专利名称：通过对微生物的定量pcr分析来评价土壤健康的方法
技术领域：
本发明是属于生物检测技术领域，一种通过对多种微生物各种基因的定量PCR分 析来评价土壤健康的方法。
背景技术：
土壤质量是指土壤肥力质量、土壤环境质量及土壤健康质量三个方面的综合量 度，土壤在生态系统的范围内，维持生物的生产能力、保护环境质量及促进动植物健康的能 力。为监测耕地土壤质量变化，许多国家和地区已经或正在致力于本地区耕地土壤质量监 测方法和监测系统的建设。在这方面以加拿大较为领先，加拿大自1989年便在农业部国家 基准项目中加进了监测农业土壤健康状况变化。该监测系统的基准数据组包括农场历史、 土壤和地貌描述、土壤的各种化学、物理、生物学特性等重要土壤指标的测量。我国耕地质量和土壤环境监测体系已经基本建立，但仍尚待完善。现有的农田土 壤质量监测体系重视土壤物理指标和化学指标的监测，忽略了生物指标对耕地生产能力和 土壤质量的指示作用。土壤健康(soil health)是指在生态系统和土地利用上，土壤延续 其作为有生机系统的功能，促进大气和水环境的品质，并维持植物、动物和人类健康。因此 只靠一些物理化学参数来评价土壤质量是远远不够的。在土壤的功能上最关键的是微生物 的作用，而且微生物对各种环境压力(stress)是最敏感的。土壤微生物菌群结构受土壤营 养状况、PH值、质地、温度、水分和通气性等条件的影响，任何能改变土壤性质或植被的土地 利用方式均可影响土壤生物区系，均可不同程度地影响土壤含水量、温度、通气性、PH值及 有机碳和氮的水平。由于土地利用导致的微生物代谢多样性的变化和土壤特性的改变，可 能减弱微生物群落对胁迫或扰动的抵抗力。所以微生物作为重要指标的土壤健康评价体系 越来越受到重视。与高等生物相比，微生物还具有快速感应环境压力的能力。它们与周围环境有亲 密的关系这归功于表面积与体积比值高。比如说微生物群体或者活性的变化优先于土壤物 理化学性质的变化，这个功能可以在土壤优化的早期给出信号或在土壤退化的早期发出警 告。例如1_5年的微生物量的周转率比总土壤有机质的要快。监测荷兰土壤的项目表明 了大多数土壤指示确实有判别不同土壤处理的能力。同样这种能力也在美国某个区域中的 微生物量和基础的呼吸作用中证明。因此，将微生物指标来作为土壤健康的指标更能反映 现实，更能帮助人们了解土壤的健康状况，用科学的方法帮助人们将土地利用最优化。传统的土壤微生物学研究主要通过测定土壤微生物生物量、土壤微生物活性或者 采用平板培养的方法来反映土壤健康的变化。虽然利用分子生物学方法(如构建克隆文 库，变性梯度凝胶电泳(DGGE)，末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)等)的微生物监测已 受到重视，但因所用检测方法都不一样，检测设备和实验技术要求高，耗时较长，具有一定 的局限性。构建克隆文库的方法虽然能得到准确的序列信息，但缺点是因需要对每个样品 进行大量测序，所需要的费用较高。DGGE方法的优点是同时分析和比较多个样品，但缺点是 重复性较差，无法进行不同分析之间的直接比较。T-RFLP方法虽然重复性较好，但无法得到每个峰对应的微生物类型的信息。定量PCR是可以从很少的DNA量中可以定量检测特定的 微生物种类或类型的方法，很灵敏，操作简单，建立标准曲线后同时检测的样品量较多，也 同时在同一批实验中检测多个类型微生物。此方法操作方便快捷，仪器价格相对便宜，因此 将可以广泛应用于土壤健康分析中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、简便、易操作的检测土壤健康情况的方法。本发明提供的检测土壤健康情况的方法，是通过对多种微生物各种基因的定量 PCR分析来评价土壤健康状况。具体步骤如下1、设计或选定可反映土壤健康的所要检测的各种微生物基因的引物对根据评价土壤质量的参数选定合适的用于定量PCR的各种微生物基因的引物对， 这些微生物如碳循环相关微生物，氮循环相关微生物，细菌、真菌和原生动物含量，菌根、致 病细菌以及康生物抗性细菌的含量等(表一)，但不局限于此；2、构建标准品质粒，制作标准曲线用所设计的引物对环境样品的DNA进行PCR扩增，对产物用载体pMD 18T构建克 隆文库，测序并从中选取合适的质粒作为检测标准品；用Nanodrop检测标准品的浓度，选择合适的多个稀释梯度进行定量PCR检测(如 图3，4，5，6)并建立标准曲线；3、用MoBio试剂盒提取所要检测的土壤样品基因组DNA ；用Nanodrop检测所提取 样品的DNA浓度；4、选择合适的稀释梯度进行定量PCR检测，并根据标准曲线算出样品中特定微生 物基因的拷贝数；5、结合多种微生物基因拷贝数确定土壤健康情况。本发明运用定量PCR方法针对评价土壤质量的指标碳循环，氮循环，微生物量， 特定的微生物种类，抗药性等方面对特定基因进行定量，从而反应环境中各种微生物生物 量，多样性以及主要类型等情况。此方法简便易操作，省时消耗少，并且符合土壤质量评价 指标选择的有效性、敏感性、实用性、通用性等原则。不仅可应用于农田的土地质量评价，还 可以应用于湿地、森林、底泥等多种生态环境的研究中。土壤质量的好坏决定了土壤是否健 康。通过对土壤质量的评价来预测土壤的健康状况。本发明方法可广泛应用于各种环境土壤，并且这种方法使得各种微生物参数的评 价能有机整合在一起考虑。
图1崇明东滩采样位置图(▲农田；■荒地；眷光滩)图2细菌amoA基因克隆文库(TF 光滩，WL 荒地，CL 农田)。图3真菌18S标准品的定量标准曲线。
图4细菌amoA基因标准品的定量标准曲线。图5nifH基因标准品的定量标准曲线。图6菌根(mycorrhiza)标准品的定量标准曲线。
具体实施例方式滩涂生态系统是沿海经济带的重要生态屏障。健康的滩涂是我国近海养殖业可持 续发展的重要保障，也是渔业资源保护的基础。由于河流径流的泥沙淤积，每年还新成陆 50多万亩，因此利用滩涂围垦造田来扩大耕地面积成为沿海地区主要的扩大耕地面积的措 施，滩涂成为我国重要的后备土地资源。长江口作为我国三大河口之一，是我国淤泥质潮滩 的主要分布区之一。长江径流携带的丰富泥沙在口门附近沉积，塑造了广阔的潮滩湿地。在 滩涂的围垦造田过程中及时的确定土壤发育程度很重要。本发明对土壤发育不同阶段(光滩，荒地，农田)的样品进行了多种微生物菌群含 量的定量分析，确定了土壤发育程度相关的各种微生物含量和酶活性指标。步骤如下1)使用 UltraCl ean Soil DNAIsolation Kit (Mobio，美国)对光滩，荒地，农田 三种不同类型的土壤样品提取DNA ；2)根据评价土壤质量的微生物参数合成合适的用于定量PCR的引物(见表一)3)构建光滩、荒地和农田三种不同发育阶段的细菌amoA基因的克隆文库a)使用 PCR试剂盒PreMix Ex Taq Version 2. O (TaKaRa)对三个样品的细菌amoA 基因进行PCR;PCR 扩增采用 50 μ L 体系，包括PreMix Ex Taq 25 μ L，引物(终浓度 0. 2 μ M/L)， 环境样品基因组DNA 20ng。PCR循环条件为
权利要求
通过对微生物的定量PCR分析评价土壤健康的方法，其特征在于具体步骤如下步骤一、设计或选择可反映土壤健康的各种微生物基因的引物对；步骤二、构建标准品质粒，并制作标准曲线；步骤三、提取所要检测的土壤样品基因组DNA并检测所提取样品的DNA浓度；步骤四、选择合适的稀释梯度进行定量PCR检测，并根据标准曲线算出样品中特定微生物基因的拷贝数；步骤五、结合多种微生物基因拷贝数确定土壤健康情况。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤一所选的微生物包括碳循环相关微生 物，氮循环相关微生物，细菌、真菌和原生动物含量，菌根、致病细菌以及康生物抗性细菌。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤二是用步骤一所设计的引物对对环境样 品的DNA进行PCR扩增，对产物构建克隆文库，测序并从中选取合适的质粒作为检测标准 品，从而建标准曲线。
全文摘要
本发明是属于生物检测技术领域，具体为一种通过对微生物的定量PCR分析评价土壤健康的方法。本发明包括以下步骤根据评价土壤健康的微生物参数合成合适的定量PCR的引物；构建各种参数的标准品质粒并建立标准曲线；提取样品DNA并通过定量PCR，检测样品中各类微生物基因的拷贝数，并由此判断土壤健康状态。本发明整合了至今的评价土壤健康所需的各种不同分子生物学方法为一体，快速、简便、有效。
文档编号C12Q1/06GK101974631SQ201010523849
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者任文伟, 全哲学, 孟晗, 李壳 申请人:复旦大学