专利名称：新型人肿瘤坏死因子受体-Fc融合基因及其产物蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程制药领域，具体涉及一种新型TNFR-Fc融合基因及其表达产物。
背景技术：
类风湿性关节炎(liheumatoid Arthritis,RA)是人类最常见的自身免疫性疾病之一，患病率约1%，与人类白细胞抗原DR4/DR1明显相关，具有一定的遗传倾向。RA的临床特征多为手、足、腕、膝、臀等的关节滑膜发炎，最终导致关节损伤。滑膜炎引起大量淋巴细胞浸润，主要包括巨噬细胞、T淋巴细胞和浆细胞，同时血管增生。关节损伤主要发生于滑膜与软骨和骨毗邻处。RA是一种以累及关节为主的系统性自身免疫性疾病。近年来研究表明，肿瘤坏死因子-a (TNF- α )是RA发病机制中的关键因子(Feldmann M 2001 ； RavinderN Maini，2001 ；RavinderN Maini，199)，其可刺激机体产生一系列因子，如白细胞介素(IL)-1、IL_6、IL-8和粒细胞集落刺激因子等的产生，并诱导内皮细胞表达黏附分子，吸引白细胞到受累关节。TNF-α还刺激滑膜巨噬细胞、纤维母细胞、破骨细胞和软骨细胞产生基质金属蛋白酶，并抑制软骨蛋白聚糖的合成，并可导致滑膜炎症和关节软骨的损伤。阻断TNF-α即可在RA发病机制的上游阻断炎症反应，达到治疗RA的目的。月中瘤坏死因子 α (Tumor Necrosis Factor Alpha, TNF α )禾口淋巴毒素(Lymphotoxin,LT)是通过与其共同受体TNFR75和TNFR55结合而发挥生物学作用的。人肿瘤坏死因子受体75 (TNFR75)由461个氨基酸组成，其N-末端235个氨基酸残基，是TNFR75蛋白酶水解下来的细胞膜外区片段，也称为可溶性TNFR75 (STNFR75)。大量实验证据表明可溶性TNFR75和TNFR55(即受体的膜外部分)可以通过与TNF α和LT的有效结合而阻断TNFa和LT在生物体内的生物学作用(Hunns-MartinLorenz, 2002 ；smith, C. Α.等(1990), science, 248 1019-1023)，且 TNFR75 分布更广发，亲和能力更强。但TNFR半衰期较短。人IgG类免疫球蛋白半衰期可高达21天，它们是人类血液中最丰富的蛋白质，分为 IgA、IgG、IgM、IgE 和 IgD，其中 IgG 有 IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4 四个亚型。IgGlFc 段由232个氨基酸残基组成，包括铰链区、CH2区和CH3区。已有报道说将IgG的Fc绞链区中的半胱氨酸残基与其他蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合而形成融合蛋白，使蛋白质类似于IgG分子但无CHl区域和轻链。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出与类似同种型的人IgG相当的体内药物动力学特性。国外已有人借助基因工程手段构建了人TNFRII型受体部分与IgG的Fc片段的融合蛋白，此蛋白在离体条件下对TNF有中和作用(美国专利5，605，590)。国内也有构建此类融合蛋白，马菁等在CN1417334A肿瘤坏死因子受体可溶部分的重组基因，及融合蛋白基因与产物中构建了一种含有linker的融合蛋白；刘昌闾等在CN1502632A新型TNFR-Fc融合蛋白中构建了一种截短的融合蛋白；徐斌等在CN101003575中利用双顺反子构建了一种人肿瘤坏死因子可溶性受体II -抗体FC段融合蛋白。这类药物人源化程度高，引起的免疫原性反应低，治疗效果很好，比单靠止痛药和抗炎药更有效控制病情。但目前这类治疗药物普遍存在制备方法复杂，表达量低，价格昂贵等丞待解决的问题。
发明内容
本发明解决的一个问题是提供了一种新型的重组人TNFR75-FC融合基因，及其表达的蛋白质产物。本发明解决的第二个问题是构建了一种含有重组人TNFR75-FC融合基因片段的重组载体pCI-gs-TNFR75-Fc，转染哺乳动物细胞后，其真核细胞的扩增标记，可大幅提高目的基因在宿主细胞中的拷贝数，从而提高目的蛋白的表达量。本发明解决的第三个问题是，提供了一种含有重组载体pCI-gS-TNFR75-Fc的哺乳动物细胞，可以稳定表达TNFR75-FC。所述哺乳动物细胞可以是CHO细胞、NSO细胞等常用哺乳动物细胞工程细胞株。本发明解决的第四个问题是通过硫氨甲硫氨酸(MSX)加压扩增筛选，使表达目的蛋白细胞株表达量提高至少一个数量级，在进行高效表达细胞株筛选时，最终将MSX浓度提高到400 500 μ m,筛选单克隆表达量达到20 30pg/cell · Mhr。为解决上述问题，本发明通过如下技术方案来实施抽提HL-60细胞株的总RNA，RT-PCR扩增人sTNFR75基因片段；PCR扩增人IgGlFc基因片段。采用Overlap extention PCR技术将两基因片段进行拼接得到编码rhTNFR:Fc融合蛋白的全长cDNA序列。将获得的该cDNA序列插入克隆中间载体Teasy，经序列测定证实正确后进行真核表达载体的构建。rhTNFR:Fc融合蛋白cDNA片段克隆于表达载体，采用脂质体转染技术，将无菌抽提的重组质粒rhTNFR Fc/pCI-gs导入CHO细胞中，经MSX加压筛选，得到了高表达量的rhTNFR:Fc融合蛋白的基因工程单克隆细胞株，在将MSX浓度提高到400 500 μ m时，筛选单克隆表达量达到20 30pg/cell · Mhr。本发明通过OVERLAP PCR的方法合成了一种人肿瘤坏死因子受体融合基因TNFR75-FC，采用含有GS系统的真核细胞高效表达载体，在哺乳动物细胞中经过MSX加压筛选使得该融合蛋白的表达量提高了 20个百分点，融合蛋白活性提高了 8个百分点。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明，但本发明并不限于下述实施例。实施例1人可溶性TNFR75 cDNA的制备1、PCR 扩增 TNFR75 cDNA设计引物A :5，TC AAG CTT ATG GCT CCC GTC GCC GTC TGG 3，引物 B :5，GTC ACAAGATTT GGG CTC GTC GCC AGT GCT CCC TTC AGC 3，，设计另外一组引物，在引物B中将引入linker序列，该序列(Gly4kr) 3，为一编码15个氨基酸的疏水性多肽，它们的活动度较好，不影响TNFR和Fc的天然三维结构，其linker 的 DNA 序列为 5’ -GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGT GGCGGCAGC-3，。设计引入linker 序列的引物 B。引物 Linker-Β :5，GCT GCC GCC ACC GCC GCTTCCGCC ACC GCC GCT TCC ACC GCC ACC GTC0以人早幼粒白血病细胞总RNA为模板，分别以引物A和B为模板、以A和Linker-B为模板，进行 RT-PCR 反应，94°C变性 5min 开始循环，94°C 30sec，58°C 30sec，72°C lmin，共32个循环，最后72°C延伸8min。得到编码sTNFR75和对照sTNFR75_linker的基因片段。2、PCR产物的鉴定和凝胶回收将上述条件进行PCR，在琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中目的蛋白分子量大约SOObp的带，将该片段回收。实施例2人IgGl重链恒定区Fc段基因片段的克隆设计引物C:5，GAG CCC AAA TCT TGT GAC GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA 3，，引物 D :5’ AGT GAA TTC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA 3'；设计引物Iinker-C :GGT GGC GGT GGA AGC GGC GGT GGC GGA AGC GGC GGTGGCGGC AGC GAG。以IgGl Fc/Teasy载体质粒为模板，分别以C和D为引物、以Linker-C和D为引物，进行 RT-PCR 反应，94°C变性 5min 开始循环，94°C 20sec,62°C 30sec, 72°C 2min,共；35 个循环，最后72°C延伸lOmin。扩增得到编码人IgGl Fc和对照Iinker-IgGlFc的基因片段。实施例3 TNFR75-FC融合基因的获得1、PCR扩增编码rhTNFR-Fc融合蛋白/rhTNFR-Iinker-Fc的全长基因片段以sTNFR75PCR扩增产物和人IgGl Fc段PCR扩增产物为模板，以A :5，TC AAGCTTATG GCT CCC GTC GCC GTC TGG 3'禾PD AGT GAA TTC TCA TTT ACC CGG AGA CAGGGA 3，为引物，进行RT-PCR反应。同时以sTNFR75-linker PCR扩增产物和人linker-IgGl Fc段PCR扩增产物为模板，以 A 5' TC AAG CTT ATG GCT CCC GTC GCC GTC TGG 3'禾口 D 5' AGT GAA TTC TCA TTTACC CGGAGA CAG GGA3，为引物，进行 RT-PCR 反应。RT-PCR 扩增反应步骤94 V 变性 5min 开始循环，94 V 40sec,62 °C 30sec,70°C lmin，共30个循环，最后72°C延伸lOmin。扩增得到rhTNFR-Fc和rhTNFR-linker-Fc融合蛋白的全长cDNA片段，其基因片段长分别为1470bp和1485bp。2、rhTNFR-Fc/rhTNFR-1 inker-Fc 融合蛋白 cDNA 克隆于中间载体rhTNFR-Fc/rhTNFR-1 inker-Fc 融合蛋白 cDNA PCR 扩增产物与线性 T easyvector (Promega)进行连接反应。连接产物转化E. coli大肠杆菌感受态宿主细胞，涂布于预先加入X-gal和IPTG的LB平板(含100 μ g/ml氨苄青霉素和15 μ g/ml四环素)上进行蓝白斑筛选。从转化平板上随机挑选白色单菌落，分别接种增殖，进行质粒快速鉴定，得到 TNFR75-Fc 和对照 rhTNFR-linker-Fc 融合基因。实施例4 TNFR75-Fc/rhTNFR-l inker-Fc 融合基因的表达1、rhTNFR-Fc/rhTNFR-1 inker-Fc融合基因片段克隆于表达载体rhTNFR-Fc/rhTNFR-1 inker-Fc融合蛋白表达型重组质粒的构建是利用经商业表达载体pCI-neo改造的pCI-gs的EcoR I单酶切位点，插入经DNA序列测定结果正确的rhTNFR-Fc/rhTNFR-linker-Fc基因片段，用Spel单酶切鉴定插入片段的正反方向，连接产物转化E. coli感受态细胞，经筛选鉴定后获得rhTNFR-Fc/pCI-gs/E. coli ToplOF，和对照rhTNFR-linker-Fc/pCI-gs/E. coli ToplOF，重组菌。2、表达型重组质粒的大量制备将携带重组质粒rhTNFR-Fc/pCI-gs/rhTNFR-linker-Fc/pCI-gs 的大肠杆菌菌种接种于200ml液体培养基中，经过夜培养后采用Qiagen Plasmid Maxi Kits，按照说明书进行重组质粒的大量制备。所得质粒DNA，经70%乙醇洗涤、无菌风干后，溶解于500 μ 1无菌水中，取2 μ 1质粒稀释100倍分别检测Α260值和Α280 {t,A260/A280的比值在1. 75-1. 85之间时，则将该质粒用于细胞转染。3、细胞株转染培养瓶中培养两天的CHO细胞用0. 25%胰蛋白酶溶液消化后，取适量进行台盼蓝染色计数，以3X IO5个细胞数接种6孔板的单孔；细胞接种6孔板M小时后达90%满层，可进行转染；各取250μ1 OPTI-MEM I (Gibco)，加入两支无菌离心管中，在两管中分别加入10 μ ILipofectamine(Invitrogen)和4 μ g稀释质粒，将两管中的液体混合至同一管中，室温静置20分钟使其形成DNA 脂质体复合物；与此同时，吸弃6孔板内的细胞培养基，用细胞生长培养基(DMEM/F12/10% FCS)轻轻洗涤细胞两次后在各孔中加入2ml细胞生长培养基；将500 μ IDNA 脂质体复合物溶液加入6孔板中的相应孔中，置于37°C，5% CO2培养箱中培养过夜。实施例5 TNFR75-Fc/TNFR75-linker-Fc融合蛋白高表达细胞株的筛选将实施例4筛选所得到重组细胞株用0.25%胰蛋白酶溶液消化后，以1 3的比例传入三个IOOmrn培养皿中培养过夜；对小时后，将IOOmrn培养皿中的培养基更换为选择培养基，即在含10%透析胎牛血清(Gibco BRL)的DMEM(无谷氨酰胺)培养液中加入终浓度为25 μ m的MSX (硫胺甲硫氨酸，Sigma)作为筛选剂；根据细胞死亡情况每隔2_4天更换选择培养基，约7-10天细胞开始大量死亡，约14天后细胞克隆开始出现，待细胞克隆直径达l_2mm时用克隆环从平板上挑取单克隆转接入M孔板中，每批转染挑取约50个单细胞克隆。单细胞克隆在M孔板中长至50-70%满层时，取各克隆的培养上清进行ELISA检测，根据细胞生长情况及表达量，选取表达量大于lpg/cell · 24hr的细胞克隆进行药物加压扩增筛选；逐步提高筛选剂MSX的浓度使整合于染色体中的重组质粒进行扩增，待药物浓度提高至500 μ m时，筛选单克隆表达量达到20 30pg/Cell -24hr0取各克隆的培养上清，应用ELISA方法检测其融合蛋白表达量，总共各挑取单克隆50个进行表达量测定，结果见表1。表1、表达量对比实验结果
权利要求
1.一种新型重组人TNFR75-FC融合基因，其特征在于它含有SEQ ID NO :3所述的碱基序列。
2.如权利要求1所述的重组人融合基因，其特征在于，它由含有SEQID N0:1所述的序列的人TNFR75基因和含有SEQ ID NO 2所述的序列的人Ig抗体Fc基因融合而制得。
3.如权利要求1或2所述的重组人融合基因，其特征在于，融合基因构建过程中，TNFR75的3’端引物中引入了 18个碱基与人IgGlFc基因片段5’端的18个碱基互补。
4.一种重组载体pCI-gs-TNFR75-Fc，其特征在于，它含有权利要求1所述的TNFR-Fc融合基因。
5.一种哺乳动物细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的重组载体。
6.权利要求5所述的哺乳动物细胞，其特征在于，它选自CHO细胞、NSO细胞等常用哺乳动物宿主细胞。
7.由权利要求1所述的融合基因表达的蛋白质产物，其特征在于它包含TNFR75和人IgGl抗体!^c片段。
8.如权利要求7所述的蛋白质产物，其特征在于它包含SEQID NO :4所述氨基酸序列。
9.如权利要求7或8所述的蛋白质产物，其特征在于，在进行高效表达细胞株筛选过程中，最终将MSX浓度提高到400 500 μ m。
全文摘要
本发明公开了一种新型人肿瘤坏死因子受体融合基因及其融合蛋白。本发明还将人肿瘤坏死因子受体融合基因cDNA克隆于表达载体pCI-gs，其优点是在pCI-gs载体上引入了真核细胞的扩增标记，可大幅提高目的基因在宿主细胞中的拷贝数，从而提高目的蛋白的表达量。同时，由本发明构建的CHO细胞通过硫氨甲硫氨酸(MSX)加压扩增筛选，使融合基因的产物蛋白表达量明显提高了。
文档编号C12N5/10GK102382850SQ201010268409
公开日2012年3月21日 申请日期2010年9月1日 优先权日2010年9月1日
发明者夏燕, 赵丽丽, 赵志全 申请人:山东新时代药业有限公司