专利名称：一种snp复合检测体系和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种基于基因分型的个体检测体系和方法，尤其涉及一种用于基于 SNP位点分型的SNP复合检测体系和检测方法。
背景技术：
随着各方面对司法诉讼活动的科学性、客观性以及准确性要求的不断提高，物证 鉴定领域不断发展，要求更为精确的分析手段来对案件中检材的个体来源进行确定，DNA分 析由于其检验结果精确，成为物证鉴定领域的重要技术手段。目前法医DNA实验室常采用复合PCR-STR分型技术对未知个体来源的检材进行基 于STR位点的分型以达到确定检材个体来源的目的，该复合PCR-STR分型技术可检测的DNA 片段主要分布在300-400bp之间，但在实际案件中常会遇到因各种因素(包括高温、潮湿、 暴晒、微生物等)发生降解的检材，主要表现为，检材中的DNA分子受损，片段断裂、丢失，分 子变小等，使用复合PCR-STR分型技术对这些检材进行检测时，经常出现“优势扩增”或“无 效扩增”，导致片段较大的STR基因座无法有效分型。虽然通过改进DNA提取方法，提高模 板DNA的浓度和纯度，优化PCR扩增条件等在一定程度上提高降解检材的扩增效率，但仍不 能获得良好的确定检材个体来源的分型结果，难以满足案件分析的需要。SNP是目前为止人类基因组中分布最广泛、存在数量最多的DNA多态型，每300个 碱基对出现一次，NCBI数据库中dbSNP Build 131版中人类SNP的数目为23，652，081，SNP 广泛存在于非编码区和编码区，比STR要高出几个数量级，大约90%的人类遗传变异是单 核苷酸多态性。SNP突变率低，相比STR更加稳定可靠，另外SNP片段短，更易进行PCR扩 增，并且产物的长度不到lOObp，这与300-400bp的STR相比能够更好的适用于降解的DNA 样本，而且SNP引物结合位点间的距离较近，在法医鉴定中有利于对高度降解的DNA进行分 析。如何从上述众多SNP位点中选择出一组SNP位点构建一种检测体系可对痕量、降 解检材的DNA同时进行个体识别、ABO基因分型以及性别鉴定，以达到确定检材个体来源的 目的，扩大犯罪现场的检材范围，为公安机关刑事执法和行政执法、保障社会公共安全提供 有力的技术支撑，成为有待解决的问题。
发明内容
本发明提供一种SNP复合检测体系，通过确定48个SNP位点，扩增引物组以及微 测序引物组，可对未知个体来源的，痕量、降解检材的DNA同时进行个体识别、ABO基因分型 以及性别鉴定，以确定所述痕量、降解检材的个体来源。本发明还提供了一种利用所述SNP复合检测体系进行个体识别、ABO基因分型和 性别鉴定的SNP复合检测的方法，通过该方法可对痕量、降解检材DNA进行准确的个体识 别、ABO基因分型和性别鉴定。本发明提供SNP复合检测体系，包括48个SNP位点，扩增引物组、微测序引物组以及通用芯片；所述扩增引物组中包括与所述48个SNP位点一一对应的48对扩增引物，每对扩 增引物能扩增待检测DNA上包括其相应的SNP位点的突变型或野生型碱基在内的核苷酸序 列；所述微测序引物组中包括与所述48个SNP位点一一对应的48条微测序引物，每 条微测序引物的5’端连有标签序列能与通用芯片上的标签序列互补，3’端包括与待检测 DNA上其相应的SNP位点之前的核苷酸序列互补的序列；所述48 个 SNP 位点为:rs8176747、rsl0488710、rs2272998、rs689512、rs445251、 rs5746846、rs9606186、rs3744163、rs722290、rs521861、rsl821380、rs2269355、 rs7520386、rsl0773760、rsl3218440、rs560681、rs221956、rs4530059、rs338882、 rs430046、rsl3182883、rs9951171、rsll09037、rsl736442、rsl59606、rs321198、 rs4606077、rsl336071、rsl294331、rs3780962、rs9905977、rsl058083、rs740598、 rs8176720、 rs8176719、 amelogenin、 rs8078417、 rs2342747、 rsl0092491、 rs6444724、 rsl498553、rsl2997453、rs7041158、rs214955、rs6955448、rs993934、rsl523537、 rsl053878o在本发明的一个实施例中，在所述SNP复合检测体系中，所述扩增引物组优选为 序列表中SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 96的核苷酸序列；所述微测序引物组优选为序列表 中SEQ ID No. 97至SEQ ID No. 144的核苷酸序列；所述微测序引物5，端连有的标签序列 分别为序列表中SEQ ID No. 97至SEQ IDNo. 144的各条核苷酸序列的自5’末端的第1至 20位的脱氧核苷酸；所述通用芯片为微测序反应通用芯片、固相微测序反应芯片或连接 酶反应通用芯片。本发明所选择的48个SNP位点，在不同人群间等位基因频率差别小(Fst平均值 <0.06)；位点杂合度高(>0.4)；且遗传标记处于连锁平衡状态。HapMap数据库中，详细 描述了这些包括突变形式、在DNA上存在的位置，以及在同一群体内部和不同群体间的分 布状况。试验证明，利用所筛选的48个SNP位点，可以实现同时进行个体识别、ABO 基因分型以及性别鉴定，具体地，针对ABO基因分型，其中的rs8176719 (261delG)、 rs8176720(297A > G)、rsl053878 (467C > Τ)、rs8176747 (803G > C) 4 个 SNP 位点，可以对 Al、A2、B、01和02等位基因进行分型检测，进而完成A1A1、A1A2、A101、A102、A2A2、A201、 A202、A1B、A2B、BB、B01、B02、0101、0102和0202等15种ABO基因型组合的分型工作，性别 鉴定位点选自amelogenin基因；利用本发明提出的48个SNP位点实施对未知来源检材的 检测，可一次完成对未知来源检材的个体识别、ABO基因分型以及性别鉴定，提高了检测的 效率。本发明提供的48个SNP位点信息如表1所示表 1序号SNP基因座染色体碱基变化作用1rs8176747(803G>C)9C/GABO基因分型2rsl048871011C/G个体识别3rs22729986C/G个体识别4rs68951217C/G个体识别5rs44525120C/G个体识别6rs574684622C/G个体识别7rs960618622C/G个体识别8rs374416317C/G个体识别9rs72229014C/G个体识别10rs52186118C/G个体识别11rsl82138015C/G个体识别12rs226935512C/G个体识别13rs75203861G/A个体识别14rsl077376012G/A个体识别15rsl32184406G/A个体识别16rs5606811G/A个体识别17rs22195621G/A个体识别18rs453005914G/A个体识别19rs3388825G/A个体识别20rs43004616G/A个体识别21rsl 31828835G/A个体识别22rs995117118G/A个体识别23rsl 1090372G/A个体识别24rsl73644218G/A个体识别25rsl 596065G/A个体识别26rs3211987G/A个体识别27rs46060778G/A个体识别28rsl3360716G/A个体识别29rsl 2943311G/A个体识别30rs378096210G/A个体识别31rs990597717G/A个体识别32rsl05808313G/A个体识别33rs74059810G/A个体识别34rs8176720 (297A>G)9G/AABO基因分型35rs8176719 (261delG)9G/AABO基因分型36amelogeninXYG/A性别鉴定37rs807841717G/A个体识别38rs234274716G/A个体识别39rs 100924918G/A个体识别40rs64447243G/A个体识别41rsl49855311G/A个体识别42rsl29974532G/A个体识别43rs70411589G/A个体识别44rs2149556G/A个体识别45rs69554487G/A个体识别46rs9939342G/A个体识别47rsl52353720G/A个体识别48rs 1053878 (467C>T)9G/AABO基因分型本发明提供的优选的扩增引物组序列和延伸引物组序列，通过Autoprimer在线 软件进行设计。所述48对扩增引物及其相对应的SNP位点如表2所示，PCRU代表上游引 物，PCRL代表下游引物；表2
序号SNP位点 名称 长度 引物序列SEQ
IDNO.
1rs8176747PCRU109AGGCCTACATCCCCAAGG1(803G>C)PCRLATCATGGCCTGGTGGCAG22rsl0488710PCRU140AAAATTAAATAAGGGTACTCATTAACCA3PCRLTAAAAGACTTTCAATTTATGTCAGCA43rs2272998PCRlJ93TGCCTTTTTTTTTTAAGTGACAC5PCRLCGACTCCTACGAGAGAAGATTC64rs689512PCRU100AACATGACTCTGACATCTGGTG7PCRLCAGGAACCCAAGACCTCC85rs445251PCRU103ATCACACTATCCTGACATGAACAA9
权利要求
1.一种SNP复合检测体系，其特征在于，包括48个SNP位点，扩增引物组、微测序引物 组以及通用芯片；所述扩增引物组中包括与所述48个SNP位点一一对应的48对扩增引物，每对扩增引 物能扩增待检测DNA上包括其相应的SNP位点的突变型或野生型碱基在内的核苷酸序列；所述微测序引物组中包括与所述48个SNP位点一一对应的48条微测序引物，每条微 测序引物的5’端连有标签序列能与所述通用芯片的标签序列互补，3’端包括与待检测DNA 上其相应的SNP位点之前的核苷酸序列互补的序列；所述 48 个 SNP 位点为rs8176747、rsl0488710、rs2272998、rs689512、rs445251、 rs5746846、rs9606186、rs3744163、rs722290、rs521861、rsl821380、rs2269355、 rs7520386、rsl0773760、rsl3218440、rs560681、rs221956、rs4530059、rs338882、 rs430046、rsl3182883、rs9951171、rsll09037、rsl736442、rsl59606、rs321198、 rs4606077、rsl336071、rsl294331、rs3780962、rs9905977、rsl058083、rs740598、 rs8176720、rs8176719、amelogenin、rs8078417、rs2342747、rsl0092491、rs6444724、 rsl498553、rsl2997453、rs7041158、rs214955、rs6955448、rs993934、rsl523537、 rsl053878o
2.根据权利要求1所述的SNP复合检测体系，其特征在于，所述扩增引物组为序列表中 SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 96的核苷酸序列；所述微测序引物组为序列表中SEQ ID No. 97 至SEQ ID No. 144的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的SNP复合检测体系，其特征在于，所述微测序引物5’端连有 的标签序列分别为序列表中SEQ ID No. 97至SEQ ID No. 144的各条核苷酸序列的自5，末 端的第1至20位的脱氧核苷酸；
4.根据权利要求1所述的SNP复合检测体系，其特征在于，所述通用芯片为微测序反 应通用芯片、固相微测序反应芯片或连接酶反应通用芯片。
5.一种利用权利要求1-4任一项所述SNP复合检测体系进行个体识别、ABO基因分型 和性别鉴定的SNP复合检测方法，包括1)提取待检测样本的DNA作为模板；2)使用所述扩增引物组对步骤1提取的DNA模板进行多重PCR扩增反应；3)然后将步骤2得到的产物使用所述微测序引物组进行引物延伸反应，所述引物延伸 反应中ddNTP为荧光标记的ddNTP ；4)将步骤3的产物和通用芯片进行杂交，根据芯片杂交结果进行个体识别、ABO基因分 型和性别鉴定；
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应在一管中进行或分多管进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的模板为提取自全 血、组织等检材的DNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的循环参数为 95°C, 15min ；94°C，30sec ；55°C，30sec ；72°C, Imin sec ；40 个循环；4°C保存。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述引物延伸反应的循环参数为96°C， 3min ；94°C,20sec ；40°C, Ilsec ；46 个循环；4°C保存。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述杂交的条件为在密封的盒子中，温 箱内42V杂交，时间为2 2. 5小时。
全文摘要
本发明提供一种SNP复合检测体系和检测方法，该SNP复合检测体系包括一组适合法医学应用的48个SNP位点，扩增引物组、微测序引物组以及通用芯片，可用于进行个体识别、ABO基因分型和性别判定。本发明还提供了一种利用所述SNP复合检测体系进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定的SNP复合检测方法，通过对待检测样本的DNA进行包含48个SNP位点的核苷酸片段的扩增，通过微测序引物进行引物延伸反应，再使用通用芯片对扩增产物进行基于SNP位点的分型，提高了对于痕量、降解检材DNA的分析能力，扩大了犯罪现场的检材范围，为公安机关刑事执法和行政执法提供有力的技术支撑。
文档编号C12Q1/68GK102115788SQ201010577908
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月2日 优先权日2010年12月2日
发明者李彩霞, 胡兰, 葛芸英 申请人:公安部物证鉴定中心