专利名称：用于赤霉病的生物防治的丙硫菌唑耐受性浅黄隐球酵母株的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于防治赤霉病的新型生物防治剂。
背景技术：
赤霉病(FHB)是一种遍布在世界上半潮湿和潮湿谷类生产区域中的小麦和大麦的破坏性疾病(McMullen 等，1997, Scab of wheat and barley: a re emergingdisease of devastating impact-小麦和大麦疮痂一种重新显现的毁灭性冲击疾病。Plant Disease-植物疾病，81,1340-1348 ;Muthomi 等，2002, Susceptibility of Kenyanwheat varieties to head blight，fungal invasion and deoxynivalenol accumulationinoculated with Fusarium graminearum-肯尼亚小麦变体对头部枯萎病、真菌侵害以及接种过禾谷镰孢菌的脱氧萎镰菌醇的累积的易感受性，Journal of Phytopathology-植物病理学杂志，150，30-36 ;Yu. Gagkaeva and Yli-Mattila，2004，Genetic diversity of Fusarium graminearum in Europe and Asia-欧洲及亚洲地区的禾谷德抱菌的遗传多样性，European Journal of Plant Pathology-欧洲植物病理学杂志，110，551-562)。FHB 主要由禾谷德抱菌属群 2 引起(Aoki and O’ Donnell，1999，Morphological and molecularcharacterization of Fusarium pseudograminearum sp. nov. ， formerly recognizedas the Group I population of F. graminearum-过去被认为是禾谷镰孢菌属群I的新种伪禾谷镰孢菌的形态特征与分子特征，Mycologia-真菌学，91，597-609) [perfectstate = Gibberella zeae (Schwein.) Petch] 除了引起谷物产量降低，玉米赤霉可以产生真菌毒素，例如雌激素毒素玉米烯酮(F-2) (Hesseltine攀，1978，Fungi，especiallyGibberella zeae, and zearalenone occurrence in wheat.-真菌，尤其是发现在小麦中的玉米赤霉和玉米烯酮。Mycologia-真菌学，70，14-18)和单端孢霉烯脱氧萎镰菌醇(D0N，呕吐毒素)(Sni jders，1990，Fusarium head blight and mycotoxin contaminationof wheat，a review.-小麦的赤霉病及霉菌污染的评论。Netherlands Journal ofPlant Pathology-荷兰植物病理学杂志，96，187-198)，它们对于谷物质量具有有害的影口向[Cardwell 攀，2001，Mycotoxins:the cost of achieving food security and foodquality-霉菌获得食物安全和食物质量的成本，APS Net: Feature story August-APS网八月特写，2001]并且对于动物健康也具有有害的影响[Μβι^μ8，1991，ToxigenicFusaria, in: Mycotoxins and Animal Foods-在霉菌和动物食物中的产生毒素的德刀菌，J. E. Smith and R. S. Henderson，编著，CRC Press，Inc.，Boca Raton, FL; Beardall andMiller，1994，Diseases in humans with mycotoxins as possible causes，in Mycotoxinsin Grain: Compounds Other than Aflatoxin-谷类中的霉菌除了黄曲霉毒素外的复合物中提到了可能由霉菌引起的人体疾病(MILLER，J.D. & TRENH0LM，H. L.，编著).EaganPress, St. Paul, MN，pp. 387-39; Pestka and Bondy，1994，Immunotoxic effects ofmycotoxins, in Mycotoxins in Grain: Compounds Other than Aflatoxin-谷类中的霉菌除了黄曲霉毒素外的复合物中提到了霉菌的免疫效果(MILLER，J.D. & TRENH0LM，H. L，编著)Eagan Press, St. Paul，MN，pp. 339-358]。降低FHB对于谷物产量和质量的影响依然是一个难解决的问题。杀菌剂有时减少 FHB[Wilcoxson，1996，Fungicides for control of Fusarium head blight-用于防治赤霉病的杀菌剂，Int. J. Tropical Plant Disease-国际热带植物疾病，14，27-50;Suty and Mauler—Machnik，1997， Fusarium ear blight on wheat-epidemiology andcontrol of Gibberella zeae,the teleomorph of Fusarium graminearum with Folicur,in Diagnosis and Identification of Plant Pathogens-小麦传染性疾病上的赤霉病及玉米赤霉的防治，在诊断和检测的植物病原体中与获达多一起的有性型禾谷镰孢菌，Proceedings of the 4th International Symposium of the European Foundation forPlant Pathology-负责植物病理学的欧洲基金会的第四次国际讨论会的程序(DEHNE，H. W.，ADAM, G.，DIEKMANN，Μ.，FRAHM, J.，MAULER-MACHNIK & VAN HALTEREN，P.，Eds).Kluwer Academic Publishers-克吕韦尔学术出版社，Dordrecht.，pp. 243-246; Jones，1999， Seedling blight development and control in spring wheat damaged byFusarium graminearum Group 2_春天里受到禾谷镰孢菌属群2危害的小麦中的苗枯病的 发展及防治.Plant Disease-植物疾病，83,1013-1018]，但残留物、杀菌剂耐性的报道、和谷物中DON含量增加的情况可能影响它们的使用[Mauler-Machnik and Zahn，1994，Earfusarioses in wheat-new findings on their epidemiology and control with Folicur(tebuconazole).-小麦中的麦穗赤霉病_小麦传染病的新发现及利用获达多(戊唑醇)的防治。Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer，47，129-155; Ramirez 攀，2004，Impact ofenvironmental factors and fungicides on growth and deoxynivalenol productionby Fusarium graminearum isolates from Argentinian wheat.-环境因素及杀菌齐[J在生长期的影响以及通过将禾谷镰孢菌从阿根廷小麦上分离而进行的脱氧萎镰菌醇的生产Crop Protection-农作物保护，23，117-125; Chen 等，2000，Recent advances in wheathead scab research in China-在中国的小麦头疮痴研究的新发展，in Proc. Int. Symp.Wheat Improvement for Scab Resistance-预防疮痴的小麦改进的国际讨论会的程序(RAUPP,W. J.，ΜΑ，Ζ·，CHEN，P. & LIU，D.，Eds.). Nanjing Agricultural University-南京农业大学，Jiangsu，China，pp. 258-273; Gale 等，2002，Population analysis ofFusarium graminearum from wheat fields in eastern China-来自中国东部麦田的禾谷镰孢菌的群体分析，Phytopathology-植物病理学，92，1315-1322]。尽管少量谷物的耐性栽培品种或解剖学上改变的变体的发展(Legzdina and Buerstmayr, 2004, Comparisonof infection with Fusarium head blight and accumulation of mycotoxins in grainof hulless and covered barley-伴随赤霉病的传染病的比较以及无壳谷类和有壳大麦中的霉菌的累积，Journal of Cereal Science-谷类科学杂志，40，61-67)有望实现降低FHB中，但是具有理想农业性状的高耐性栽培品种仍未发展(Johnston，1994; Bushnell攀，1998，Genetic engineering of disease resistance in cereals-谷类中的疾病防治的遗传工程，Canadian Journal of Plant Pathology-加拿大植物病理学杂志，20，137-149;Bai 攀，2000，Inheritance of resistance to Fusarium graminearum in wheat-防治小麦中的禾谷镰孢菌的遗传学，Theoretical and Applied Genetics-遗传学的理论与实践，100，1-8)。玉米泰霉的基因多样性[O，Donnell 攀，2004，Genealogical concordancebetween the mating type locus and seven other nuclear genes supports formalrecognition of nine phylogeneticalIy distinct species within the Fusariumgraminearium clade-支持禾谷镰孢菌分枝中的九种系统发育的特殊种的正式认可的配型位与七种其他和基因间的系谱索引，Fungal Genetics and Biology-真菌遗传学和生物学，41，600-623; McCallum 攀，2004，Barrage zone formation between vegetativelyincompatible Fusarium graminearum (Gibberella zeae) isolates-与禾谷德抱菌(玉米赤霉)的分离不能并存的生长地之间的堤坝区域的形成.Phytopathology-植物病理学，94，432-437; Walker 攀，2001，Variation among isolates of Fusarium graminearumassociated with Fusarium head blight in North Carolina-卡罗莱纳州北部与赤霉病有关的禾谷镰孢菌的分离中的变体，Plant Disease-植物疾病，85，404-410; Cumagun攀，2004， Genetic mapping of pathogenicity and aggressiveness of Gibberella zeae(Fusarium graminearum) toward wheat-病原性的基因定位图与玉米赤霉(禾谷镰孢菌)对小麦的侵害，Phytopathology-植物病理学，94，520-526]增加了对于下列情况的关注杀菌剂生物效果和耐性栽培品种将如何耐久。常规的耕田在降低病原接种体产量和伴随的 FHB 中是部分有效的(Miller 攀，1998，Effect of tillage practice on Fusarium headblight of wheat-针对小麦的赤霉病的耕种措施的效果，Canadian Journal of PlantPathology-加拿大植物病理学杂志，20，95-103; Dill-Macky and Jones，2000，The effectof previous crop residues and tillage on Fusarium head blight of wheat-之前农作物残留物的效果和针对小麦赤霉病的耕种，Plant Disease-植物疾病，84，71-76; Pereyra攀，2004，Survival and inoculum production of Gibberella zeae in wheat residue-小麦秸杆中的玉米赤霉的残存物及接种体的生产，Plant Disease-植物疾病，88，724-730)，但是对于土壤保持而言少耕法是优选的农业实践。考虑到远距离接种体扩散的可能性和可以作为病原体的可替换的宿主的各种作物(Chongo攀，2001 ,Reaction of seedling rootsof 14 crop species to Fusarium graminearum from wheat head-14 种农作物品种的穗根对来自小麦头部的禾谷镰孢菌的反应，Canadian Journal of Plant Pathology-加拿大植物病理学杂志，23，132-137)，轮作法是一种站不住脚的方案。自从20世纪90年代中期以来，FHB的生物防治已经吸引了大量的关注，并且已经取得了显著的进展[Perondi 攀，1996，Controle microbiologico da giberelado trigo-微生物防治小麦赤霉病，Fitopatologia Brasiliera-巴西植物病理学，21，243-249; Bujold 攀，2001，Effect of Microsphaeropsis sp. on the production ofperithecia and ascospores of Gibberella zeae-内生真菌对玉米赤霉的子囊壳和囊抱子生产的影响，Plant Disease-植物疾病，85,977-984; Schisler 攀，2002，Biologicalcontrol of Fusarium head blight of wheat and deoxynivalenol levels in grainvia use of microbial antagonists-通过使用微生物拮抗剂来生物控制小麦的赤霉病及谷物中的脱氧萎镰菌醇等级，in Mycotoxins and Food Safety-霉菌及食品安全(DeVRIES，J. W.，TRUCKSESS，M. W. & JACKSON，L S.，编著)· Kluwer Academic/PlenumPublishers-克吕韦尔学术出版社，New York, pp. 53-69; da Luz 等，2003，Biologicalcontrol of Fusarium graminearum，in Fusarium head blight of wheat and barley-小麦和大麦的赤霉病中禾谷镰孢菌的生物防治(LEONARD，K. J. & BUSHNELL，W. R.，编著)APS Press, St. Paul, MN,381-394; Gilbert & Fernando. 2004, Epidemiology andbiological control of Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum)-传染病学及玉米赤霉的生物防治(无性型禾谷镰孢菌).Canadian Journal of Plant Pathology-加拿大植物病理学杂志，26，1-9]。公众接受度、和其他多种疾病控制政策的相容性、以及耐久性在支持用于生物防治FHB的开展策略中都是有利的因素。Schisler攀(美国专利no. 6，562，337)描述了是能够抑制FHB的优异拮抗剂的四种酵母和一种细菌的分离。这些得自小麦花粉囊的微生物，包括酵母浅黄隐球酵母OH182.9 (初始分类为C Z7Oifem1Si1S),所述的酵母浅黄隐球酵母OH 182. 9以保藏登陆号NRRL Y-30216保藏于美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)中。近年来，Schisler攀(2006，Selection and evaluation of the potential of choline-metabolizing microbialstrains to reduce Fusarium head blight-用于代谢微生物菌株来减少赤霉病的胆碱的潜在性的选择和价值，Biological Control-生物防治，39，497-506)披露了选择微生物的胆碱-利用型菌株作为针对FHB的生物防治剂。 尽管开发用于FHB的生物防治剂的努力已有成效，但是化学杀菌剂的开发和使用仍然是用于降低谷类中的FHB的药剂武器中的有价值的工具。最近已经接受免除杀菌化学丙硫菌唑在开花期的小麦上用于降低FHB。然而，尽管取得这些和那些进展，但是仍然需要改进的微生物来用于生物防治FHB。
发明内容
我们现在已经发现新型浅黄隐球酵母株，所述的浅黄隐球酵母株是禾谷镰孢菌的优异拮抗剂。这些微生物有效地抑制和防治谷类、特别小麦和大麦中的FHB。本发明的菌株是之前描述的浅黄隐球酵母OH 182.9 (NRRL Y-30216)的丙硫菌唑耐受性变体。而且，相比于母株OH 182. 9，这些丙硫菌唑耐受性变体意外地针对禾谷镰孢菌表现出明显增强的效果
依照该发现，本发明的目的是提供新型微生物菌株，其抑制小麦和大麦头部中的大量禾谷镰孢菌。本发明的另外方面是提供新型微生物菌株，其有效的用于抑制小麦和大麦头部中的禾谷镰孢菌，并且其也对于杀菌剂丙硫菌唑是耐性的。本发明的进一步目的是提供新型微生物菌株，其有效的用于防治小麦和大麦头部中的禾谷镰孢菌，其可以和杀菌剂丙硫菌唑及其衍生物一起施加。在随后的描述中，本发明的这个和其他目的将容易明显的。生物材料的保藏
两种丙硫菌唑耐受性浅黄隐球酵母株OH 182. 9变体3C和OH 182. 9变体4C已经在2010年5月21日按照布达佩斯条约保藏于美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)中(1815N. University St. , Peoria, IL, 61604, USA)，并且分配的保藏登陆号为 NRRL Y-50378和NRRL Υ-50379。所述菌株是酵母菌，其表现出浅黄隐球酵母的形态学和培养性能特性，并且它们的鉴定已经使用标准方法通过26S rRNA基因的D1/D2结构域和rRNA基因的 ITS 1+2 区域的序列分析来证实(Okoli 等，2006, Cryptotrichosporon anacardiigen. nov. , sp. nov. , a new trichosporonoid capsulate basidiomycetous yeastfrom Nigeria that is able to form melanin on niger seed agar-倉泛够在尼日尔接种琼脂上形成黑色素的来自尼日利亚的新属、新型的一种新孢芽植物的荚膜担子菌酵母■ -Cryptotrichosporon anacardii. FEMS Yeast Res, 7:339-350)。系统树使用和未校正(’P’)取代模型联合的邻居来构建，并且比对间隙处理为遗漏字符，所有字符都是无序和相等重量的。自展值基于100个重复。
具体实施例方式为了本发明的目的，应理解，术语镰刀菌属的使用旨在包括该有机体的有性(有性型)期，并且还包括无性(无性型)期，也分别称为完美和非完美真菌阶段。例如，Gibberella zeae (玉米赤霉)的变形期称为禾谷镰孢菌，FHB的致病物。当花或头部(也
称为种子头部)接种分生孢子时该疾病产生，所述分生孢子由来自OR子囊孢子的不完美而产生，所述OR子囊孢子通过该真菌的完美形式并在接种事件后感染接种的头部而产生。本文中涉及微生物而使用的措词"优异拮抗剂"旨在是指本发明的菌株表现出的镰刀菌属-诱导的头部枯萎病的抑制程度以统计学上显著的水平超过未处理的对照。本文中使用的术语谷类旨在是指通常易受FHB影响的任何谷物种类。报道易受影响的谷类包括小麦、大麦、燕麦和黑小麦，尽管小麦和大麦是其中该疾病展现出显著经济问题的两种作物。这些谷类中的任一种可以是用于FHB防治的靶点种类。禾谷镰孢菌主要从头部发育的开花期至蜡熟初期感染谷类植物的头部(花头、种子头部或穗)。禾谷镰孢菌的发芽分生孢子或子囊孢子透过花粉囊和相关组织以引发宿主感染和FHB症状的发展。本发明的禾谷镰孢菌拮抗剂是衍生自之前在美国专利no. 6，562，337中描述的浅黄隐球酵母OH 182. 9 (NRRL Y-30216，之前鉴定为C floi/aeasis)的变体菌株，其内容通过引用的方式并入本文。尽管浅黄隐球酵母OH 182. 9有效地降低谷类中的FHB，但是不幸的是其甚至对于较低浓度的杀菌剂丙硫菌唑都敏感。该敏感性限制了浅黄隐球酵母针对使用或将使用丙硫菌唑来处理的田野中的FHB的应用。我们现在发现可以产生浅黄隐球酵母OH 182.9的变体或突变体，相对于母株OH 182. 9，其表现出对于丙硫菌唑的显著更强的耐受性(能够在丙硫菌唑存在下生长)。而且，我们已经惊奇地发现至少一些丙硫菌唑耐受性株是禾谷镰孢菌的优异拮抗剂，并且相比于母株浅黄隐球酵母OH 182. 9，表现出针对FHB的显著更强的效果。本发明的丙硫菌唑耐受性株使用延长系列的培养事件来产生，其中酵母菌暴露于增加浓度的丙硫菌唑。如实施例中更详细描述的，母体浅黄隐球酵母OH 182. 9在营养培养基中培养，所述培养基含有至少痕量浓度至最多约为4 ppm的丙硫菌唑,优选约I ppm的丙硫菌唑，并且表现出生长的菌株被选择用于在更高浓度的丙硫菌唑下培养。使用在逐渐增加浓度的杀菌剂下培养的选择的菌株来重复该过程，以最终选择能够在这样的营养培养基中生长的菌株，该培养基含有至少约2 ppm至最多约10 ppm的丙硫菌唑,优选约5 ppm的丙硫菌唑。回收的丙硫菌唑耐受性浅黄隐球酵母菌株随后被检查在期望谷类植物(优选小麦)中降低FHB的严重性的效果。简言之，丙硫菌唑耐受性变体通过植物生物测定，其中酵母菌细胞引入接种禾谷镰孢菌的分生孢子的谷类植物的种子头部。在一个优选实施方案中，禾谷镰孢菌将在固化的生长培养基上产生，并且收获的接种子的水平应该为约IO4 - IO6分生孢子/ml水性混悬液的级别，优选约IO5分生孢子/ml水性混悬液。在培养基或合适缓冲液中的丙硫菌唑耐受性酵母拮抗剂细胞以约IO7 - IO8 Cfu/ml的水平来接种。在本发明的一个实施方案中，禾谷镰孢菌的分生孢子和测试菌株细胞合并在弱磷酸盐缓冲液中，并且约10 mL的混悬液用于接种植物种子头部。然后植物在接近100%相对湿度的条件下培养，该条件有助于真菌感染约3天。在足以可观察地发展疾病的时候后(通常接种后至少约2周)，用于处理种子头部和降低FHB的可见症状的酵母变体被选择用于随后的评价。在上述植物生物测定中选择的丙硫菌唑耐受性酵母变体也可以经历类似于首次的第二次更高重复的植物种子头部生物测定。酵母菌再次在合适的培养基上生长，直到足够延长以用于生物测定。然而，在该第二次植物生物测定中，优选的是使菌株在液体培养基中生长，因为该操作是在工业上广泛地使用的，并且当在液体培养基条件下生长时拮抗剂必须显示生物效果。如上所述，含有单独菌株细胞和禾谷镰孢菌的分生孢子混悬液的菌落肉汤用于接种种子头部。在接种之前，细胞和分生孢子混悬液可以预混合。如首次植物生 物测定中那样，用于处理种子头部并且降低FHB的可见症状的酵母变体被选择为候选拮抗剂。拮抗剂在防治禾谷镰孢菌中的效果的证实可以在放大的温室研究中或者田地研究中来进行，其中在使用禾谷镰孢菌的分生孢子接种之前、期间或之后开花植物使用测试菌株的细胞来处理。植物处理可以和如/73 / 而领域应用相同的方式来进行。OH 182.9的丙硫菌唑耐受性变体确定为优于野生型OH 182. 9祖先菌株，如果当使用相当的液体培养生长技术来产生祖先细胞和变体品系细胞时，丙硫菌唑耐受性变体使疾病严重症状分别比重复的温室或田地试验中在小麦上的祖先菌株降低至少50%或至少25%。疾病严重性通过下列方式来确定计算表现出受到禾谷镰孢菌感染症状的单独小麦头部的表面积的平均百分率。使用上述方法我们已经分离优异FHB拮抗剂的两种新型丙硫菌唑耐受性株浅黄隐球酵母OH 182. 9变体3C和OH 182. 9变体4C。设想所述方法可以重复以分离浅黄隐球酵母OH 182. 9的另外的丙硫菌唑耐受性变体，其表现出在降低谷类植物中的FHB的明显更强的效果。浅黄隐球酵母OH 182. 9的丙硫菌唑耐受性变体通常将在培养基上的需氧液体培养物中生长，所述培养基含有碳源、氮、和可被微生物同化的无机盐、以及可支持高效的细胞生长。优选的碳源是六碳糖，例如葡萄糖，但是其他可同化的碳源例如氨基酸可以替换。在生长过程中可以使用多种无机物和蛋白质材料作为氮源。优选的氮源是氨基酸和脲，但是其他氮源包括气态氨、硝酸盐和铵的无机盐、维生素、嘌呤、嘧啶、酵母提取物、牛肉浸膏、蛋白胨、大豆柏、酪蛋白的水解产物、烧酒糟残液等。在可以引入营养培养物中的无机矿物中是能够产生钙、锌、铁、锰、镁、铜、钴、钾、钠、钥酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氯化物、硼酸盐等离子的常规盐。对于本发明的酵母菌，细胞生长可以在I至36°C的温度下实现，优选温度为15-3°C。营养培养物的pH值可以在4至9之间改变，但是优选的操作范围为pH 6_8。通常，在接种后20-72小时获得最大细胞产量。如下文更详细描述的，FHB的防治可以通过下列方式来实现将浅黄隐球酵母OH182. 9的丙硫菌唑耐受性变体中的一种或多种施加至谷类植物的头部(也称为种子头部)。如本文使用的，“头部”或“种子头部”是指含有种子或种子祖先的穗。相对于未处理的对照，所述拮抗剂的施加量有效地降低FHB的水平。尽管当单独使用上述丙硫菌唑耐受性变体时是有效的，但是在另一个优选的实施方案中，它们和其他用于FHB的已知化学或生物防治剂一起使用。如上所述，由于它们对于丙硫菌唑是耐受的，因此变体可以与丙硫菌唑或其衍生物一起施加。或者，变体可以施加于已经或将单独使用丙硫菌唑或其衍生物进行处理的谷类植物。多种其他生物防治剂适于本文使用，其包括但不限于由Perondi等，1996, ibid\ Bujold等，2001, ibid·,Schisler 等，2002，ibid.' da Luz 等,2003, ibid.' Gilbert & Fernando, 2004,ibid\ 和 Schisler 攀，美国专利 no. 6，562，337 和 6，312，940，以及 2006 年 12 月 15日提交的美国申请序列no. 11/640,091所公开的那些；所有内容通过引用的方式并入本 文。和微生物拮抗剂的联合使用公开于Schisler的美国专利，并且待审申请是优选的，特像IIus sp. (NRRL B-30210), Bacillus sp. (NRRL B-30211), Torula aurea (近年来又称为atfreiAs) (NRRL Y-30213),未鉴定的酵母菌(NRRL Y-30214),Bacillus sp. (NRRL B-30212)和 Torula sp.(近年来又称为 Cryptococcus aureus)(NRRL Y-30215)。这些额外的拮抗剂可以联合本发明的拮抗剂来施加，例如以混合物的形式，或者它们可以单独或在不同时间来施加。本发明的丙硫菌唑耐受性变体可以通过任何常规方法施加至谷类头部的表面。例如，它们可以作为水性喷雾、可湿润的粉末或粉尘来施加。设计用于这些施加方法的制剂通常将包括联合其他助剂的合适的液体或固体载体，例如润湿剂、增稠剂等。淀粉、多糖、海藻酸钠、纤维素等通常在这些制剂中用作载体和增稠剂。本文中涉及拮抗剂处理的量而使用的措词〃有效量〃和〃抑制量〃是在本文中所述的合适的处理条件下相对于未处理的对照中发生的情况，获得疾病水平的下降所必需的量。液体制剂的实际施加速率将通常从最小约I X IO3至约I X IOltl活细胞/ml变化，优选从约I X IO6至约5 X IO9活细胞/ml变化。在大部分情况下，在下面实施例中描述的本发明的菌株在约I X IO6至I X IO9活细胞/ml的施加速率下将是最佳有效的，假定施加模式将实现基本上均匀地接触至少约50%的小麦头部。如果拮抗剂作为固体制剂来施加，施加速率应该被控制以导致相当数量的活细胞/单位面积的谷类头部表面，这通过上述液体处理的速率来获得。设想拮抗剂有效时的温度为约5°C至约35°C。优选温度为15_30°C，并且最佳范围被认为是18_28°C。所述拮抗剂可以理论上在谷类发育的孕穗期之后和硬黄熟期之前的任何时间施加至种子头部。谷类头部仅仅在谷类发育开始开花(开花期)到蜡熟期之间易受到禾谷镰孢菌的感染。因此，施加生物防治剂的最佳时间将是开花之前即刻至谷类发育的蜡熟初期的这样晚。在开花之前将拮抗剂施加至头部将在小麦头部变得易受感染之前，使拮抗剂具有集落的小麦头部部分。另外，当它们从小花中浮现时，拮抗剂将良好地定位以集落和保护花粉囊。然而，可以预期的是，如果在开花开始之后但在发育的硬黄熟期之前进行施加，拮抗剂仍旧是有效的。然而，期望较长的延迟可以降低处理的效果，这取决于细胞配制和施加的方法。下列实施例仅仅旨在进一步描述本发明，并且不旨在限制由所附权利要求所限定的本发明的范围。实施例I
为了产生赤霉病拮抗剂浅黄隐球酵母OH 182.9 (NRRL Y-30216)的丙硫菌唑耐受性变体，将菌株的纯培养物加入到来自在_80°C下储存的菌株的10%甘油储液的1/5强度胰蛋白酶大豆肉汤琼脂(TSBA)上。在25°C下生长24小时后，将细胞转移至50 ml厄伦美厄烧瓶中的10 ml的含有I ppm的杀菌剂丙硫菌唑(PTC)的1/5强度胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中，以获得约O. 100的初始光学密度(A620)。将烧瓶以250 rpm的频率振摇，并且在25°C 下在1/5 TSBA + I ppm PTC上孵育5天之后接种到板上。在25°C下孵育数天之后，在1/5TSBA + I ppm PTC培养基上产生含有数个菌落的板，所述菌落比大部分菌落获得更大的尺寸。选择这些菌落中的四个，并且在1/5 TSBA + I ppm PTC上加条纹以用于纯化。然后使这4个推定PTC耐性变体的液体培养物生长过程重复4-5次，其中液体和固体培养基中的PTC的浓度逐渐地增加至最终浓度5 ppm,并且由4种分离变体品系中的每个产生的最大菌落被选择以开始在含有稍微更高浓度的PTC的液体培养物中的下个生长周期。然后基于如下所述在温室试验中降低小麦赤霉病的效果，来评价4种变体品系中的每个和OH 182. 9的野生型祖先菌株的等同性。在以温室批次进行植物生物测定之前，使硬红春麦(栽培品种规范)在植物生长室中生长。使祖先菌株OH 182. 9和PTCT变体1C，3C, 4C与5C的生物质在含有25 ml的液体培养基的无挡板-125 ml厄伦美厄烧瓶中产生(SDCL, Slininger 攀 2003. Postharvest biological control of potato sprouting byFusarium dry rot suppressive bacteria-由根腐病抑制细菌引起的马铃薯发芽的收割期后的生物防治· Biocontrol Science and Technology-生物科学与技术· 13:477-494)，其以250 rpm的频率，2.5 cm的轨道旋转和在25°C下孵育72 h，并且在使用之前使用dH20稀释至％强度。使FHB病原体五求#霉菌株Z-3639的分生孢子接种体在澄清V8肉汁琼脂上在12 h/天荧光下在24°C制备7天。在小麦开花期，每次处理OH 182. 9的细胞在约14个小麦头部上变得模糊，之后立即雾状施加分生孢子混悬液(3 X IO4分生孢子/ml)。使用水、接着使用分生孢子混悬液处理的头部起到“仅病原体”对照的作用。将植物置于湿度帐篷中3天，在16天之后进行评分，并且在不含PTC的1/5 TSB中进行较长生长速率。疾病严重性通过下列方式来测定计算单个小麦头部的表面积的平均百分率，所述小麦头部表现出受到禾谷镰孢菌感染的症状。变体品系还比较于当在1/5 TSB + 5 ppm PTC培养基中生长时获得的总菌落形成单位/ ml (cfu/ml)。OH 182. 9的祖先菌株不在该培养基中生长，同时产生的OH 182. 9的所有PTC耐性变体超过5 x IO7 CFU/ml。相比于OH 182. 9母株，浅黄隐球酵母OH 182.9 3C和4C的丙硫菌唑耐受性变体表现出显著更强的效果并且保持。结果示于表1-3中。应理解，前面详细描述仅仅通过示意的方式来进行，并且在不偏离本发明的精神和范围的条件下可以进行修改和改变。表I.酵母拮抗剂OH 182.9，OH 182. 9的丙硫菌唑耐受性变体4C，丙硫菌唑及
其组合在温室试验a’b中对于赤霉病的影响
权利要求
1.一种微生物，包含选自浅黄隐球酵母3C (NRRL Y-50378)和浅黄隐球酵母4C (NRRLY-50379)的耐受丙硫菌唑的浅黄隐球酵母株。
2.如权利要求I所述的微生物,所述的微生物基本上是生物纯的。
3.如权利要求I所述的微生物，其特征在于，所述株是所述浅黄隐球酵母3C(NRRLY-50378)。
4.如权利要求I所述的微生物，其特征在于，所述株是所述浅黄隐球酵母4C(NRRLY-50379)。
5.一种用于抑制谷类植物中的赤霉病的方法，包括向所述植物的头部施加至少一种微生物拮抗剂，所述微生物拮抗剂选自浅黄隐球酵母株3C (NRRL Y-50378)和浅黄隐球酵母株4C (NRRL Y-50379)及其组合，以相对于未处理的对照能够有效地降低赤霉病水平的量来施加所述微生物拮抗剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微生物拮抗剂基本上是生物纯的。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微生物拮抗剂是所述浅黄隐球酵母3C(NRRL Y-50378)。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微生物拮抗剂是所述浅黄隐球酵母4C(NRRL Y-50379)。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微生物拮抗剂在发育的硬黄熟期之前施加至所述头部。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微生物拮抗剂在开花期间施加至所述头部。
11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微生物拮抗剂在开花之前施加至所述头部。
12.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述谷类是小麦或大麦。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述谷类是小麦。
14.一种用于抑制谷类植物中的赤霉病的组合物，包含在农业上可接受的载体中的选自下列的微生物拮抗剂浅黄隐球酵母株3C (NRRL Y-50378)、和浅黄隐球酵母株4C(NRRLY-50379)、及其组合。
15.如权利要求14所述的组合物，所述的组合物基本上是生物纯的。
16.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述微生物拮抗剂是所述浅黄隐球酵母 3C (NRRL Y-50378)。
17.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述微生物拮抗剂是所述浅黄隐球酵母 4C (NRRL Y-50379)。
全文摘要
描述了用于抑制和防治谷类中、特别是小麦和大麦中的FHB的浅黄隐球酵母株，所述的浅黄隐球酵母株是禾谷镰孢菌的优异拮抗剂。所述菌株是之前描述的浅黄隐球酵母OH182.9(NRRLY-30216)的丙硫菌唑耐受性变体。而且，相比于母株OH182.9，这些丙硫菌唑耐受性变体针对禾谷镰孢菌表现出明显增强的效果。
文档编号C12N1/20GK102812120SQ201080043355
公开日2012年12月5日 申请日期2010年6月25日 优先权日2009年7月29日
发明者大卫·A·席斯勒, 迈克尔·J·波姆 申请人:美利坚合众国，由农业部长代表, 俄亥俄州立大学研究基金会