专利名称：一种获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种获得真菌的方法，尤其涉及一种获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌的方法。
背景技术：
木聚糖酶(1,4-β-D-xylan xylanohydrolase, EC 4. 3. 2. 8)是一种内切糖苷酶， 广泛应用于食品、饲料、纸浆和造纸以及生物燃料等工业领域。其中不具有纤维素酶活的木聚糖酶在上述工业领域，尤其是在纸浆和造纸工业领域中具有更重要和广泛的用途，传统的氯漂工艺中有大量的有机氯排放到环境中，并部分残留在纸制品中，严重危害人类健康， 以不具有纤维素酶活的木聚糖酶为代表的生物漂白越来越多被人们关注，木聚糖酶的处理可促进纸浆中残余木质素的降解和溶解性木质素的抽除，而其不具有纤维素酶活的性质则避免了漂白过程对纤维素的降解带来纸浆的得率和粘度的降低，在提高纸浆白度的同时， 也使得纸张保持了良好的纤维性能。产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的微生物中，以细菌和放线菌居多，而对于产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌所公开的报道相对较少。真菌在除了产生降解酶外，还具有一个优势，那就是能够通过利用菌丝的生长打开纤维素致密的结构，从而加大纤维素的利用率，所以产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌比细菌更具有利用工业价值。对于产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌的获得，现有技术中主要通过在获得具有半纤维素酶的真菌后测定其纤维素酶的活性，进而找到不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌，这样目标性不强，且带有偶然性，获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌的效率不高。
发明内容
本发明提供一种获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌的方法，通过从特定的生物材料中，使用单一性底物培养基，可高效获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌。本发明提供的获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌的方法，包括1)将从含纤维素和半纤维素生物质原料中筛出的真菌作为待筛的真菌；2)将上述待筛的真菌分别平行接种在木聚糖固体培养基上和滤纸固体培养基上进行初筛；3)将初筛得到的能在木聚糖固体培养基上生长，但不能在滤纸固体培养基上生长的真菌作为目标菌株进行复筛将所述目标菌株分别接种在液体培养基中进行培养，测定该液体培养基中木聚糖酶及与纤维素酶相关的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和滤纸条酶的活性，能测出木聚糖酶活性，不能测出内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和滤纸条酶的活性的液体培养基中的菌株即为产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌；所述滤纸固体培养基为以滤纸为唯一碳源的固体培养基，所述木聚糖固体培养基为以木聚糖为唯一碳源的固体培养基，所述液体培养基为含纤维素和半纤维素的生物质原料的液体培养基。在本发明的一个实施例中，从含纤维素和半纤维素的生物质原料中筛出真菌的方法为将含纤维素和半纤维素生物质原料在PDA固体培养基上进行一次以上的培养以纯化得到以单菌落方式生长的真菌，所述以单菌落方式生长的真菌即为待筛的真菌。本发明提供的方法中，所述PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)固体培养基为培养真菌常用的基本培养基；本发明所使用的含纤维素和半纤维素的生物质原料可以是公知的、广义概念上的含纤维素和半纤维素的生物质原料，即，包括所有的含纤维素和半纤维素的植物以及植物的废弃物；特别可以是狭义概念上的含纤维素和半纤维素的生物质原料，即，来自农林业生产过程中除粮食、果实以外的秸秆、树木等含纤维素和半纤维素的部分、农产品加工业下脚料、农林废弃物中含纤维素和半纤维素的物质。优选地，本发明所使用的含纤维素和半纤维素的生物质原料尤其可以选自包括农作物的秸秆、根、茎，木材废弃物或纸浆中的一种或两种以上的组合。含纤维素和半纤维素的生物质原料中含有大量的纤维素和半纤维素，在这些材料上及材料周边的土壤、污水等中含有大量的可以降解它们的微生物，其中既包括产纤维素酶又产木聚糖酶的真菌，也包括产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌。在本发明的实施例中，优选降解状态的(也可称为腐败状态的，可以是部分腐败的，也可以是全部腐败的)的含纤维素和半纤维素的生物质原料(包括降解的麦秸、降解的玉米秆、降解的高粱秆、降解的甘蔗渣、降解的木材或降解的纸浆中的一种或两种以上的组合)进行培养，这类含纤维素和半纤维素的生物质原料上及其周边土壤、污水等中存在较多活性良好的降解纤维素和半纤维素的微生物，其中既包括产具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌，也包括产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌。本发明的方法中，在固体培养基上培养真菌的温度和时间均可按照本领域熟知的培养真菌的温度和时间，一般在25-35°C的温度下进行培养，培养到可以根据菌斑的生长状态(包括菌落形态、菌丝的形态、菌落颜色和所产色素等)分辨出不同的真菌类型即可， 针对不同的含纤维素和半纤维素的生物质原料类型对培养条件进行适当的调整。通常在
左右培养2-3天可达到要求。在液体培养基中培养时一般使用摇床控制在一定的摇速下对真菌进行培养，培养温度和固体培养基类似，培养时间为3-5天即可。本发明提供的方法中，所述木聚糖固体培养基中木聚糖的浓度为18 25g/l ；所述液体培养基中含纤维素和半纤维素的生物质原料的浓度为10 15g/l，所述滤纸固体培养基中的滤纸为普通的灭菌滤纸。以上说明的是本发明方法中各培养环节对培养基的基本要求，当然，在制备这些培养基时，常规的营养配料也是需要的，可以根据情况具体选择，例如，在上述限定的木聚糖固体培养基、滤纸固体培养基和液体培养基的组成的基础上，为满足真菌的生长需求，还可以在上述木聚糖固体培养基、滤纸固体培养基和液体培养基中加入适量的无机盐形式的 N、P、K、Mg、Ca 元素源，如KH2PO4、NH4NO3、(NH4) 2S04、MgSO4 · 7H20 或 CaCl2 ；也可以加入适当的有机氮源，如酵母膏或胰蛋白胨等；进一步的，在固体培养基中通过加入适量的琼脂使其在冷却时凝固为固态；上述木聚糖固体培养基、滤纸固体培养基以及液体培养基在配置好后，分别在120°C加热20 30分钟左右进行灭菌。本发明提供的一种获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌的方法，通过使用滤纸固体培养基作为筛选纤维素酶菌株的单一性底物培养基，相对于目前筛选纤维素酶菌株常用的羧甲基纤维素单一性底物培养基，除了能够反映菌株的内切葡聚糖酶活外，还可反映外切葡聚糖酶和滤纸条酶的活性，从而很好的表征纤维素总酶活，而且价格不高，更适合于用作筛选纤维素酶菌株的单一性底物培养基；另外联合使用木聚糖固体培养基作为木聚糖酶的单一性底物培养基，使待筛选的真菌分别平行接种在木聚糖固体培养基和滤纸固体培养基上进行培养，相互对照观察菌株的生长状态，能够直观、明了的从待筛选的真菌中获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的目标菌株；进一步通过含有含纤维素和半纤维素的生物质原料的液体培养基对上述目标菌株培养后的上清中木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、和滤纸条酶的活性进行测定，来验证所述目标菌株是否为我们所要获得的产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌，上述方法目标性强，步骤简单、合理科学，提高了获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌的效率。
图IA为菌株ZH0101在滤纸固体培养基上的生长状态图，图IB为菌株 T. harzianum在滤纸固体培养基上的生长状态图，图IC为菌株ZH0101在木聚糖固体培养基上的生长状态图，图ID为菌株T. harzianum在木聚糖固体培养基上的生长状态图；图2A为菌株S4在滤纸固体培养基上的生长状态图，图2B为菌株S4在木聚糖固体培养基上的生长状态图；图3A为菌株W36在滤纸固体培养基上的生长状态图，图菌株W36在木聚糖固体培养基上的生长状态图。
具体实施例方式实施例1使用本发明的方法获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌步骤1、将2-3cm长的麦秸放在PDA固体培养基上，在下进行培养，观察菌落的生长，大约2-3天后，PDA固体培养基上长出的菌斑的生长状态可分辨出5个不同类型的真菌的单菌落，将上述5个真菌的单菌落分别挑出，再次接种在PDA固体培养基上在下单独培养以进行纯化，最终得到5个以单菌落方式生长的不同生长状态的真菌作为待筛的真菌；其中，PDA固体培养基的配置方法为称取200g去皮的马铃薯，切成丁，煮沸大约 30min，然后16层纱布过滤，在滤液中加入20g葡萄糖、0. 3gKH2P04、0. 15g MgSO4 ·7Η20，待溶解后用自来水定容至1000ml，加入15-20g琼脂，混勻，微波炉加热至彻底溶解，于121°C湿热灭菌20min。步骤2、将上述5个待筛的真菌分别平行接种在木聚糖固体培养基上和滤纸固体培养基上进行初筛，并对它们进行编号(即，每个单菌落在两个培养基上的编号相同)，同时将能产纤维素酶又能产木聚糖酶的T. harzianum作为对照菌株平行接种在木聚糖固体培养基上和滤纸固体培养基上进行培养。所述木聚糖固体培养基的配置方法为每升培养基中含KH2P042. 0g, NH4N032. 0g, MgSO4 ·7Η200. 2g，酵母膏 5. 0g，桦木木聚糖 20. 0g，琼脂 20. Og5H2O 1000ml，于 121°C湿热灭菌 20min ；滤纸培养基的配置方法为每升培养基中含KH2P042. 0g, NH4N032. 0g, MgSO4 · 7H200. 2g，酵母膏 5. 0g，琼脂 20. 0g，H2O 1000ml，调整 pH 为 7· 2，121 °C湿热灭菌 30min，倒平板后，冷却凝固为固体培养基，然后在每个固体培养基上平整放入一张灭菌后的滤纸；5株待筛菌株分别在木聚糖固体培养基单独培养3天，在滤纸固体培养基单独培养5天后，仅有一株能在木聚糖固体培养基，但不能在滤纸固体培养基上生长，命名为菌株 ZH0101，其和对照菌株T. harzianum在木聚糖固体培养基和滤纸固体培养基的生长状态如图IA-图ID所示。由图IA-图ID可以看出，菌株ZH0101可以在木聚糖固体培养基上生长，并产生水解圈，说明该菌株能够利用木聚糖，并具有较强的降解木聚糖的能力；菌株ZH0101不能在滤纸固体培养基上生长，说明该菌株不能利用滤纸(即没有利用纤维素的能力)；菌株 T. harzianum在木聚糖固体培养基和滤纸固体培养基上均能生长，说明菌株T. harzianum 既能利用木聚糖又能利用滤纸；其中，菌株ZH0101和对照菌株T. harzianum在木聚糖固体培养基和滤纸固体培养基的具体生长数据如表1所示表1
权利要求
1.一种获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌的方法，其特征在于，该方法包括1)将从含纤维素和半纤维素生物质原料中筛出的真菌作为待筛的真菌；2)将上述待筛的真菌分别平行接种在木聚糖固体培养基上和滤纸固体培养基上进行初筛；3)将初筛得到的能在木聚糖固体培养基上生长，但不能在滤纸固体培养基上生长的真菌作为目标菌株进行复筛将所述目标菌株分别接种在液体培养基中进行培养，测定该液体培养基中木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和滤纸条酶的活性，能测出木聚糖酶活性，不能测出内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和滤纸条酶的活性的液体培养基中的菌株即为产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌；所述滤纸固体培养基为以滤纸为唯一碳源的固体培养基，所述木聚糖固体培养基为以木聚糖为唯一碳源的固体培养基，所述液体培养基为含纤维素和半纤维素的生物质原料的液体培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从含纤维素和半纤维素生物质原料中筛出真菌的方法为将含纤维素和半纤维素生物质原料在PDA固体培养基上进行一次以上的培养以纯化得到以单菌落方式生长的真菌，所述以单菌落方式生长的真菌即为待筛的真菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含纤维素和半纤维素生物质原料包括农作物的秸杆、根、茎、木材废弃物或纸浆中的一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述含纤维素和半纤维素生物质原料包括降解的麦秸、降解的玉米秆、降解的高粱秆、降解的甘蔗渣、降解的木材或降解的纸浆中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述木聚糖固体培养基中木聚糖的浓度为18 25g/l。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述滤纸固体培养基为含有灭菌滤纸的固体培养基。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述液体培养基中含纤维素和半纤维素的生物质原料的浓度为10 15g/l。
全文摘要
本发明提供一种获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌的方法，包括将从含纤维素和半纤维素的生物质原料中筛出的真菌作为待筛的真菌，将上述待筛的真菌分别平行接种在木聚糖固体培养基上和滤纸固体培养基上进行初筛；将初筛得到的能在木聚糖固体培养基上生长，但不能在滤纸固体培养基上生长的真菌作为目标菌株在液体培养基中培养后测定酶活进行复筛，能测出木聚糖酶活性，不能测出内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和滤纸条酶的活性的菌株即为产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌。本发明的方法，通过从特定的生物材料中，使用单一性底物培养基，可高效获得产不具有纤维素酶活的木聚糖酶的真菌。
文档编号C12R1/645GK102154119SQ201010619998
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者王权帅, 生吉萍, 申琳 申请人:生吉萍, 申琳