专利名称：蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌的应用，特别涉及蛭弧菌蛭质体菌液在 斑节对虾等海产品养殖中的应用。
背景技术：
斑节对虾(Penaeus monodon)俗称鬼虾、草虾、花虾、竹节虾、斑节虾、牛形对虾，联 合国粮农组织通称大虎虾。是对虾中个体最大的一种，成熟个体一般体长22. 5cm 32cm， 体重137g 211g，为当今世界上虾类养殖普遍的品种之一。目前不排污的养殖方式，造成对虾的排泄物、残存饲料、浮游生物的残体等有机废 物均在池塘中积累，到了养殖的中后期，不可避免地出现底质污染，水体质量下降，条件致 病菌和致病菌增多，生态环境恶化，从而引发虾病的发生。因此，在养殖生产中寻求一种新 的方法，既可减少换水，又可提高其存活率和生长率，是广大养殖者之所盼。中草药对斑节对虾生长性能具有无药物残留、经济效益高的优点，但有见效慢的 缺点。抗生素对抑制病原微生物的繁殖，减少其代谢毒素对虾的毒害作用等方面起到了积 极的作用，但是长期使用抗生素，特别是滥用抗生素，其种种弊端也逐渐显露出来。如破坏 虾塘中自然生态平衡，对虾的机体免疫力产生不良影响，产生耐药性和药物残留等副作用， 给养殖业和作为消费者的人类的健康都带来了潜在的危害。因此，开发一种简便易行、安 全、优质、营养的无公害健康的斑节对虾养殖新技术已经成为当今社会的共识。蛭弧菌是寄生于其他细菌，并能导致宿主细菌裂解的一类细菌；比一般细菌小，能 通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用；革兰氏染色呈阴性，可以裂解包括副溶血弧菌、溶藻 弧菌等引发虾病害的潜在致病菌。蛭弧菌的生活史可分为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体状态和在宿 主细菌内生长发育的蛭质体状态。蛭弧菌游泳体侵入宿主时，在宿主细胞壁上产生一个孔 隙，当蛭弧菌侵入到宿主的周质空间后孔隙重新封闭。游泳体失去鞭毛，和宿主细胞一起被 称为"蛭质体"。与游泳体相比，蛭质体不仅具有制备、保存更为方便，环境耐受力强，作用 时间虽略慢但更久的特点，同时还具有潜在的灭活疫苗功能。当蛭弧菌游泳体入侵宿主细 胞后，宿主细胞的呼吸作用(respiration)很快被停止。蛭弧菌也进入蛭质体状态，开始 分泌多种酶，消解宿主细胞的大分子为小分子物质，进而整合为自身的营养物质，使自身生 长，变长。最终，长条状的蛭质体分成很多短的节段，长出鞭毛，重新成为游泳体。之后，它 们分泌必需的酶类，破壁而出，再次成为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体。在此 蛭质体发育期间，蛭弧菌并不改变宿主细胞的表面结构，使原宿主仍具有免疫原性，可刺激 生物体，产生免疫应答反应。这一功能使得应用蛭弧菌蛭质体于斑节对虾养殖中，可提高对 虾抗病能力，有效预防对虾弧菌病。这些特性使得蛭弧菌蛭质体适合作为一种微生物制剂，以应用于对虾的养殖过程 中。笔者通过实验，证明了蛭弧菌蛭质体在成虾养殖过程中能够明显地提高虾的存活率、免 疫力以及促进虾生长。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的弊端，提供蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖 中的应用方法。其特征按照养殖生态学原理，海洋生物的生长环境要求，生物之间的相互关 系及无公害养殖标准，人工创造养殖环境，减少投入成本，提高斑节对虾免疫力，促进斑节 对虾快速生长，提高经济效益。本发明的目的通过下述方案实现蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用。所述蛭弧菌蛭弧菌为(Bdellovibrio sp.)BDFM05，于2009年8月7日保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 209172。所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用是将饲料在蛭弧菌蛭质体菌液 中浸泡15-45min。所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用是在水体中添加蛭弧菌蛭质体 菌液，使水体中蛭弧菌蛭质体浓度为IO1 l(fpfu/mL。所述蛭弧菌蛭质体菌液的制备方法为接种宿主于营养肉汤液体培养基中，在35°C和200rpm摇床培养12h，培养液经 4 "C，5000 8000rpm离心10 20min后，沉淀加入至DNB液体培养基中，接入蛭弧菌 BDFM05，在温度25 ;35°C下，以150 300rpm摇床培养36 48h，得到含蛭弧菌蛭质体和 蛭弧菌游泳体的培养液，培养液在4°C温度下以6000 8000rpm离心15 20min后，去除 含蛭弧菌游泳体的上清，得到的沉淀即为蛭弧菌蛭质体；将蛭弧菌蛭质体用DNB液体培养 基、水、生理盐水或0. 2mol/ L pH值为7. 2 7. 6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为IO11 1012pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果1、蛭弧菌蛭质体对致病或潜在致病菌有较强的裂解力，而且能改善养殖生物肠道 环境，促进生长。因此，与现有斑节对虾养殖方法相比，本发明具有使虾抗病能力强，存活率 提高，生长快等特点。2、本发明采用蛭弧菌蛭质体预防和调节、环境调控相结合的方案，达到了提高斑 节对虾的免疫力，促进斑节对虾摄食和快速生长，最长可达到30天不换水，降低生产成本， 提高经济效益的效果。3、本发明所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾的应用中安全性好，现有的研究表明 蛭弧菌对虾类无毒性作用，对人类无致病性。4、本发明所述蛭弧菌蛭质体潜在灭活疫苗功能可刺激对虾产生免疫应答反应，可 提高对虾抗病能力，有效预防对虾弧菌病。因此，此方法也可以推广到其他的虾或水产动物的养殖，增加经济效益，是新时期 渔业增效农民增收的可靠技术支撑。
具体实施例方式下面结合实施例及表格对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
实施例1蛭弧菌蛭质体菌液的制备所述的蛭质体通过以下方法得到在含有副溶血弧菌(接种浓度为IO7CfuAiL的 菌 ImL) (Vibrio parahaemolyticus，购于美国典型物种保藏中心 American Type Culture Collection, ATCC 17802)的 IL DNB(dilute nutrient broth)液体培养基(营养肉汤 0.88，酪蛋白酸水解物0.58，酵母精提物0. lg，溶于IOOOmL蒸馏水中，pH值为7.6)中接入 ImL浓度为l(fpfu/mL蛭弧菌，于、250rpm培养48h,培养液经4°C 6000rpm离心15min 后，去除上清，沉淀用IOOmL DNB悬浮，即得蛭质体；蛭弧菌BDFM05蛭质体菌体的浓度达到 109pfu/mLo实施例2蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾普通养殖中的应用实验本发明的具体实施地点为华南地区某养殖场，实施时间为3个月。(1)养殖池塘条件，养殖池底面积为10亩，池深2m，池底为泥沙质，池底平整，养殖 池配备水泵、增氧机，并配备泵站间门和较完备的进排水系统；(2)放养前的准备，试验地海域的水源水质符合中华人民共和国国家标准渔业水 质标准(GB11607-89)要求，海水经过砂滤、沉淀处理后进入养殖池，符合农业部《无公害食 品海水养殖用水水质》(NY5052-2001)要求。放苗前10天，用80目的袖状网过滤后进水， 同时施氮、磷、钾复合肥培养饵料生物，使池水透明度达到40cm，养殖池水盐度10%。；(3)虾苗选择与放养，虾苗选择个体大小整齐，体长1. 1-1. 3cm的黑壳虾苗，群体 发育整齐，肌肉饱满透明，附肢中色素正常，胃肠充满食物，虾苗活动活泼，对水流刺激反应 灵敏，无外部寄生物及附着污物，放苗时水温20°C，3月20日放苗。养成池水色为黄绿色、 透明度30cm，pH在8. 5，投放密度为5万只/亩。虾苗运至养殖池边，用充氧气头向苗袋内 充氧半小时，同时逐步加入塘内池水，使逐步缩小温差和醒苗；(4)投饲管理，配合饲料1号(购买于广东恒兴集团有限公司，下同)为常规的 对虾养殖饲料，符合中华人民共和国农业行业标准《无公害食品渔用配合饲料安全限量》 (NY5072-2002)的规定。每次投饵前，将配合饲料1号用蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min，菌 液中的蛭弧菌蛭质体的浓度达到ΙΟ1、^)3、105、107pfu/mL,养殖前期和中期，虾平均体长6cm 以下时，日投2次，日投放量控制在虾重的15%;养殖后期，平均体长达到6cm时，日投5次， 日投放量控制在虾重的8% ；(5)养殖期的水环境管理，养殖期间正常曝气，使水中溶解氧达到5mg/L。采取不 同换水周期，5、10、15、20、25、30天换水一次，每次换水控制在25cm深的水量，透明度保持 在30cm，每次换水后加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中的菌体浓度达到101、ΙΟ3、105、107pfu/ mL,加菌方法为用相应的池水稀释菌液后，均勻泼洒全池，使菌液混合均勻。实验分组采用随机区组试验设计，平均分为A-D4个试验组，B、C、D每个试验组有6个小组， 分别为 B1、C1、D1 ；B2、C2、D2 ；B3、C3、D3 ；B4、C4、D4 ；B5、C5、D5 ；B6、C6、D6 ；B1-D6 每小组再 分为4组，即Bl-l-Bl-4. . . D6-1-D6-4，每组2个重复。对5组试验对虾初始体重进行方差 整齐性检验，组间差异不显著(P > 0. 05)。五组试验组的处理如下A组工厂生产的养殖方式，池塘水透明度低于20cm时进行换水，每次换水换掉 50cm深的水(量)，维持池水透明度在35cm，投放配合饲料1号B组在水体中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度分别达到101、103、105、l(fpfu/mL，投放配合饲料1号C组投喂经浓度为IO1、ΙΟ3、105、107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡后的配合饲 料1号D组在水体中加入蛭弧菌蛭质体菌液，使菌体浓度分别达到101、ΙΟ3、105、107pfu/ mL,同时分别投喂经浓度为IO1UO3UO5UObfuAiL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡后的配合饲料 1号B1、C1、D1 组每 5 天换水-B2、C2、D2 组每 10 天换水B3、C3、D3 组每 15 天换水B4、C4、D4 组每 20 天换水B5、C5、D5 组每 25 天换水B6、C6、D6 组每 30 天换水-次，换掉25cm深的水(量) 一次，换掉25cm深的水(量 一次，换掉25cm深的水(量 一次，换掉25cm深的水(量 一次，换掉25cm深的水(量 一次，换掉25cm深的水(量Bl-U Cl-U D1-1. . . D6-1换水后加入蛭弧菌蛭质体菌液使水体中菌体浓度为 IO1PfVmLBl-U Cl-2、Dl-2. . . D6-2换水后加入蛭弧菌蛭质体菌液使水体中菌体浓度为 103pfu/mLBl-U Cl-3、Dl-3. . . D6_3换水后加入蛭弧菌蛭质体菌液使水体中菌体浓度为 105pfu/mLBl-U Cl-4、Dl-4. . . D6_4换水后加入蛭弧菌蛭质体菌液使水体中菌体浓度为 107pfu/mL斑节对虾实验效果检测(1)生长指标的测定每组随机抽取50尾对虾检测生长情况，对虾长度测定采用精度为0. Imm的游标卡 尺度量，体重采用电子天平称量。试验生长指标按如下公式计算成活率(%) = Nt/NoX100% ；增重率(％) = (Wt-W0)/W0X 100% ；体长增长率(%) = (Lt-L0)/L0X 100% ；式中N。为试验开始时斑节对虾总尾数；Nt为试验结束时斑节对虾总尾数；W。为试 验开始时斑节对虾体重；Wt为试验结束时斑节对虾体重；Lo为试验开始时斑节对虾体长； Lt为试验结束时斑节对虾体长；试验测得的斑节对虾各项生长指标见表一 表四与A组相比，B、C、D组的成活 率、增重率、体长增长率均有明显提高，B、C、D组成活率的增加值分别> 25. 08%,25. 78%, 28. 55 % ；增重率的增加值分别彡40. 54%,65. 62%,86. 35% ；体长增长率增加值分别 彡 0. 09%,0. 17%,3. 19%。从表一-表四可以看出，在对虾养殖过程中，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌蛭 质体的浓度升高，成活率、增重率、体长增长率都明显升高，且都明显高于工厂生产对照A 组，说明采用新型的添加蛭弧菌蛭质体的方法，能明显提高斑节对虾的成活率、增重率、体 长增长率，这在实际生产过程中，不仅大大节约了用水量，而且节省了大量的人力，物力资 源，节约了养殖成本；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组对虾成活率、增重率、体长增长率没有显著的变化。说明新型养殖方法下，5-30天不换水蛭弧菌蛭质体都能催进对虾的 生长。就B、C、D三组不同处理方式而言，均提高对虾的养殖成活率、增重率和体长增长率， 但同时在水体与饲料中添加蛭弧菌蛭质体菌液效果最佳。因此，无论在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体菌液浓度为 IO1-IO7PfuZmL,或者是在饲料中添加浓度为IO1-KfpfuAiL蛭弧菌游泳质体菌液，或是两者 兼用，虽长达30天不换水，都会促进斑节对虾的摄食和快速生长，并且同时在水中与饲料 中添加菌液的效果最好。表一斑节对虾生长指标的检测
权利要求
1.蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用。
2.根据权利要求1所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用，其特征在于所 述蛭弧菌蛭弧菌为(Bdellovibrio sp.)BDFM05，于2009年8月7日保藏于中国典型培养物 保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 209172。
3.根据权利要求1所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用，其特征在于 所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用是将饲料在蛭弧菌蛭质体菌液中浸泡 15-45min。
4.根据权利要求1所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用，其特征在于所 述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用是在水体中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体 中蛭弧菌蛭质体浓度为IO1 l(fpfu/mL。
5.根据权利要求1所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用，其特征在于所 述蛭弧菌蛭质体菌液的制备方法为接种宿主于营养肉汤液体培养基中，在35°C和200rpm摇床培养12h，培养液经4°C， 5000 8000rpm离心10 20min后，沉淀加入至DNB液体培养基中，接入蛭弧菌BDFM05，在 温度25 35°C下，以150 300rpm摇床培养36 48h，得到含蛭弧菌蛭质体和蛭弧菌游 泳体的培养液，培养液在4°C温度下以6000 8000rpm离心15 20min后，去除含蛭弧菌 游泳体的上清，得到的沉淀即为蛭弧菌蛭质体；将蛭弧菌蛭质体用DNB液体培养基、水、生 理盐水或0. 2mol/L pH值为7. 2 7. 6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为1011 1012pfu/ mL的蛭弧菌蛭质体菌液。
全文摘要
本发明特别涉及蛭弧菌蛭质体在斑节对虾等海产品养殖中的应用，其通过在水体和饲料中添加蛭弧菌蛭质体实现。具体包括养殖池塘条件，放养前的准备工作，虾苗选择和放养，投饲管理和养殖期的水环境管理。关键技术是在水体中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体浓度为101-107pfu/mL，同时饲料要用浓度为101-107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min，养殖期间可达30天换水一次。本发明为生物养殖方法，绿色、安全、无污染，效果显著，能够改善水质，促进斑节对虾生长，提高免疫力，提高成活率，有极好的发展前景。对提高经济效益和食用安全性，保障人类健康具有十分重要的意义。
文档编号C12N1/20GK102037917SQ20101026867
公开日2011年5月4日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者王沛贤, 蔡俊鹏 申请人:华南理工大学