专利名称：一种检测迟缓爱德华氏菌、鲇鱼爱德华氏菌或致病性迟缓爱德华氏菌的引物序列及其检 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种检测迟缓爱德华氏菌、鲇鱼爱德华氏 菌或致病性迟缓爱德华氏菌的引物序列及其检测方法和应用。
背景技术：
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是水生动物常见的病原菌，其感染的宿主 范围十分广泛，有两栖类(蟾蜍、蛙)、爬行类(蜥蜴、蛇、海龟、鳄鱼)、鱼类(鳗、鲇、鲆等)、 鸟类(企鹅、秃鹰、鸵鸟)和包括人在内的哺乳动物(海狮、海牛、猪、狗、牛、猴子)。迟缓爱 德华氏菌能在海水和淡水环境生存，感染多种野生和养殖鱼类，引起以出血性败血症为主 要症状的爱德华菌病(Edwardsiellosis)。随着我国水产养殖的快速发展，迟缓爱德华菌 病不仅影响多种淡水经济动物(鳗鲡、甲鱼、牛蛙、鲫鱼、草鱼等)的养殖，还严重影响多种 海水经济鱼类(大菱鲆、牙鲆、舌鳎、石斑、大黄鱼等)的养殖，给养殖业造成巨大的经济损 失。迟缓爱德华氏菌是爱德华氏菌属中唯一可以感染人、使人患病的病原，可通过消化道和 皮肤伤口等途径感染人，引起脑膜炎、胆囊炎、心内膜炎、骨髓炎、软组织感染、积脓症、菌血 症及败血症、痢疾、肠胃炎等，危害人类健康。我国动物疫病病种目录将迟缓爱德华氏菌列 为有害生物，是我国和其他国家在水产品进出口贸易中必须检疫的微生物。因此，建立迟缓 爱德华氏菌的鉴定和检测方法、建立疫病的监测和预警体系，是综合控制爱德华菌病、保证 水产养殖健康持续发展和水产品质量和公共卫生安全的需要。病原的鉴定和检测方法有常规生理生化方法、免疫学方法和基于多聚酶链式反 应(PCR)的分子生物学方法。常规生理生化方法繁琐费时，免疫学方法检测灵敏度低、特 异性不高，难以满足复杂多变的疾病疫情处理需要。PCR方法检测时间短、特异性强、灵敏 度高，是目前快速而准确检测病原的有效方法；同时，在普通PCR基础上发展起来的多重 PCR(multiplex PCR)可以检测和分析更多的靶基因，大大提高了检测效率、降低了检测成 本，成为医学和兽医学临床诊断的主要手段。爱德华氏菌是水环境微生态系中的正常菌群，存在于水环境的沉积物、动植物表 面以及一些动物消化道中，有致病性和非致病性两种生理型。当养殖环境不适或易感动物 免疫力降低时，致病性细菌容易感染动物导致疾病发生。正确鉴别致病性和非致病性迟缓 爱德华氏菌是准确诊断疾病、制定疫病有效防治措施的重要前提。爱德华氏菌属的另一个 种细菌-鲇鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)也是鱼类的重要病原菌，该病原在淡 水环境生存，可感染多种淡水鱼类。根据全基因组序列比较分析结果，爱德华氏菌属细菌 的基因组序列相似程度很高，目前报道的基于PCR的方法用于检测爱德华氏菌存在以下问 题(1)不能在种的水平上从其它微生物中准确鉴别爱德华氏菌属细菌；(2)不能在爱德华 氏菌属的细菌准确区分迟缓爱德华氏菌和鲇鱼爱德华氏菌；C3)不能准确区分致病性和非 致病性的爱德华氏菌属细菌。目前越来越多的微生物全基因组序列得到诠释，通过比较基 因组学和功能基因组学的研究可以全面深入地阐明微生物遗传信息的差别和微生物的生物学功能，也为微生物的分子鉴定和鉴别提供了准确的信息。迄今为止，已有两株迟缓爱德 华和一株鲇鱼爱德华氏菌的全基因组序列得到测定，爱德华氏菌的致病机制正在得到逐步 的阐明。通过比较基因组学分析和致病功能基因的分析，迟缓爱德华和鲇鱼爱德华氏菌既 存在种间的遗传信息差别，也存在功能相同的基因信息，为建立准确的鉴别迟缓爱德华和 鲇鱼爱德华氏菌的检测方法奠定了基础。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测迟缓爱德华氏菌、鲇鱼爱德华氏菌或致病性迟缓爱 德华氏菌的引物序列及其检测方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为检测迟缓爱德华氏菌的引物序列 引物序列对SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQID No. 4，所述引物分别为， SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ；SEQ IDN0. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ； SEQID NO. 4 :GCCTTGATGACTATGCCGTTC。检测鲇鱼爱德华氏菌的引物序列引物序列对SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 ；所述引物分别为，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ； SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ；SEQ ID NO. 4 GCCTTGATGACTATGCCGTTC。检测致病性迟缓爱德华氏菌的引物序列引物序列对SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6;所述引物分别 为，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ；SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ；SEQ ID NO. 4 GCCTTGATGACTATGCCGTTC ；SEQ ID NO. 5 GGTCAATAGCTGGCTACACAA ；SEQ IDN0. 6 :GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT。检测致病性鲇鱼爱德华氏菌的引物序列引物序列对SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6;所述引物分别 为，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ；SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ；SEQ ID NO. 4 GCCTTGATGACTATGCCGTTC ；SEQ ID NO. 5 GGTCAATAGCTGGCTACACAA ；SEQ IDN0. 6 :GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT。检测迟缓爱德华氏菌的引物序列的检测方法以SEQ ID No. 1和SEQID No. 2,SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4为引物序列对，进行多重PCR扩增，扩增产物用凝胶电泳进行定性 分析，若扩增产物片断段出现500bp的条带，即为迟缓爱德华氏菌阳性。检测鲇鱼爱德华氏菌的检测方法以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和SEQ ID No. 4为引物序列对，进行多重PCR扩增，扩增产物用凝胶电泳进行定性分析，若 扩增产物片断段同时出现500bp和32!3bp的条带，即为鲇鱼爱德华氏菌阳性。检测致病性迟缓爱德华氏菌的检测方法以SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6为引物序列对，进行多重PCR扩增，扩 增产物用凝胶电泳进行定性分析，若扩增产物片断同时出现955bp和500bp的条带，即为致 病性迟缓爱德华氏菌阳性。检测致病性鲇鱼爱德华氏菌的检测方法以SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6为引物序列对，进行多重PCR扩增，扩增产物用凝胶电泳进行定性分析，若扩增产物片断同时出现95^p、500bp、32;3bp的条带， 即为致病性鲇鱼爱德华氏菌阳性。检测迟缓爱德华氏菌的引物序列的应用所述引物序列可应用于对水产养殖环境 的水样、泥样、动物及其排泄物、动物饵料、植物或进出口动物、水产品的鉴别迟缓爱德华氏 菌的检测试剂盒中。检测鲇鱼爱德华氏菌的引物序列的应用所述引物序列可应用于对水产养殖环境 的水样、泥样、动物及其排泄物、动物饵料、植物或进出口动物、水产品的鉴别鲇鱼爱德华氏 菌的检测试剂盒中。检测致病性迟缓爱德华氏菌的引物序列的应用所述引物序列可应用于对水产养 殖环境的水样、泥样、动物及其排泄物、动物饵料、植物或进出口动物、水产品的鉴别致病性 迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒中。检测致病性鲇鱼爱德华氏菌的引物序列的应用，其特征在于所述引物序列可应 用于对水产养殖环境的水样、泥样、动物及其排泄物、动物饵料、植物或进出口动物、水产品 的鉴别致病性鲇鱼爱德华氏菌的检测试剂盒中。通过本发明的引物序列SEQ ID No. 1-4扩 增出的500bp的DNA条带为迟缓爱德华氏菌和鲇鱼爱德华氏菌保守的rpoS基因片段，而 323bp的DNA条带为鲇鱼爱德华氏菌特有的条带，在迟缓爱德华氏菌中没有，本发明利用建 立的多重PCR方法，根据上述两种DNA特异条带的出现，可以检测和区分迟缓爱德华氏菌和 鲇鱼爱德华氏菌。通过本发明的引物序列SEQ IDNo. 5和6扩增出的95^p的DNA条带为 致病性迟缓爱德华氏菌和致病性鲇鱼爱德华氏菌保守的esaV基因片段，本发明利用建立 的多重PCR方法，根据上述三种DNA条带的出现，可以检测和区分致病性迟缓爱德华氏菌和 致病性鲇鱼爱德华氏菌。本发明所具有的优点普通PCR扩增在同一反应体系有一对引物，只能扩增一个目的基因；本发明采用 多重PCR扩增在同一反应体系有两对以上引物，可扩增2个以上目的基因，因而多重PCR 比单重PCR更节省试剂、时间和工作量，从而降低成本、提高效率。本发明提供的引物序列 和多重PCR扩增特异性强、灵敏度高，可从多种细菌微生物中快速检测迟缓爱德华氏菌，并 进一步区分致病性和非致病性菌株，在3小时内同时完成迟缓爱德华氏菌在种、致病型和 非致病型的鉴别检测，每个扩增反应的检测灵敏度为10 100个细菌。本发明提供的检 测方法可应用于多种含迟缓爱德华氏菌样品的分析和检测，如水生环境的水、沉积物、动物 (鱼、虾、贝、甲鱼、牛蛙、浮游动物等)及其排泄物、植物(浮游植物、藻类等)，进出口水生 动植物、水产品，医院疑似病人的呕吐物、肠积液、排泄物等。本发明提供的检测试剂盒特 异、灵敏、快速和简便，可用于水产养殖、商检、医院对爱德华氏菌病的诊断，在临床诊断和 疾病控制方面具有很大的应用价值。
图1为本发明实施例提供的多重PCR鉴别和检测迟缓爱德华氏菌的电泳显色图， 其中M:Trans2K Plus II DNA marker (北京全式金生物技术有限公司)；C:空白对照(不 添加任何DNA模板)；泳道1-36为迟缓爱德华氏菌(E. tarda)，如表1所示的1_36 ；泳道 37-66为其它种类细菌，如表1所示的37-66 ；泳道67为鲇鱼爱德华氏菌(E. ictaluri)，如
6表1所示的67。图2为本发明实施例提供的单重PCR鉴别致病性迟缓爱德华氏菌的电泳显色图， 其中M :Trans 2K Plus II DNA marker (北京全式金生物技术有限公司)；C 空白对照(不 添加任何DNA模板)；泳道1-9分别为致病性迟缓爱德华氏菌，如表1所示的1-9 ；泳道 10-21分别为非致病性迟缓爱德华氏菌，如表1所示的19-30。图3为本发明实施例提供的多重PCR鉴别致病性迟缓爱德华氏菌的电泳显色图， 其中M JrandK Plus II DNA marker (北京全式金生物技术有限公司)；C:空白对照(不添 加任何DNA模板)；泳道1-9分别为致病性迟缓爱德华氏菌，如表1所示的1-9 ；泳道10-12 为非致病性迟缓爱德华氏菌，如表1所示的19-21 ；泳道13为致病性迟缓爱德华氏菌，如表 1所示的10 ；泳道14-28为非迟缓爱德华氏菌，如表1所示的22-36 ；泳道四_36为致病性 迟缓爱德华氏菌，如表1所示的11-18 ；泳道37-44为其它种类细菌，如表1所示的37-44 ； 泳道45为鲇鱼爱德华氏菌(E. ictaluri)，如表1所示的67。图4为本发明实施例提供的分析牙鲆养殖池塘水样是否有迟缓爱德华氏菌的电 泳显色图，其中M:Trans 2K Plus II DNA marker (北京全式金生物技术有限公司)；1 12 水样1 12 ； 13 空白对照(不添加任何DNA模板)。图5为本发明实施例提供的分析工厂化大菱鲆养殖水体蓄水池水样的电泳显色 图，其中M:Trans2K Plus II DNA marker (北京全式金生物技术有限公司)；1 7:养殖场 A G ;8 空白对照(不添加任何DNA模板)图6为本发明实施例提供的分析工厂化大菱鲆养殖水体蓄水池底泥的电泳显色 图，其中M =Trans 2K Plus II DNA ma rke r(北京全式金生物技术有限公司)；1 7 养 殖场A G ;8 空白对照(不添加任何DNA模板)。图7为本发明实施例提供分析工厂化养殖大菱鲆的电泳显色图，其中M :Trans2K Plus II DNA marker (北京全式金生物技术有限公司)；1 8 肾组织9 空白对照(不添 加任何模板)。
具体实施例方式实施例1快速鉴别检测迟缓爱德华氏菌本实施例利用多重PCR方法，用以在一个PCR反应管中通过一次PCR反应，从含 有迟缓爱德华氏菌的诊断样品中快速鉴别检测迟缓爱德华氏菌，即从表1中提供的各菌株 中快速鉴别检测迟缓爱德华氏菌，其中所述各菌株均可参见相关文献中的报道从市面流通 渠道中获得，为此提供优选引物对SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4，提供的优选的 PCR 反应体系为IXPCR buffer, 200 μ M/L dNTP,50mM/L MgCl2,1. OU Taq 酶，0.4 μ M/L SEQ ID No. 1,0. 4 μ M/L SEQ ID No. 2,0. 2 μ M/L SEQ ID No. 3,0. 2 μ M/ L SEQ ID No. 4，1. 0 μ 1模板，添加蒸馏水至25 μ 1。提供优选的PCR反应条件为94°C预变 性3 5min ；94°C变性45秒，60. 6 60. 8°C退火45秒，68°C 72°C延伸1. 5 2. 5分钟； 进行30 35个循环；72°C延伸5 lOmin。提供优选的定性观测方法为对扩增产物进行 1 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色显示扩增产物大小，观察到扩增产物片断大 小只有500bp的样品判定为迟缓爱德华氏菌阳性，如图1的泳道1-36 ；观察到扩增片段同时有500bp和32!3bp的判定为鲇鱼爱德华氏菌阳性，如图1的泳道67 ；未扩增到上述任何 片段的判断为迟缓爱德华氏菌阴性，如图1的37-66泳道(参见表1)。引物对分别为SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAGSEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCCSEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGTSEQ ID NO. 4 :GCCTTGATGACTATGCCGTTC。实施例2从迟缓爱德华氏菌菌株中鉴别致病性菌株，即从实施例1中筛选出的迟缓爱德华 氏菌阳性为模板。本实施例利用单重PCR方法，用以从迟缓爱德华氏菌菌株中鉴别致病性菌株， 为此提供的优选序列引物对SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6，提供的优选PCR反应体系 % =IXPCR buffer, 200 μ M/L dNTP,50mM/L MgCl2,1. OU Taq 酶，0.4yM/L SEQ ID No. 5， 0.4 μ M/L SEQ ID No. 6，1. 0 μ 1模板，添加蒸馏水至25 μ 1。提供优选的PCR反应条件为 94°C预变性3 5min ；94°C变性45秒；50 62°C退火45秒；72°C延伸50秒 1分30秒； 进行30 35个循环；72°C延伸5 lOmin。提供优选的定性观测方法为对扩增产物进行 1 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色显示扩增产物大小，观察到扩增产物片断大 小只有955bp的样品判定为迟缓爱德华氏菌阳性，如图2的1-9泳道；未扩增到任何片段的 判定为迟缓爱德华氏菌阴性，如图2的10-21泳道。引物对分别为SEQ ID N0. 5 GGTCAATAGCTGGCTACACAASEQ ID NO. 6 :GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT。 同时也可以利用多重PCR方法，用以在一个PCR反应管中通过一次PCR反应，从其 它微生物中快速鉴别和检测致病性迟缓爱德华氏菌，为此提供的优选引物为SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6。提供的优选 多重 PCR 反应体系为=IXPCR buffer, 200 μ M/L dNTP,50mM/L MgCl2,1. OU Taq 酶，0. 4μΜ/ L SEQ ID No. 1,0.4 μ M/L SEQ ID No. 2，0.2 μ M/L SEQ ID No. 3，0.2 μ M/L SEQ ID No. 4， 0.4 μ M/L SEQ ID No. 5,0. 4 μ M/L SEQ ID No. 6，1. 0 μ 1 模板，添加蒸馏水至 25 μ 1。提供 优选的PCR反应条件为94°C预变性3 5min ；94°C变性45秒，60. 6 60. 8°C退火45秒， 68°C 72°C延伸1. 5 2. 5分钟；进行30 ；35个循环；72°C延伸5 IOmi η。提供优选 的定性观测方法为对扩增产物进行1 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色显示扩 增产物大小，同时观察到扩增产物片断大小为955bp和500bp的样品判定为致病性迟缓爱 德华氏菌阳性，如图3的泳道1-9、13、29-36 ；只观察到扩增产物片断大小为500bp的样品 判定为非致病性迟缓爱德华氏菌阳性，如图3的泳道10-12、14-28 ；同时观察到扩增产物片 断大小为95^p、500bp、32;3bp的样品判定为迟缓爱德华氏菌阴性、致病性鲇鱼爱德华氏菌 阳性，如图3的泳道45 ；未扩增到上述任何片段的判断为迟缓爱德华氏菌阴性，如图3的泳 道37-44(参见表1)。引物对分别为SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG
SEQIDNO.2:TCGTTCTGGGTGCAATCC
SEQIDNO.3CCTGGCGTTCCACCACTATGT
SEQIDNO.4GCCTTGATGACTATGCCGTTC
SEQIDNO.5GGTCAATAGCTGGCTACACAA
SEQIDNO.6GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT表1实施例使用的菌株来源及其PCR检测结果
权利要求
1.一种检测迟缓爱德华氏菌的引物序列，其特征在于引物序列对SEQ ID No. 1 禾口 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 禾口 SEQ ID No. 4，所述引物分另Ij 为，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ；SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ； SEQIDN0. 4 :GCCTTGATGACTATGCCGTTC。
2.一种检测鲇鱼爱德华氏菌的引物序列，其特征在于引物序列对SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 ；所述引物分别为，SEQ ID NO. 1 :GGATGAGGCATCGCGTAAG ；SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ；SEQ ID NO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ； SEQ IDNO. 4 :GCCTTGATGACTATGCCGTTC。
3.—种检测致病性迟缓爱德华氏菌的引物序列，其特征在于引物序列对SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和 SEQ ID No. 6 ；所述引物分别 为，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ； SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ； SEQ IDNO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ；SEQ ID NO. 4 GCCTTGATGACTATGCCGTTC ；SEQ ID NO. 5 GGTCAATAGCTGGCTACACAA ；SEQ ID NO. 6 :GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT。
4.一种检测致病性鲇鱼爱德华氏菌的引物序列，其特征在于引物序列对SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5和 SEQ ID No. 6 ；所述引物分别 为，SEQ ID NO. 1 GGATGAGGCATCGCGTAAG ； SEQ ID NO. 2 :TCGTTCTGGGTGCAATCC ； SEQ IDNO. 3 CCTGGCGTTCCACCACTATGT ； SEQ ID NO. 4 GCCTTGATGACTATGCCGTTC ； SEQ ID NO. 5 GGTCAATAGCTGGCTACACAA ； SEQ ID NO. 6 :GCGCCTCAGCGAGTATGCGAT。
5.一种权利要求1所述的检测迟缓爱德华氏菌的引物序列的检测方法，其特征在于 以 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 为引物序列对，进行多重 PCR 扩增，扩增产物用凝胶电泳进行定性分析，若扩增产物片断段出现500bp的条带，即为迟缓 爱德华氏菌阳性。
6.一种权利要求2所述的检测鲇鱼爱德华氏菌的检测方法，其特征在于以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4为引物序列对，进行多重PCR扩增，扩增 产物用凝胶电泳进行定性分析，若扩增产物片断段同时出现500bp和323bp的条带，即为鲇 鱼爱德华氏菌阳性。
7.—种权利要求3所述的检测致病性迟缓爱德华氏菌的检测方法，其特征在于以SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 为引 物序列对，进行多重PCR扩增，扩增产物用凝胶电泳进行定性分析，若扩增产物片断同时出 现955bp和500bp的条带，即为致病性迟缓爱德华氏菌阳性。
8.—种权利要求4所述的检测致病性鲇鱼爱德华菌的检测方法，其特征在于以SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQID No. 4、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 为引 物序列对，进行多重PCR扩增，扩增产物用凝胶电泳进行定性分析，若扩增产物片断同时出 现95^p、500bp、32;3bp的条带，即为致病性鲇鱼爱德华氏菌阳性。
9.一种权利要求1所述的检测迟缓爱德华氏菌的引物序列的应用，其特征在于所述 引物序列可应用于对水产养殖环境的水样、泥样、动物及其排泄物、动物饵料、植物或进出 口动物、水产品的鉴别迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒中。
10.一种权利要求2所述的检测鲇鱼爱德华氏菌的引物序列的应用，其特征在于所述 引物序列可应用于对水产养殖环境的水样、泥样、动物及其排泄物、动物饵料、植物或进出口动物、水产品的鉴别鲇鱼爱德华氏菌的检测试剂盒中。
11.一种权利要求3所述的检测致病性迟缓爱德华氏菌的引物序列的应用，其特征在 于所述引物序列可应用于对水产养殖环境的水样、泥样、动物及其排泄物、动物饵料、植物 或进出口动物、水产品的鉴别致病性迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒中。
12.—种权利要求4所述的检测致病性鲇鱼爱德华氏菌的引物序列的应用，其特征在 于所述引物序列可应用于对水产养殖环境的水样、泥样、动物及其排泄物、动物饵料、植物 或进出口动物、水产品的鉴别致病性鲇鱼爱德华氏菌的检测试剂盒中。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种检测迟缓爱德华氏菌、鲇鱼爱德华氏菌或致病性迟缓爱德华氏菌的引物序列及其检测方法和应用。所述引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增检测的方法，进一步涉及致病性和非致病性迟缓爱德华氏菌检测用引物及应用所述引物进行单重和多重扩增检测的方法；本发明进一步涉及包含上述引物的迟缓爱德华氏菌、致病性和非致病性迟缓爱德华氏菌的检测用试剂盒。本发明采用多重PCR扩增在同一反应体系有两对以上引物，可扩增2个以上目的基因，因而多重PCR比单重PCR更节省试剂、时间和工作量，从而降低成本、提高效率。
文档编号C12Q1/68GK102140513SQ201010620648
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者李 杰, 李贵阳, 肖鹏, 莫照兰 申请人:中国科学院海洋研究所