专利名称：一种pdgfra基因突变检测液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种PDGFRA基 因突变检测液相芯片。
背景技术：
胃肠间质瘤(gastrointestinal stroml tumor, GIST)是胃肠道最常见的间叶源 性肿瘤，其发病率有逐年增高的趋势。甲磺酸伊马替尼(格列卫)是一种分子靶向药物，用 于治疗不能切除、或发生转移的恶性胃肠道间质肿瘤，在GIST的治疗中取得了非常好的疗 效。伊马替尼的作用机制是抑制血小板衍化生长因子(PDGFR)受体的酪氨酸激酶，从而抑 制由PDGFR导的细胞行为，体外实验显示伊马替尼可抑制GIST细胞的增殖并诱导其凋亡。 尽管伊马替尼的疗效很好，却不可避免地出现了耐药的问题。研究中约15%的病人在服药 2个月内发现原发耐药，还有获得性耐药的产生，其耐药产生的分子机制差异较大。另外，近 2年随着治疗时间的延长，发现约50%本来治疗有效的胃肠道间质瘤病人在用药3年左右 发生继发性耐药，这成为目前伊马替尼治疗GIST亟待解决的难题。大多数GISTs存在c-KIT基因以及血小板源性生长因子受体PDGFRA基因突变，其 中PDGFRA基因的突变大多发生于胃肠道外GIST (网膜、腹膜)，组织学形态以上皮及混合型 细胞为多，并且生物学行为具有高度侵袭危险性，对预后有提示作用。其中发生在PDGFR基 因外显子18上的突变D842V、DIMH 842-845缺失和IMHD 843-846缺失对伊马替尼耐药，而 发存在外显子12的V561D突变则对伊马替尼敏感。因此，检测GIST患者PDGFRA基因突变 情况可用于判断格列卫治疗能否有效，对于指导GIST患者的合理用药，具有重要的参考价 值。目前对PDGFRA多态性的检测产品主要有定量PCR、直接测序法、Pyrosequencing 焦磷酸测序技术、DHPLC等，存在灵敏度低、样品易污染、假阳性率高、价格昂贵等缺点，同时 由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的是提供PDGFRA基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测 PDGFRA基因V561D、DIMH 842-845缺失突变、IMHD 843-846缺失突变、D842V的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下一种PDGFRA基因突变检测液相芯片，主要由以下组成(A)针对PDGFRA基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每 种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物 是针对V561D突变位点的SEQ ID NO. 8 SEQ ID NO. 9、针对DIMH 842_845del缺失突变 和/或IMHD843-846del缺失突变的SEQ ID NO. 10 SEQ ID N0. 12、和/或针对D842V突变 位点的 SEQ ID N0. 13 SEQ ID N0. 14，所述 tag 序列选自 SEQ ID NO. 1 SEQ ID N0. 7 ；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述 anti-tag序列选自SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 21中的序列，所述anti-tag序列能相应地 与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序 列；(C)用于扩增具有 V561D 突变位点、DIMH 842_845del 缺失突变、IMHD 843_846del 缺失突变和/或D842V的突变位点的PDGFRA基因目标序列的扩增引物。优选地，所述扩增引物为针对V561D突变位点的SEQ ID NO. 22 SEQ ID NO. 23、 和/或针对DIMH 842-845del缺失突变及IMHD 843_846del缺失突变和D842V突变位点的 SEQ ID NO. 24 SEQ ID N0. 25。优选地，所述ASPE引物对为针对V561D突变位点的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 8组成的序列及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 9组成的序列；针对DIMHD 842-846野生 型的由SEQ ID N0. 3和SEQ ID NO. 10组成的序列、针对DIMH 842_845del缺失突变的由 SEQ ID N0. 4和SEQ ID NO. 11组成的序列和/或针对IMHD 843_846del缺失突变的由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 12组成的序列；和/或针对D842V突变位点的由SEQ IDN0. 6和SEQ IDN0. 13组成的序列及由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 14组成的序列。本发明的主要优点在于(1)本发明所提供的液相芯片的检测结果与测序法的检测结果吻合率高达 100%。所制备的PDGFRA基因突变检测液相芯片具有很好的信号-噪声比，并且所涉及的 探针以及anti-TAG序列之间基本上不存在交叉反应，TAG标签序列、anti-TAG标签序列的 选取以及TAG标签序列与具体ASPE引物的结合，均能够避免交叉反应，实现多个突变位点 的并行检测。(2)本发明设计的优选的ASPE引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型号的
基因型。(3)本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷，同 时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的微球能适用于不同的检测项目，具有很 强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比 增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1PDGFRA基因突变检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对PDGFRA基因的4种常见突变V561D、DIMH 842-845缺失突变、IMHD 843-846 缺失突变、D842V，分别设计特异性引物序列。ASPE弓丨物由“Tag序列+特异性引物序列”组 成。ASPE引物序列如下表所示表IASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
一种PDGFRA基因突变检测液相芯片，其特征是，主要由以下组成(A)针对PDGFRA基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物是针对V561D位点的SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.9、针对DIMH 842 845del缺失突变和/或IMHD843 846del缺失突变的SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12、和/或针对D842V位点的SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14，所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7；(B)分别包被有特异的anti tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti tag序列选自SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.21中的序列，所述anti tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增具有V561D突变位点、DIMH 842 845del缺失突变和/或IMHD 843 846del缺失突变和/或D842V的突变位点的PDGFRA基因目标序列的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的PDGFRA基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为 针对V561D突变位点的SEQ ID NO. 22 SEQ ID NO. 23、和/或针对DIMH 842_845del缺失 突变和IMHD 843-846del缺失突变及D842V突变位点的SEQ ID NO. 24 SEQ ID NO. 25。
3.根据权利要求1所述的PDGFRA基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对 为针对V561D突变位点的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 8组成的序列及由SEQ ID NO. 2和 SEQ ID NO. 9 组成的序列；针对 DIMHD 842-846 Sf生型的由 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 10 组成的序列、针对DIMH 842-845del缺失突变的由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 11组成的 序列和/或针对IMHD 843-846del缺失突变的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 12组成的序 列；和/或针对D842V突变位点的由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 13组成的序列及由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 14组成的序列。
4.根据权利要求3所述的PDGFRA基因突变检测液相芯片，其特征是，(A)所述ASPE引物对为针对V561D突变位点的由SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 8组成 的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 9组成的序列；针对DIMHD 842-846野生型的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 10组成的序列、针对DIMH 842_845del缺失突变的由SEQ ID NO. 4 和SEQ ID NO. 11组成的序列和针对IMHD 843_846del缺失突变的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 12组成的序列；和针对D842V突变位点的由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 13组成的 序列及由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 14组成的序列；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序 列选自SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 21中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所 选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)所述扩增引物为针对V561D突变位点的SEQID NO. 22 SEQ ID NO. 23、和针 对DIMH842-845del缺失突变和IMHD 843_846del缺失突变及D842V突变位点的SEQ ID NO. 24 SEQ ID NO. 25。
5.根据权利要求1所述的PDGFRA基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列 为5 10个T。
全文摘要
本发明公开了一种PDGFRA基因突变检测液相芯片，主要包括有5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物是针对V561D位点的SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.9、针对DIMH 842-845del缺失突变和/或IMHD 843-846del缺失突变的SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12、、和/或针对D842V位点的SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；扩增引物。本发明所提供的液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。所制备的PDGFRA基因突变检测液相芯片具有很好的信号-噪声比，并可实现多个突变位点的并行检测。
文档编号C12Q1/68GK101984072SQ20101029264
公开日2011年3月9日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者余刚, 许嘉森 申请人:广州益善生物技术有限公司