专利名称：一种肝癌外周血基因诊断模型及诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医学诊断技术领域，特别是涉及一种肝癌外周血基因诊断模型及诊断 试齐U盒。
背景技术：
原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma)简称肝癌，是我国常见的 恶性肿瘤之一，死亡率在消化系统恶性肿瘤中位居第3位。肝癌起病隐匿，其典型症状和体 征一般出现于中、晚期，临床上一般采取手术、放化疗等，但晚期患者因癌细胞扩散而治疗 效果差，治愈率低，因此要做到肝癌的早期发现、早期诊断、早期治疗。目前肝癌早期筛查依靠 血清甲胎蛋白检测和B超检查对高危人群进行监测，这两种方法的联合检查使部分肝癌在亚 临床阶段即得以诊断，从而显著提高肝癌的五年生存率。但由于我国肝癌患者有30% -40% 为AFP阴性(AFP < 20ng/dL)，即AFP的敏感性约为60%，AFP的特异性也不高，肝硬化等良 性肝病时AFP也会升高。因此需要寻找新的肝癌相关标志物以提高肝癌早期诊断率。基因芯片是近年来迅速发展起来的高敏感性，高通量的新技术。基因芯片(gene chip)，又称为DNA芯片，DNA微阵列。基因表达谱芯片可以将成千上万个基因特异的探针 或其cDNA片段有规律地密集排列于固相支持物表面，与来源不同的细胞内mRNA或反转录 后产生的cDNA按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并对每 一探针上的荧光信号作出比较和检测，再通过软件分析，迅速得到相关信息。目前基因芯片已广泛用于了解肝癌的发病机制，探寻肝癌疾病转移、复发相关基 因，寻找肝癌相关基因，建立肝癌疾病诊断模型，开发肝癌药物等方面的研究中。肝癌的发生、发展是涉及多个基因、多步骤、多阶段的复杂过程，肝癌患者基因表 达谱改变是肿瘤中最常见的分子改变形式之一。表达谱芯片是近年迅速发展成熟的一项新 技术，对不同来源的个体(正常人与患者)、组织、分化阶段、病变、刺激下的细胞内mRNA进 行检测，从而对这些基因表达的个体、组织、分化阶段、病变、刺激特异性等进行综合分析和 判断，了解疾病的基因表达谱情况，将某几个基因与疾病联系起来，加快确定这些基因的功 能，同时为疾病的早期诊断提供可能。目前关于肝癌患者组织中相关差异基因的研究已经 很多，但组织中相关基因的表达情况多与外周血中不一致，且肝癌组织的获得为有创性的。 而关于肝癌患者外周血基因表达谱方面的研究报道不多，我们运用全基因表达谱芯片对肝 癌患者外周血基因表达谱进行研究，了解肝癌患者外周血显著差异表达的基因，为下一步 建立肝癌患者外周血基因诊断模型提供依据。外周血基因表达谱的检测是目前基因芯片在疾病诊断中的又一应用研究领域。外 周血标本获得的非侵袭性以及反映患者疾病状态的及时性和直接性使得其成为感染性疾 病以及无确定诊断标准的一些疾病如抑郁、应激等进行临床研究的最好标本。由于肿瘤发 生机制的复杂性、癌细胞形成的长期性等因素使得外周血在肿瘤疾病的临床研究中应用较 少，钱丽娟等进行了食管癌患者外周血基因表达谱的研究，结果发现有4个显著差异基因 与食管癌患者组织基因表达谱中出现的相同，认为这4个基因可能与人早期食管癌的发生有关。Galamb等在对恶性结直肠癌组织和外周血标本同时进行研究时发现，在两种标本中 均检出的基因中，部分基因表达水平一致，部分基因在组织中表达上调而在外周血标本中 却表达下调，反之亦然。这说明组织标本和外周血标本中基因表达不具有一致性。Twine等 采用基因芯片研究晚期肾细胞癌外周血细胞基因表达谱，建立了由八个基因组成的诊断模 型，诊断的平均准确率为70%。目前有报道以肝炎患者外周血标本研究肝炎患者基因表达谱以及肝癌患者外周 血循环细胞中特异相关基因，却鲜有采用肝癌患者外周血标本进行肝癌患者的外周血基因 表达谱研究，我们在肝癌患者入院后立即采集静脉血，并以PAXgene Blood RNA Tubes进行 血液标本的保存，以PAXgene Blood RNA kit进行总RNA的提取，这样既避免了血液标本受 治疗药物，样本处理等外界因素的影响而导致的基因表达发生变化，又采用了目前公认的 最稳定的RNA保存方法将RNA保持在如同患者体内水平。采用Affy公司的HG-U133 plus 2. O全基因表达谱芯片进行了肝癌患者外周血基因表达谱的研究，结果显示共有726个显 著差异表达的探针组(Pc < 0. 05, FC彡2. 00)，其中103个显著上调，623个显著下调。其 中 CXCR4，CX3CR1, TLR4, PTPRC, PTGS2, IFNGRl，LYN, CD74, CALR 等基因参与免疫过程，此外 许多基因参与转录调节过程，如 PFDN5，JUND, SUB 1，ZBTB24，NFKBIA, FOS 等，PTPRC，PTGS2, RPS 17，RPL39，RPS6，RPS24等基因参与生物合成过程。我们的研究表明肝癌发生发展过程中，患者外周血基因表达谱发生了显著的变 化，根据这些基因转录水平的显著变化，建立了肝癌患者外周血基因诊断模型及其获得与 模型比较基因表达的试剂盒。。
发明内容
为解决应用外周血诊断肝癌的技术难点，本发明还提供了一种诊断肝癌的检测模 型，该模型包含9个基因表达量范围指标大部分高于健康者，9个基因为CXCR4、SPAG9、F0S、 ANXAl、CALR、IL8、PFN1、GPC3 和 HGF。具体的，本发明提供了一种诊断肝癌的检测模型，该模型包含9个基因表达量范 围指标，9个基因表达量与健康者表达量关系满足采用K近邻算法，5折交叉确认，K = 2， 进行100次运行，求出平均准确率，肝癌组为0. 760士0. 02，健康组为0. 936士0. 02,即表明 患者患有肝癌，其中 9 个基因为 CXCR4、SPAG9、FOS、ANXAU CALR, IL8、PFN1、GPC3 和 HGF。为提高检测肝癌的准确率，本发明提供了一种通过外周血基因诊断肝癌的试剂 盒，该试剂盒包含能够检测 9 个基因 CXCR4，SPAG9, FOS, ANXA 1，CALR，IL8, PFN1，GPC3，HGF 表达量差异于健康人的试剂，优选的，该试剂包含RNA提取试剂和多重RT-PCR试剂，其中多 重 RT-PCR 试剂包含用于多重 RT 反应的 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 18，以及 用于多重PCR反应的SEQ ID NO. 1_18。引物序列SEQ ID NO. 1-18的核苷酸序列信息如下CXCR4基因引物SEQ ID NO. 1 :5’ -AGGTGACACTATAGAATATTCCTGCCCACCATCTACTC-3，SEQ ID N0. 2 5' -GTACGACTCACTATAGGGAAAAGTACCAGTTTGCCACGG-3，SPAG9基因引物
SEQ ID NO. 3 :5’ -AGGTGACACTATAGAATAATTCTTTGTGGCAGTCCCAG-3， SEQ ID NO. 4:5’ -GTACGACTCACTATAGGGACCCTCTCCTCCACTGATGAC-3'
-AGGTGACACTATAGAATACTCCGGTGGTCACCTGTACT-3' -GTACGACTCACTATAGGGACTGAGCGAGTCAGAGGAAGG-3'
-AGGTGACACTATAGAATAGAGATTTTCGGAACGCTTTG-3' -GTACGACTCACTATAGGGACACGTTTACGTCTGTCCCCT-3'FOS基因引物SEQ ID NO. 5 5SEQ ID NO. 6:5ANXAl基因引物SEQ ID NO. 7 5SEQ ID NO. 8 5CALR基因引物
-AGGTGACACTATAGAATAATCCTGATGCTTCAAAACCG-3’ -GTACGACTCACTATAGGGAAATCTGGGTTGTCGATCTGC-3'
SEQ ID NO. 9 5' SEQ ID NO. 10 5' IL8基因引物 SEQ ID NO. 11 5' SEQ ID NO. 12 5' PFNl基因引物 SEQ ID NO. 13 5' SEQ ID NO. 14 5' GPC3基因引物 SEQ ID NO. 15 5' SEQ ID NO. 16 5' HGF基因引物
SEQ ID NO. 17 :5’ -AGGTGACACTATAGAATATTTGGCCATGAATTTGACCT-3’ SEQ ID NO. 18 :5’ -GTACGACTCACTATAGGGACTCCAGGGCTGACATTTGAT-3， 优选地，试剂盒中中的RNA提取试剂为PAXgene Blood RNA Kit :Qiagen ；多重RT-PCR 试剂包含 GeXP 多重基因表达试剂盒(GenomeLab GeXP Start Kit)、Taq 酶(Thermo-Start DNA Polymerase with s印arate 25mmol/L MgCl2, BCK-0001)和 DNA 荧光分子量标准品(DNA Size Standard) =Genomelab DNA Size Standard kit-400，Cat. #608098, Lot#S809140。
本发明建立的由 CXCR4，SPAG9, FOS, ANXA1, CALR, IL8, PFNl, GPC3, HGF 共九个指 标组成的诊断模型对五组外周血标本的诊断准确率达到肝癌组为76. 0%。
-AGGTGACACTATAGAATAAAGGGCCAAGAGAATATCCG-3' -GTACGACTCACTATAGGGAAGCAGACTAGGGTTGCCAGA-3'
-AGGTGACACTATAGAATAGGGAAAACGTTCGTCAACAT-3' -GTACGACTCACTATAGGGAGCGTCTTGTCAGTCTTGGTG-3'
-AGGTGACACTATAGAATACTGGATGAGGAAGGGTTTGA-3' -GTACGACTCACTATAGGGAATCATTCCATCACCAGAGCC-3'
具体实施例方式为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。1、引物设计及合成基因采用GeXP Express设计软件进行引物设计，并送赛百盛生物有限公司合成。 2、样本的收集及其外周血样本总RNA的提取步骤样本的收集全血肝癌及肝硬化患者入院后进行治疗前抽取静脉血2. 5ml入PAXgene Blood RNA Tubes (管中预先装有6.9ml保存液)中，上下颠倒混勻后，放_20°C冰箱保存。血清用促凝剂加分离胶试管抽取，3500r/m离心IOmin分离血清，立即进行生化 指标和肿瘤标志物的检测。总RNA的提取从-20°C冰箱拿出保存的PAXgene blood RNA样本，室温孵育大于2h而使红细胞充分裂 解，孵育期间上下颠倒混勻；3000-5000g离心llmin，尽量去除上清，加4ml无核酶水(M，充分 混勻；3000-5000g离心llmin，尽量去除上清，加350 μ 1重悬缓冲液(BRl)，充分混勻；转到1. 5ml 的离心管(MCT)中，加300μ 1结合缓冲液(BR2)，再加40μ 1蛋白酶K(PK)，斡旋混勻5s ；55°C孵 育lOmin，中间拿出上下颠倒混勻；将裂解物全部转移到离心柱(PSC)上，< 20000g离心3min ；将
6上清全部转移到1. 5ml的离心管(MCT)中，同时注意不要吸到沉淀；加350 μ 1无水乙醇，充分混 勻，500-1000g快速离心l_2s ；取700 μ 1混合液加到离心柱(PRC)上，8000-20000g离心Imin ；将 剩余混合液加到离心柱(PRC)上，8000-20000g离心Imin ；加350 μ 1洗液(BR3)，8000-20000g离心 Imin ；(在1. 5ml离心管中轻轻混合10 μ 1 DNA酶RNFD禾口 70 μ 1 RDD,稍离心)，力口 80 μ 1 DNA混合 物加到离心柱膜上，室温孵育15min ；加350 μ 1洗液(BR3)，8000-20000g离心Imin ；加500 μ 1洗 液(BR4)，8000-20000g 离心 Imin ；加 500 μ 1 洗液(BR4), 8000-20000g 离心 3min ；8000-20000g 离心 1. 15min ；加40 μ 1洗脱液(BR5)使整个膜湿润，8000_20000g离心Imin ；加40 μ 1洗脱液(BR5)使 整个膜湿润，8000-20000g离心Imin ；65°C孵育5min，中间不要摇动，然后立即置冰上；定量和检测总RNA紫外定量和检测取1 μ 1总RNA用RNase-free水稀100倍至100 μ 1，用紫外分光光度计测样品RNA 浓度及Α260和Α280值，Α260/Α280比值应为1. 8-2. 0之间。琼脂糖凝胶电泳质检，检测RNA完整性配制1. 5%的琼脂糖凝胶，EB染色检测染色胶上28S和18S核糖体RNA条带的 强度是否约为2 1。3、GeXP 扩增单重RT-PCR引物处理单重引物储备液的制备将所有引物溶解在无RNA酶的水中，浓度为ΙΟΟμΜ;单重引物工作液的制备将引物储备液用水稀释，正向引物(PCR引物)工作液浓度为 200ηΜ(储备液作500倍稀释)，反向引物(RT弓丨物)工作液浓度为500ηΜ(储备液作200倍稀释)。制备对照RNA 将所有处理组和对照组RNA混合，制备多重反应中所有基因都能表 达的阳性对照RNA，初始RNA添加量为每个反应50ng总RNA。使用对照RNA和反向单重引物进行RT反应，包含阳性质控(STD)，无模板质控 (NTC)和无反转录酶质控(RT-)反应。配制反转录反应试剂 共制备9管STD样本(将它们充分混合，制备统一的cDNA模板)，1管NTC和1管 RT-样本混合物，每管中加1的10XRT Primer，室温充分混合。反转录反应程序如下1个循环 配制PCR反应试剂 共配制9管实验样本混合物，1管NTC和1管RT-样本混合物。PCR反应程序如下从步骤2开始，35个循环 GeXP 电泳
根据不同稀释比例(1 5,1 10,1 20,1 25，1 125)将PCR产物稀释，从 而得到仪器可识别的产物浓度；用甲酰胺(SLS)将内标Marker(DNA Standard 400)稀释40倍，充分混勻后，每孔 20 μ 1加入样品板，取2μ 1 PCR产物加入样品管，不要出现气泡，充分混勻，每孔随即加一 滴矿物油，防止甲酰胺氧化；在普通96孔板上每孔加3/4体积的分离缓冲液(s印aration buffer)；调整GeXP系统安装毛细管和凝胶；将毛细管温度调整到50°C ；按照0. 4ml凝胶， 重复3次模式执行初级管路冲洗；执行毛细管充胶，重复3次；执行光路聚焦；监控仪器基 线,低于4000RFU ；输入样本信息输入样本名；对每个样本指定Freg-3分离方法，指定默认的GeXP 分析方法，保存样本信息；GeXP样本分析使用蒸馏水清洗水槽；放入样本板和缓冲液板，开始运行样本；查看片段分析结果打开片段分析模块；使用分析后结果(analyzeddata)建立一 个新的分析(study)；在片段列表(fragment)窗口中设定过滤参数，过滤非D4燃料峰及 其他非产物峰；确认现有分析结果正确，查看片段分析结果，确认样本RNA中含有所涉及片 段，信号强度适中(370-120，000RFU)；将片段结果输出至GeXP系统。分析结果显示9个基因均为阳性。多重RT-PCR反应引物处理多重引物工作液的制备将引物储备液用水稀释，正向引物(PCR引物)工作液浓 度为200nM(储备液作500倍稀释)，反向引物(RT引物)工作液浓度为500nM(储备液作 200倍稀释)。配制反转录试剂 反转录反应程序如下1个循环 配制多重PCR反应试剂 多重PCR反应程序如下从步骤2开始，35个循环 GeXP电泳同上。分析结果显示多重反应体系中各基因均为阳性。采用优化后的标准GeXP操作程序对所有样本进行实验，每个样本重复3次实验， 将实验结果输出到GeXP系统进行分析，以内参基因B2M和ACTB荧光值的几何均数为对照， 其余指标荧光值与对照相比较，所得出的比值为各指标的相对表达值。
基因肝癌表达量健康表达量CXCR40. 7460. 825 通过对上述基因表达量的计算，得出肝癌的诊断准确率为76%。本发明的模型已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发 明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离 本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为 包括在本发明的范围之内。
权利要求
一种诊断肝癌的检测模型，该模型包含9个基因表达量范围指标，9个基因表达量与健康者表达量关系满足采用K近邻算法，5折交叉确认，K＝2，进行100次运行，求出平均准确率，肝癌组为0.760±0.02，健康组为0.936±0.02，即表明患者患有肝癌，其中9个基因为CXCR4、SPAG9、FOS、ANXA1、CALR、IL8、PFN1、GPC3和HGF。
2. 一种通过外周血基因诊断肝癌的试剂盒，该试剂盒包含能够检测9个基因CXCR4， SPAG9，F0S，ANXAl，CALR，IL8，PFNl，GPC3，HGF表达量差异于健康人的试剂，该试剂包含RNA 提取试剂和多重RT-PCR试剂，其中多重RT-PCR试剂包含用于多重RT反应的SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 4、SEQID NO. 6、SEQID NO. 8、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 18，以及用于多重 PCR 反应的 SEQ ID NO. 1-18。
3.根据权利要求3所述的试剂盒，多重RT-PCR试剂包含GeXP多重基因表达试剂盒、 Taq酶和DNA荧光分子量标准品。
4.根据权利要求4所述的试剂盒，其中DNA荧光分子量标准品为GenomelabDNA Size Standard kit-400, Cat. #608098, Lot#S809140 ；GeXP 多重基因表达试剂盒为 GenomeLab GeXP Start Kit ;Taq 酶为 Thermo-Start DNA Polymerase with separate 25mmol/L MgCl2, BCK-0001 ；RNA 提取试剂为 PAXgene Blood RNA Kit =Qiagen0
全文摘要
本发明涉及一种肝癌外周血基因诊断模型及诊断试剂盒，诊断模型包含9个基因表达量范围指标，9个基因为CXCR4、SPAG9、FOS、ANXA 1、CALR、IL8、PFN1、GPC3、HGF，试剂盒包含能够检测9个基因CXCR4、SPAG9、FOS、ANXA1、CALR、IL8、PFN1、GPC3、HGF表达量差异于健康人的试剂，优选的，该试剂包含RNA提取试剂和多重RT-PCR试剂，其中多重RT-PCR试剂包含SEQ ID NO.1-18。本发明建立的诊断模型对五组外周血标本的诊断准确率达到肝癌组为76.0％。
文档编号C12Q1/68GK101921864SQ20101026838
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月1日 优先权日2010年9月1日
发明者张朋军, 田亚平, 闰玮 申请人:中国人民解放军总医院