专利名称：中国棉铃虫病毒组织蛋白酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物领域，特别是一种具有广泛应用前景的病毒新基因即中国棉铃虫病毒组织蛋白酶基因。
杆状病毒广泛用于农林害虫的生物防治。同时杆状病毒-昆虫(细胞)系统还是十分优良的真核表达系统，已用于外源基因，诊断试剂和疫苗等的研究和生产。和其它杆状病毒一样，中国棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nueleocapsid nucleopolyhedrovirus，以下简称野生型病毒或HaSNPV)作为杀虫剂由于存在杀虫速度慢的缺点，致使其大面积控制棉铃虫危害的作用受到限制；而不断提高病毒表达系统的表达量一直是当今生物工程领域的研究热点。
本发明的目的是利用分子生物学技术对病毒基因的结构与功能进行研究，揭示病毒的复制和侵染规律，以提供一种杆状病毒新基因即中国棉铃虫病毒组织蛋白酶基因，该基因可用于杆状病毒表达系统及重组病毒杀虫剂的构建、开发和应用。
本发明的目的是按下述方案实现的所提供的中国棉铃虫病毒组织蛋白酶基因是通过克隆和序列测定方法获得的，其编码区全长为1089核苷酸，编码一个大小为366个氨基酸的蛋白质产物。它具有典型催化活性位点Cys178和His311，翻译后加工的切割位点Pro155及两个N-linked糖基化位点。
本发明提供的中国棉铃虫病毒组织蛋白酶基因及其获得方法，可以为揭示病毒的复制和侵染规律，以及为表达载体和重组病毒杀虫剂的开发和应用奠定了基础。
下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
图1是棉铃虫病毒HaSNPV基因组物理图谱及v-cath在基因组上的定位的示意图。
图2是棉铃虫v-cath基因的全序列及编码的氨基酸序列的示意图。一．
1．图1说明线性化的HaSNPV基因组的BamHⅠ物理图谱及组织蛋白酶基因在基因组上的定位(1)HaSNPV基因组的BamHⅠ物理图谱，表明了BamHⅠ的酶切位点，酶切所产生的片段依据其大小分别以英文大写字母表示。图中同时表明了多角体蛋白病毒(ph)及p10基因 的位置及转录方向。(2) 为组织蛋白酶基因(v-cath)在HaSNPV基因组中的位置，箭头的方向表明该基因的转录方向。2．图2说明(1)HaSNPV组织蛋白酶基因(v-cath)完整的核苷酸序列，起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)以黑体字表明。
(2)翻译的氨基酸序列以单一字母表示，位于核苷酸序列的下方。
二．实施例我们在对HaSNPV基因文库的随机测序中发现EcoRⅠ-L片段的一端含有v-cath基因的部分序列。进而通过引物延伸法对在EcoRⅠ-L片段上的该基因进行了双向测序。位于EcoRⅠ-L片段外的部分序列，我们根据该区域的酶切图谱和已知的邻近序列，设计了一对引物进行PCR(即聚合酶链式反应)扩增克隆。引物序列分别为5’-GAGAAGCTTCGAAAACGGCTATTTGCGAG-3’；5’-GCGGGTACCGTCCATTGTCGTCTTTGACTCTCC-3’。PCR产物用商业化产品Glassmilk Kit纯化，酶切处理后与通用载体pTZ19R相连，电转化至大肠DH5α。所获阳性克隆子经酶切鉴定后，用通用引物进行序列测定。最终获得本发明提供的中国棉铃虫病毒组织蛋白酶基因的完整序列。
如附图2所示，该基因编码区全长为1089核苷酸，编码一个大小为366个氨基酸的蛋白质产物。HaSNPV组织蛋白酶和已知的其它组织蛋白酶具有相似的一级结构，具有典型催化活性位点Cys和His，翻译后加工的切割位点Pro及两个N-linked糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)。
本发明可由以下步骤获得HaSNPV基因组DNA以EcoRⅠ酶切，将酶切片段随机克隆到通用载体pTZ19R获得HaSNPV基因组随机文库。
对所得文库进行末端测序，在EcoRⅠ-L片段上发现组织蛋白酶基因，并获得其编码区的1074个核苷酸。但C-末端并不完全。
根据HaSNPV的物理图谱(Chen,X.等，Archives of Virology,2000)和已知的序列合成引物，通过PCR方法扩增含C-末端的片段并克隆到通用载体pTZ19R，然后进一步测序获得完整的HaSNPV组织蛋白酶基因。
本发明还可由以下更简单步骤获得先根据图2所示的核苷酸序列的两个末端设计PCR引物，用PCR的方法从HaSNPV基因组中一次性扩增出完整的组织蛋白酶基因，然后克隆到通用的克隆载体上，并通过序列测定验证所获得的基因。
权利要求
1．一种中国棉铃虫病毒组织蛋白酶基因，其特征是所述的基因，其核苷酸序列及预计的氨基酸序列如下TACTTAGACCTTTGGGTTGATTCGTGCCTGTCATGCTCATAATTAAGGTACTTTAGTTTTATGCGCAAGTACCATTCAAATATCATGCATAAAATTATTACATTTGTTTCCTTGTTGTGGM R K Y H S N I M H K I I T F V S L L WACGTTTGTCGTGTGTGATGAAATATCTTTGCATACGTCGTCGTCGCCACCGCCATTGTCTT F V V C D E I S L H T S S S P P P L STCGCCAGTGCTGTATTATAATTTAGATCAATCTGAAATTTATTTCAAACATTTCCTACAGS P V L Y Y N L D Q S E I Y F K H F L QCAATACAACAAAAGCTACGACGATCCCAAAGAATACCAATACCGTTACAATGTGTTCAAAQ Y Y D D P K E Y Q Y R Y N V F KGACAATTTGAACAAAATCAATTCTCAAAATCGAGAAAATCTGTTGAATAACAAGAACAATD N L N K I N S Q N R E N L L N N K N NAACGACTCGCTCTCTACATCGGCTCAATTTGGTGTGAACAAATTTAGTGACAAGACCCCA L S T S A Q F G V N K F S D K T PGACGAAGTGTTACATTCGAACACTGGTTTTTTTTTAAATCTTAGCCAACACTACACATTAD E V L H S N T G F F L Q H Y T LTGCGAAAATAGAATAGTTAAAGGCGCGCCCAACATACGTTTGCCCGATTATTATGATTGGC E N R I V K G A P N I R L P D Y Y D WCGCGACACCAATAAAGTGACTCCCATAAAAGATCAAGGAGTTTGCGGATCGTGTTGGGCTR D T N K V T P I K D Q G V C G S C W ATTCGTAGCAATAGGCAATATTGAAAGTCAATATGCCATACGGCACAACAAATTAATAGATF V A I G N I E S Q Y A I R H N K L I DCTGTCCGAACAGCAACTGTTAGATTGCGATGAAGTTGATTTAGGTTGTAATGGTGGTTTGL S E Q Q L L D C D E V D L G C N G G LATGCATTTAGCGTTTCAAGAACTATTGCTGATGGGCGGTGTTGAAACGGAAGCAGATTATM H L A F Q E L L L M G G V E T E A D YCCCTATCAGGGCAGTGAACAAATGTGCACTTTAGATAATCGCAAAATAGCTGTCAAATTGP Y Q G S E Q M C T L D N R K I A V K LAACTCTTGCTTTAAATACGACATACGTGACGAGAATAAATTGAAAGAATTGGTGTACACTN S C F K Y D I R D E N K L K E L V Y TACTGGACCTGTGGCGATAGCAGTCGACGCCATGGACATTATTAATTATCGCAGAGGAATAT G P V A I A V D A M D I I N Y R R G ITTGAATCAATGTCACATTTATGATTTGAATCATGCCGTTTTGCTTATCGGTTGGGGTATCL N Q C H I Y D L N H A V L L I G W G IGAAAACAATGTACCCTATTGGATTATAAAAAATTCATGGGGAGAAGATTGGGGCGAAAACE N N V P Y W I I K N S W G E D W G E NGGCTATTTGCGAGTGCGGCGCAACGTCAACGCCTGCGGATTACTCAACGAATTCGGCGCGG Y L R V R R N V N A C G L L N E F G ATCGTCGGTAATTCAATAATAAAAATACACCATACAGTTTGATACTATGTAATTTTATTAAS S V I QATAAAATACATTTGGAATACACATCATCATTTGTTATTTGTTCATATTAAAAACATGTCT上述编码区全长1089核苷酸，编码一个大小为366个氨基酸的蛋白质产物，该基因中的Cys178和His311是典型催化活性位点，还具有翻译后加工的切割位点Pro155及两个N-linked糖基化位点。
2．根据权利要求1所述的的中国棉铃虫病毒组织蛋白酶基因，其特征是从杆状病毒科中分离得到的与该基因序列同源性高于50％的同源基因。
3．一种获得权利要求1或2所述的中国棉铃虫病毒组织蛋白酶基因的方法，包括以下步骤先根据核苷酸序列的两个末端设计PCR引物，用PCR的方法从HaSNPV基因组中一次性扩增出完整的组织蛋白酶基因，然后克隆到通用的克隆载体上，并通过序列测定验证所获得的基因。
4．一种获得权利要求1或2所述的中国棉铃虫病毒组织蛋白酶基因的方法，包括以下步骤(1)HaSNPV基因组DNA以EcoRⅠ酶切，将酶切片段随机克隆到通用载体pTZ19R获得HaSNPV基因组随机文库；(2)对所得文库进行末端测序在EcoRⅠ-L片段上发现组织蛋白酶基因，并获得其编码区的1074个核苷酸；(3)根据HaSNPV的物理图谱和已知的序列合成引物，通过PCR方法扩增含C-末端的片段并克隆到载体pTZ19R，然后进一步测序获得完整的HaSNPV组织蛋白酶基因。
全文摘要
本发明是一种通过克隆和序列测定获得的中国棉铃虫病毒组织蛋白酶基因,其编码区全长为1089核苷酸,编码一个大小为366个氨基酸的蛋白质产物,该基因具有典型催化活性位点Cys
文档编号C12N15/63GK1295128SQ0013128
公开日2001年5月16日 申请日期2000年12月19日 优先权日2000年12月19日
发明者胡志红, 陈新文, 孙修炼, 刘岚, 冯枞棣 申请人:中国科学院武汉病毒研究所