDNA的末端还可以连接有CAC CAC CAC CAC CAC CAC0将所述的编码本发明融合蛋白的多核苷酸通过基因重组插入到原核表达载体中， 然后转化大肠杆菌可获得高效表达本发明融合蛋白的工程菌；所述的原核表达载体可以是 pET24a 或 pET24b，大肠杆菌为 Rosetta0本发明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵体形式表达，分离纯化后即可获得本 发明融合蛋白。
本发明融合蛋白同时具有人心肌肌钙蛋白T和人心肌肌钙蛋白I的抗原活性，可 作为时间分辨荧光免疫分析(time-resloved immunofluorometric assay, TRFIA)检测 cTnT和cTnl试剂盒的通用参考标准品。
图1是cTnT-cTnI-6His_pET24重组质粒的结构图。图2是融合蛋白CFP10-L-SA-6His的表达SDS-PAGE电泳图，其中1是分子量标准 (97. 2,66. 4,44. 3、29、20、14. 3KD)，2是工程菌诱导前，3是工程菌诱导后；4是破菌破上清， 5是包涵体，6是纯化产物(66. 2KD)图3是cTnT-cTnl融合蛋白作为时间分辨荧光免疫分析双抗夹心法检测cTnT、 cTnl的参考标准品制作的标准曲线图。图4是时间分辨荧光免疫分析双抗夹心法检测cTnT、cTnl的临床应用。下面将通过实施例进一步说明本发明以及本发明具有的技术效果。
具体实施例方式下述实施例和实验所用的材料及设备如下菌株与质粒大肠杆菌DH5a和Rosetta ；原核表达质粒pET24a (Kanalr, Novagen)； 原核表达质粒pET24a-cTnT (本室构建)、原核表达质粒pET24a_cTnI (Kanar, Novagen)(本 室构建)。主要生化试剂及材料=Trizol，superscript II逆转录酶，寡核苷酸的合 成(Sigma)，PlatinumPfx DNA 聚合酶，T4 DNA 连接酶(Invitrogen)，质粒 DNA 的制 备试剂盒(Qiagen)，cTnT标准品(Biodesign)，cTnl标准品(Biodesign)，琼脂糖和 SDS-PAGE (Biorad)，Ni-NTA(Qiagen)填料，两株抗 cTnT 单克隆抗体(Biodesign)、两株抗 cTnl 单克隆抗体(Biodesign)。DNA片段的连接、转化及转化子筛选，限制性内切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶点 ^^^M^&^^MJCW. (Sambrook J,et al. Molecular Cloning-Α Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, 2nd edition, 1989)或厂家提供的产品 说明书，DNA序列分析在大连宝生物工程公司的DNA测序服务中心完成。例1融合蛋白cTnT-cTnl的制备1、自学校解剖室取人心肌组织一小块，用Trizol试剂提取总RNA，作为模板，用 superscript II逆转录酶进行逆转录，然后通过Platinum pfx DNA聚合酶进行PCR扩增 cTnTcDNA、cTnl cDNA。扩±曾 cTnT cDNA 弓| 物CGCCATATGTCTGACATAGAAGAGGTG 禾口 CCGCTCGAGTTTCCAGCGCCCGGTGAC。反应条件变性94°C，5min,循环(94°C，45s — 60°C，45s — 72°C，60s) 25 轮，最后 72 °C, 5min。扩±曾 cTnl cDNA 弓 | 物GCCGAA TT CATGGCGGATGGGAGC AGC 禾口 CCGCTCGAGCAGCTCTCAAACTTTTTCTTG。反应条件变性94°C，5min,循环(94°C，45s — 58°C，45s — 72°C，50s) 25 轮，最后
472 °C, 5min。2、构建 pET24a_cTnT 重组质粒PCR扩增制备的cTnT cDNA (不含终止码，两端分别含Nde I和Xho I限制性内切 酶位点)，将cTnT cDNA基因片段克隆于pET_24a载体中，获得pET24a-CTnT重组质粒，经 DNA序列分析鉴定，验证其正确无误。3、构建 pET24a_cTnI 重组质粒PCR扩增制备的cTnl cDNA(不含终止码，两端分别含EcoR I和Xho I限制性内切 酶位点)，将cTnT cDNA基因片段克隆于pET_24a载体中，获得pET24a-CTnI重组质粒，经 DNA序列分析鉴定，验证其正确无误。4、构建 pET24a-cTnT_cTnI 重组质粒重新设计cTnl的上游引物，使其带有Sal I限制性内切酶位点(与Xho I为 同尾酶)，序列为ACGCGTCGACATGGCGGATGGGAGCAGCGA，用此引物与上述cTnI下游引物以 PET24a-cTnI重组质粒为模板重新扩增cTnl cDNA。反应条件变性94°C，5min,循环(94°C，45s — 58°C，45s — 72°C，60s) 25 轮，最后 72 °C, 5min。将cTnl PCR产物用Sal I与Xho I进行双酶切，将pET24a_cTnT重组质粒用Xho I进行酶切，纯化后用T4 DNA连接酶进行连接，转化DH5a。根据菌落PCR(用cTnT上游引 物和cTnl下游引物扩增)筛选阳性菌落，经DNA序列分析鉴定，验证其正确无误。5、构建 pET24a-cTnT_cTnI/Rosetta 工程菌PET24a-cTnT-cTnI重组表达质粒转化后Rosetta感受态细胞后，用含卡那霉素的 LB平皿筛选。挑取转化平皿上的单菌落接种于加有卡那霉素(20yg/ml)的LB培养基中。 经37°C摇床培养扩增至吸光度A600为0. 4 0. 5时，加入终浓度为0. lmmol/L的IPTG， 37°C诱导表达4h，离心(8000gX10min)收获菌体，将细胞破碎后用12%的SDS-PAGE检测 分析融合蛋白的表达情况。5、融合蛋白的表达融合蛋白cTnT-cTnl在菌体中主要以包涵体的形式存在，其表达量达20 30%。 结果如图2所示。6、从包涵体中获得融合蛋白cTnT-cTnla.制备包涵体5克菌体悬于IOOml IxPBS中，冰浴中超声(电流270mA)，30 秒X 10次(每次间隔30秒)；接着于4 °C离心10分钟(SOOOg)，将沉淀悬浮于IOOml IxPBS(内含 4mol/L 尿素，0. 5% Triton X-100, 20mmol/L EDTA)中进行漂洗，随后离心 (IOOOgX 10分钟)收集沉淀；漂洗两次后，溶于50mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素(pH 8.0)中，15000gX15分钟，取上清液。b. Ni-NTA柱层析将步骤a得到的上清液上样于Ni-NTA柱(2. 6 X 5cm)，用平衡液 (50mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，0. 5mmol/LNaCl,pH8. 0)进行冲洗至样品A28tl恢复至 基线；然后用洗脱液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，0. 5mmol/LNaCl,pH8. 0，其中咪 唑分别为 30mmol/L，50mmol/L, 1 OOmmo 1/L, 200mmol/L)进行洗脱，洗脱液经 SDS-PAGE 鉴定， 收集融合蛋白质峰(融合蛋白cTnT-cTnl的分子量为66. 2KD)。c.透析复性将Ni-NTA柱层析纯化获得的融合蛋白cTnT-cTnl调至OD28tl = 0. 2，在大于20倍体积的透析液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，4. Omol/L尿素，0. 2mmol/LNaCl，5%甘 油，ρΗ8· 0)中4°C透析复性8小时；然后在50mmol/L磷酸钠缓冲液，2. Omol/L尿素，2. 5% 甘油，pH8. 0)中4°C透析复性8小时；再在50mmol/L磷酸钠缓冲液，1. Omol/L尿素，1. 25% 甘油，pH8. 0)中4°C透析复性8小时；最后在50mmol/L磷酸钠缓冲液中继续透析8小时； 离心除去不溶物，收集上清。将收集的融合蛋白质液调至PH8.0，并过滤除菌分装，储存 于-20 0C ο所得融合蛋白cTnT-cTnl用SDS-PAGE鉴定，结果如图2所示。例2CTnT-CTnI融合蛋白作为通用参考标准品在时间分辨荧光免疫分析检测cTnT 和cTnl中的应用。1、在时间分辨荧光免疫分析检测cTnT中的应用建立时间分辨荧光免疫分析双抗夹心检测cTnT的方法，以cTnT标准品 (Biodesign购买)建立标准曲线。将cTnT-cTnl融合蛋白进行5倍系列递比稀释，用时 间分辨荧光免疫分析对cTnT-cTnl融合蛋白进行定标(确认其检测cTnT的有效浓度)。 定标后作为参考标准品(取代昂贵进口标准品)，用标准品稀释液将cTnT-cTnl融合蛋白 分别稀释为0. 1,0. 5,2. 5、12. 5,62. 5ng/ml，两个复孔取平均值，制作参考标准曲线，Y = 1. 04X+4. 02，R = O. 9993。结果如图 3 所示。2、在时间分辨荧光免疫分析检测cTnl中的应用建立时间分辨荧光免疫分析双抗夹心检测cTnl的方法，以cTnl标准品 (Biodesign购买)建立标准曲线。将cTnT-cTnl融合蛋白进行5倍系列递比稀释，用时间 分辨荧光免疫分析对cTnT-cTnl融合蛋白进行定标(确认其检测cTnl的有效浓度)。定标 后作为参考标准品(取代昂贵进口标准品)，用标准品稀释液将cTnT-cTnl融合蛋白分别稀 释为0. 2、l、5、25、125ng/ml，两个复孔取平均值，Y=L 02X+3. 06，R = O. 9998。制作参考 标准曲线，结果如图4所示。例3时间分辨荧光免疫分析检测cTnT、cTnl的临床应用对照组120名健康体检者，无特殊临床表现，男性68名，女性52名，年龄30 80
岁ο疾病组96例内科住院心血管病患者或既往有过典型或隐匿型心绞痛史的患者， 男性62例，女性34例，年龄45 85岁，其中AMI患者29例，典型心绞痛史患者35例，隐 匿型心绞痛史患者32例。对以上样本，利用我们建立的时间分辨免疫分析法来检测cTnl。统计分析各疾病组和健康对照组检测cTnT、cTnl的结果分析采用t检验。结果 如表1所示，P < 0. 01。
权利要求
一种融合蛋白，该蛋白由人心肌肌钙蛋白T和人心肌肌钙蛋白I连接而成。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的人心肌肌钙蛋白I的末端连接 有纯化标签。
3.一种基因，该基因编码权利要求1或2融合蛋白。
4.一种表达载体，该表达载体含有权利要求3所述的基因。
5.一种工程菌，该工程菌转化了权利要求4所述的表达载体。
6.权利要求1或2所述的融合蛋白在时间分辨荧光免疫分析检测cTnT和cTnl中作为 通用参考标准品的应用。
全文摘要
本发明提供了一种融合蛋白，该蛋白由人心肌肌钙蛋白T和人心肌肌钙蛋白I连接而成。研究证实，该融合蛋白既有人心肌肌钙蛋白T的抗原活性，也有人心肌肌钙蛋白I的抗原活性。时间分辨荧光免疫分析是一种灵敏度非常高、线性范围宽、定量准确的免疫学方法，本发明融合蛋白拟用作时间分辨荧光免疫分析检测cTnT和cTnI的通用参考标准品，建立检测cTnT和cTnI的新方法，从而对心肌损伤进行特异、准确、快速的诊断。
文档编号C12N1/15GK101935354SQ20101022883
公开日2011年1月5日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者许晓玲, 邹立林, 郭芳芳, 高基民 申请人:温州医学院