专利名称：一种用合成培养基生产仔猪副伤寒活疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及一种用合成培养基生产仔猪副伤寒活疫苗的方法，属于生物 学领域，特别是兽用生物制品领域。
背景技术：
仔猪副伤寒(Paratyphus swine)又称猪沙门氏菌病(Swine salmonellosis)，主 要是由猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)引起的一种仔猪高热传染病，目前主 要通过接种疫苗进行预防。我国应用的仔猪副伤寒活疫苗是用猪霍乱沙门氏菌CVCC79500株(原C500株) 弱毒菌株(房晓文，李阳陇，黄昌炳，郑明，冯文达，孙伟.仔猪副伤寒弱毒菌苗的研究.畜 牧兽医学报，1981，12(2) 99-106)制备的，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应，对仔 猪有坚强免疫力，毒力稳定、安全。在猪沙门氏菌病防控中发挥了重要作用。我国兽医生物制品中，制苗用菌液生产采用的是传统的天然培养基，如普通肉汤、 马丁汤、肉肝胃膜消化汤等，制作繁琐。其主要成分肉浸液受动物的种类、年龄、及肉源的新 鲜与消化程度影响大，造成疫苗的质量不稳定。大规模发酵用合成培养基按照细菌营养代 谢特点设计，添加了促进菌体增殖、提高保护性抗原含量的生长因子，具有培养菌数高、质 量稳定、操作简便等优点。合成培养基是细菌冻干活疫苗质量好坏的关键因素，有鉴于此， 本发明的目的在于设计一种适合猪霍乱沙门氏菌CVCC79500株生长、成分相对确定、易于 在线检测、监控和及时调整的合成培养基，制备仔猪副伤寒活疫苗。
发明内容
将猪霍乱沙门氏菌CVCC79500株种子液按培养基总量的 2%接种于以胰酪 蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37°C发酵或通气培养18 21h， 培养过程中根据需要加入适量消泡剂，并根据PH升高情况加入适量灭菌40%葡萄糖以控 制PH值。培养结束后，立即加入经过灭菌处理并预热至37°C的常用的冻干保护剂，充分混 勻分装后，真空冷冻干燥而成。每头份活菌数不少于3X109CFU。本发明的详细描述1.疫苗生产用菌种(1)来源猪霍乱沙门氏菌CVCC79500株菌种，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和 供应(房晓文、李阳陇)。其原始菌种系猪霍乱沙门氏菌CVCC79101株(来自苏联兽药监察 所，编号为133/8。特性该菌种肉肝胃培养物50 X IO4CFU活菌致死小鼠，5000 X IO4CFU活 菌致死海猪，1.5 X IO8CFU活菌静脉注射致死仔猪。血清型6，7 :C:1，5。)经0.05% 醋酸铊的普通肉汤传500代，每间隔50代逐步提高醋酸铊浓度，人工致弱而来。(2)菌种特性毒力小鼠皮下注射IXlO8CFU活菌，90%以上存活；豚鼠皮下注射15X108CFU活 菌，80%以上存活；家兔皮下注射100X IO8CFU活菌，100%存活；仔猪静脉注射30 X IO8CFU 活菌，100%存活。菌株毒力稳定，在普通琼脂上传20代，仔猪3代，毒力不返强。
免疫原性25X IO8CFU活菌免疫家兔，攻击2 4MLD强毒，保护80 %以上； 25X IO8CFU活菌免疫仔猪，静脉注射致死剂量强毒，保护60%以上。2.培养基采用本发明设计的合成培养基(1)配方(W/V)如下胰酪蛋白胨 2%、酵母浸出粉3% 4 %、氯化钠0.05%、磷酸二氢钾 0. 0077%、磷酸氢二钠0. 0867%和葡萄糖0. 05%。(2)合成培养基配制方法按上述配方依次称取培养基成分加入到注射用水中，充分溶解后用2mol/L的氢 氧化钠溶液调节PH值为7. 2 7. 4，116°C灭菌30min。临用时，无菌操作加入终浓度1 %的 50%葡萄糖溶液，混勻。50%葡萄糖溶液(W/V)称取50g葡萄糖，加注射用水溶解，定容至100ml，116°C灭 菌30min，2 8°C保存。2mol/L的氢氧化钠溶液称取8g氢氧化钠，加注射用水溶解，定容至100ml，116°C 灭菌30min，2 8°C保存。(3)合成培养基检验1)性状溶液澄清透明、呈棕色。2)无菌检验按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药 典二〇〇五版三部.中国农业出版社，2006，以下称《中国兽药典》)规定的方法进行，应无 菌生长。3)pH 值应为 7. 2 士 0. 2。4)生长试验(1)种子液制备将猪霍乱沙门氏菌CVCC79500株(中国兽医药品监察所提供)冻干菌种用普通肉 汤(中国兽医药品监察所提供)稀释后，接种普通琼脂平板，37°C培养18 20h，选取中等 大小的典型菌落5 10个，混合接种于普通琼脂斜面3 5支，37°C培养24h，经纯粹检查 合格后作为一级种子。在2 8°C保存，应不超过2个月。取一级种子接种普通肉汤，37°C 培养24h，纯粹检查合格后，作为种子液(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生 物制品规程二〇〇〇年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》)。(2)菌液培养及判定下列方法任选其一种①将种子液按2%接种IOml液体培养基2管，1管37°C静置培养24h，另1管37°C、 200r/min振荡培养12h，同时各设1管不接种阴性对照。分别取样按现行《中国兽药典》规 定的方法进行活菌计数。静置培养菌数应不低于25X 108CFU/ml，振荡培养菌数应不低于 50X 108CFU/ml，且阴性对照应无菌生长。②将种子液按2%接种200ml液体培养基的500ml三角瓶2个，1个37°C静置培 养24h，另1个37°C、200r/min振荡培养12h，同时各设1个不接种阴性对照。分别取样按 现行《中国兽药典》附录进行活菌计数。静置培养菌数应不低于30X 108CFU/ml，振荡培养 菌数应不低于70 X 108CFU/ml，且阴性对照应无菌生长。(4)贮藏与有效期配制后的液体合成培养基置于室温避光保存，有效期为21日。3疫苗制造
将种子液按培养基总量的 2%接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原 材料的液体合成培养基中，37°C发酵或通气培养18 21h，培养过程中根据需要加入适量 消泡剂，并根据PH升高情况加入适量灭菌40%葡萄糖以控制pH值。培养结束后立即加入 经过灭菌处理并预热至37°C的常用的冻干保护剂，充分混勻分装后，真空冷冻干燥而成。每 头份活菌数不少于3X109CFU。本发明的积极效果仔猪副伤寒活疫苗通常采用的是普通肉汤培养基，该培养基主要成分牛肉浸液的 质量受牛肉来源、新鲜程度、消化温度和时间等诸多因素影响；制作繁琐、制备过程中各种 因素稳定性差，其制成的培养基批间质量差异较大，进而影响仔猪副伤寒活疫苗的质量，特 别是疫苗的均一性。而本发明所提供的合成培养基，克服了以上的缺陷，是进行细菌高细胞 密度培养的发展趋势，具有操作简便、质量稳定的优点，为高品质的仔猪副伤寒活疫苗生产 提供了有力的保障。实施例11制苗用菌液制备将种子液按培养基总量的 2%接种于液体培养基中，37°C发酵或通气培养 18 21h，培养过程中根据需要加入适量消泡剂，并根据pH升高情况加入适量灭菌40%葡 萄糖以控制PH值。立即加入经过灭菌处理并预热至37°C的常用的冻干保护剂(如1.5% 明胶和5%蔗糖溶液、耐热冻干保护剂等)悬浮，充分混勻后按规定头份分装。分装过程中 应注意保温振摇均勻，分装后迅速进行冷冻真空干燥，按《中国兽药典》规定的方法进行。每 头份活菌数不少于3X109CFU。2半成品检验纯粹检验取菌液用普通琼脂平板，按《中国兽药典》规定的方法进行，应纯粹。活菌计数取样用普通琼脂平板培养计活菌数，按《中国兽药典》规定的方法进行， 作为计算冻干活菌率的基数及配苗时参考。冻干后检验纯粹检验按《中国兽药典》规定的方法进行，应纯粹。头份、活菌率的计算用普通琼脂平板培养计活菌数，按《中国兽药典》规定的方法 进行。以3瓶中最低菌数计算核定该批疫苗每瓶的使用头份，同时按附注方法计算冻干后 的活菌率，以确定使用方法。活菌率在50%以上的疫苗，可用于注射或口服；低于50%的疫 苗，仅限于口服。3成品检验性状灰白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。纯粹检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应纯粹。活菌计数按瓶签注明头份，用普通琼脂平板做活菌计数(按《中国兽药典》规定的 方法进行)。每头份含活菌数应不少于3X109CFU。安全检验按瓶签注明头份，将疫苗用普通肉汤或蛋白胨水稀释，皮下注射体重 1.5 2. Okg兔2只，各1.0ml(含2头份)，观察21日，应存活。剩余水分测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定，应不超过4. 0%。真空度测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定。
实施例2仔猪副伤寒活疫苗合成培养基的研究从 3%蛋白胨、 4%酵母粉、0.5% 3%葡萄糖组合成的配方中，通 过振荡培养试验筛选出蛋白胨+4%酵母粉+1%葡萄糖的合成培养基配方。该配方 应用结果，37°C静置培养24h，A管(合成培养基装量10ml，下同)培养菌数为27X 108 31 X 108CFU/ml，三角瓶(合成培养基装量200ml，下同)培养菌数为33 X IO8 41 X IO8CFU/ ml ；37°C、200r/min振荡培养12h，A管培养菌数为58X IO8 66X 108CFU/ml ；三角瓶为 78 X IO8 88X 108CFU/ml。将合成培养基培养的猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)接种小 鼠均10/10存活；免疫后攻毒家兔达4/5 5/5保护，与普通肉汤培养的同种苗结果基本一 致。符合《规程》中“仔猪副伤寒活疫苗制造及检验规程”的要求。1 材料1. 1培养基原材料胰酪蛋白胨(批号VM732731-644)，购自MERCK公司；酵母浸粉(批号911948)购 自OXOID公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、半胱氨酸、葡萄糖、蔗糖、硫代硫酸钠、谷 氨酸钠、VBp VB2、硫酸镁、硫酸铜等均为分析纯化学试剂，购自北京化学试剂公司。1. 2 普通肉汤(批号为 0130、0227、0307、0115、0119、0205)、生理盐水(批号 0619,4. 5ml/支，IOOml/瓶)，A型试管使用规格25ml、三角瓶使用规格500ml，中国兽医药 品监察所培养基组提供。1. 3 菌种生产用菌种为猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)(2006. 8. 29冻干，0. 3ml/支)；检 验用菌种为猪霍乱沙门氏菌(CVCC79102株)(2006. 8. 29冻干，0. 3ml/支)，由中国兽医药 品监察所鉴定、保管和供应。1. 4 动物小鼠ICR系，30 35日龄、体重18 22g，清洁级；大耳白兔体重1. 5 2. 0kg， 普通级；由中国兽医药品监察所实验动物组采购并提供。2方法与结果2. 1基础配方筛选按如下处方配制缓冲液适量称取氯化钠5g、磷酸二氢钾0. 77g、磷酸氢二钠 8. 67g，溶于IOOOml注射用水中，用2M NaOH溶液调pH值为7. 2 7. 4。将蛋白胨与酵母粉，按不同比例设计成12个配方，标记为1 12(具体比例及编 号见表1)，用上述缓冲液分别定容至100ml，116°C灭菌30min，然后分装于灭菌A型试管 (IOml/管)，同时设立普通肉汤对照。按2%加入种子液，37°C、200r/min振荡培养12h，取 样进行活菌计数。结果见表1。表1培养基基础配方及活菌计数结果 注种子液计数结果为8. 5 X 108CFU/ml。从表1结果看出，配方2及10活菌计数分别为33X 108CFU/ml、32X 108CFU/ml，在 各组中最高，略低于普通肉汤对照35X 108CFU/ml。2. 2. 2培养基生长因子的筛选选取培养菌数接近普通肉汤的2种合成培养基配方，按2. 2. 1方法制成液体培养 基。在A型试管中分别加入半胱氨酸、葡萄糖、蔗糖、硫代硫酸钠、谷氨酸钠、VBp VB2、硫酸 镁、硫酸铜等生长因子。其中葡萄糖、蔗糖、硫代硫酸钠、谷氨酸钠、硫酸镁、硫酸铜用注射 用水配成10 %贮液，0. 22 μ m过滤除菌，分别以终浓度0. 5 %、1 %加入培养基A管中，半胱 氨酸、VB1、VB2用注射用水配成1 %贮液，0. 22 μ m过滤除菌，分别以终浓度0. 05%、0· 1 %加 入培养基A管中；同时设立普通肉汤对照。按2%加入种子液，以37°C、200r/min振荡培养 12h，取样进行活菌计数。表2培养基生长因子筛选试验活菌计数结果(108CFU/ml) 注接入活菌计数为9. 3X108CFU/ml的种子液，普通肉汤对照批号为070227。从表2结果看出，葡萄糖对培养基促生长作用明显，而其它生长因子促生长作用 不明显；另外配方10+葡萄糖培养菌数高于配方2。2. 2. 3生长因子不同用量比较试验将筛选出的生长因子(葡萄糖)，按终浓度3 %、 2. 5%、2%、1. 5%、1%、0. 5%加入培养基中，分别按2%加入种子液，37°C、200r/min振荡 培养8h和12h，取样进行活菌计数。结果见表3。表3生长因子(葡萄糖)不同用量比较试验 注接入活菌计数为8. 7X108CFU/ml的种子液。从表3结果看出，37°C、200r/min振荡培养8h和12h时，加入葡萄糖的合成培 养基菌数最高，分别为62X 108CFU/ml和66X 108CFU/ml，当葡萄糖浓度继续增加，菌数不再 增加，PH值继续下降。2. 3合成培养基与普通肉汤的比较试验按配方10 (添加最适量的葡萄糖)，制备3批合成培养基(批号分别为200801、 200802及200803)，连同3批普通肉汤培养基(批号分别为080115,080122及080205)，各 分装于A型试管(IOml/管)和500ml三角瓶(200ml/瓶)中。按2%加入种子液，37°C静 置培养24h和37°C、200r/min振荡培养12h，分别取样进行活菌计数。结果见表4。表4培养基比较试验结果(108CFU/ml) 注01批与0115批接入活菌计数为9. 2X108CFU/ml种子液、02批与0122批接入 活菌计数为llX108CFU/ml种子液、03批与0205批接入活菌计数为11 X 108CFU/ml种子液。从表4结果看出，在相同培养条件下，3批合成培养基的培养菌数均较3批普通肉 汤的培养菌数高。2. 4培养菌体的安全及效力试验将三角瓶中每批合成培养基培养的菌液，3500r/min离心20min，弃上清，菌体沉 淀用适量生理盐水悬浮后，进行活菌计数。分别皮下注射体重18 22g的小鼠10只， 0. 2ml/只(含1 X IO8CFU活菌)，观察21日，记录存活情况；肌肉注射体重1. 5 2. Okg的 家兔5只，1. Oml/只(含25 X IO8CFU活菌)，30日后，连同条件相同的不免疫对照家兔5只， 各皮下注射经肉肝胃(膜)消化汤培养2代的猪霍乱沙门氏菌(CVCC79102株)1.0ml (含3MLD的活菌)，观察30日，记录存活情况。结果见表5。表5培养菌体安全及免疫原性试验结果
安全试验效力试验
鼠免疫兔
项目--
实际接种菌数实际免疫菌数不免疫对照
存活保护
(108CFU/0. 2ml)(IO8CFUAnl)
011.1110/1024.35/5
皮下注射
合成培养基 021.0710/1025.14/5
CVCC791Q2 株菌
030.9810/1024.75/5
-液 1.0ml (含
01150.9510/1025.24/5
60CFU 活菌)，
普通肉汤 01221.0810/1025.35/5
5/5死亡
02050.9710/1024.83/5从表5结果看出，合成培养基培养的菌体对小鼠安全，均10/10健活；免疫效果与 普通肉汤结果基本一致，免疫兔达4/5 5/5保护，对照5/5死亡。4 结论4. 1用培养基配方10加葡萄糖组成的合成培养基培养菌数均高于普通肉汤， 其对小鼠的安全检验及免疫家兔的攻毒结果与普通肉汤一致，符合《规程》中“仔猪副伤寒 活疫苗制造及检验规程”的要求。实施例3合成培养基保存期试验将本发明人制备的3批生产仔猪副伤寒活疫苗用合成培养基按说明书用注射用 水配制成5000ml溶液，经116C灭菌30min后，置室温(25°C )避光保存0日、7日、14日及 21日。然后分装于灭菌的500ml三角瓶中(培养基装量200ml)，分别按2%接入猪霍乱沙 门氏菌(CVCC79500株，由中国兽医药品监察所提供)种子液(按《规程》)提供的方法制 备)，37°C、200r/min振荡培养，于8h、10h、12h分别取样并进行活菌计数。结果见表。表1培养基不同保存期活菌计数结果(108CFU/ml)培养基批号保存时间(日)振荡培养时间(h)8101208183.78577876.3840101148384772179837808281. 780. 677876.386. 30115148384822179838307682. 180. 67787986. 302101483847921818381注:0101批接种菌液为 11. 3X108CFU/ml ；0115 批接种菌液为 10. 1 X 108CFU/ml ； 0210批接种菌液为9. 5X 108CFU/ml。从表1结果看出，合成培养基室温(25°C )保存21日的培养菌数与保存当日基本 一致，配制好的合成培养基可在室温(25°C )保存21日。
权利要求
一种用合成培养基生产仔猪副伤寒活疫苗的方法，其特征是将猪霍乱沙门氏菌CVCC79500株种子液按培养基总量的1％～2％接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37℃发酵或通气培养18～21h，培养过程中根据需要加入适量消泡剂，并根据pH升高情况加入适量灭菌40％葡萄糖以控制pH值，培养结束后，立即加入经过灭菌处理并预热至37℃的常用的冻干保护剂，充分混匀分装后，经真空冷冻干燥而成。每头份活菌数不少于3×109CFU。
2.按照权利要求1所述的一种用合成培养基生产仔猪副伤寒活疫苗的方法，其特征是 其中所使用合成培养基的配方(W/V)是胰酪蛋白胨 2%、酵母浸出粉3% 4%、氯 化钠0. 05%、磷酸二氢钾0. 0077%、磷酸氢二钠0. 0867%和葡萄糖0. 5% 2%。
3.按照权利要求1、2所述的一种用合成培养基生产仔猪副伤寒活疫苗的方法，其特征 是其中所使用合成培养基的最佳配方(W/ν)是胰酪蛋白胨1%、酵母浸出粉4%、氯化钠 0. 05%、磷酸二氢钾0. 0077%、磷酸氢二钠0. 0867%和葡萄糖1%。
全文摘要
本发明涉及一种用合成培养基生产仔猪副伤寒活疫苗的方法。仔猪副伤寒活疫苗通常采用的是普通肉汤培养基，该培养基主要成分牛肉浸液的质量受牛肉来源、新鲜程度、消化温度和时间等诸多因素影响；制作繁琐、制备过程中各种因素稳定性差，其制成的培养基批间质量差异较大，进而影响仔猪副伤寒活疫苗的质量，特别是疫苗的均一性。而本发明所提供的合成培养基，克服了以上的缺陷，是进行细菌高细胞密度培养的发展趋势，具有操作简便、质量稳定的优点，为高品质的仔猪副伤寒活疫苗生产提供了有力的保障。
文档编号C12R1/42GK101926987SQ201010254578
公开日2010年12月29日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者刘延亭, 孙晔, 朱良全, 王栋 申请人:北京海淀中海动物保健科技公司