专利名称：从高细胞密度培养物纯化腺病毒的方法
技术领域：
本发明涉及病毒制备领域。更具体地，本发明涉及从细胞悬液纯化腺病毒颗粒的改进方法。
背景技术：
疫苗制备领域近来的进展产生了对大规模生产的需求。亟需稳健和高效的方法来为全世界提供足量的(重组)疫苗以对抗传染病。针对传染病的疫苗可以基于重组腺病毒颗粒。为此进行了大量的努力以优化基于细胞的腺病毒制备方法。将细胞以渐增密度培养，随后感染以获得更高的总病毒收率。 这样的高细胞密度方法公开于例如Crucell Holland BV的WO 2010/060719和Yuk et al. 0004)。其中描述了制备高浓度重组腺病毒的方法。这种优化方法依赖于这样的能力， 即以高细胞密度(例如，高于切106细胞/ml)感染培养物并保留高的每细胞病毒产率。这提供一种在单生物反应器中获得高病毒浓度的收获病毒溶液的方法。所述方法通常的病毒颗粒(VP)收率为约 1. 5-2. 5xl012VP/mL。以高密度培养细胞的方法易于积累大量的细胞碎片和宿主细胞DNA。在纯化过程中必须进一步除去这些污染物，而这是繁琐的操作。US7326555最近公开一种从收获的细胞培养物除去宿主细胞DNA的方法。所述方法由选择性地从细胞培养物沉淀宿主细胞DNA组成。选择性沉淀剂可以特异性地结合宿主细胞DNA，并且不沉淀腺病毒颗粒。然而，该文献中的方法仅对低细胞密度细胞培养物进行描述，其中细胞碎片和宿主细胞DNA存在的量不尚ο目前尚未知所述方法可以应用于包含高细胞密度的培养物。相比之下，从现有技术可以推知的强烈建议是，当以高浓度使用时用于所述方法的沉淀剂不会选择性地从培养物沉淀宿主细胞DNA，并且会沉淀病毒颗粒(Goerke et al. 2004)。通常将包含腺病毒的细胞培养收获物进一步加工以获得纯化的腺病毒。所述纯化方法中通常包括利用例如深层过滤和/或切向流过滤(TFF)的澄清步骤。TFF的使用要求相对纯(clean)的收获物，即包含有限量的细胞碎片或其他杂质，例如宿主细胞DNA。过量的所述杂质可能阻塞过滤器。因此，通过TFF进行的澄清通常用于进一步的纯化方法，例如作为第三或第四方法步骤。收获后利用切向流过滤直接从包含腺病毒的细胞悬液分离腺病毒此前在例如 EP1371723中有描述。然而，腺病毒生长于粘附的细胞，其在收获后保留在生物反应器中。因此，进一步加工的含病毒悬液包含非常低浓度的细胞碎片和宿主细胞DNA。W02006/052302 还描述了在收获后直接使用TFF。然而，其中所用的含病毒收获物的细胞密度大大低于切106细胞/ml。如本文所公开的，收获后在澄清步骤中直接使用TFF对于包含高细胞密度的细胞培养物是不可行的。由于细胞培养方法是放大级别上升的，并且细胞以渐增的密度进行培养，所以工业中亟需允许处理高细胞密度悬液的下游方法。这特别适用于腺病毒制备领域。
发明_既述本发明涉及从细胞悬液中，特别是从高细胞密度悬液中纯化来自细胞裂解物的腺病毒颗粒的方法。如本文所示(实施例1)，用现有的方法从高细胞密度悬液纯化腺病毒的病毒回收率很低。收获后获得的高细胞密度悬液中的杂质浓度通常过高而无法实现直接的腺病毒纯化。利用已知方法进行高细胞密度悬液的下游加工通常要求多个步骤。第一过滤步骤由粗滤组成以除去大沉淀和细胞碎片。随后，需要一个或多个选择性过滤步骤以获得足够纯化的腺病毒悬液。我们令人惊讶地发现并在本文公开了，紧随制备包含腺病毒的细胞裂解物之后， 连续使用宿主细胞DNA破碎和/或沉淀，接着进行包括切向流过滤(TFF)的澄清步骤，得到了高度纯化的腺病毒悬液。令人惊讶的是，包含腺病毒、大量细胞碎片、宿主细胞DNA和其他杂质的细胞裂解物可以由本发明有效地加工成纯化的腺病毒。因此，本发明提供一种适合于在大规模腺病毒纯化过程中除去宿主细胞DNA的新方法。通过将DNA破碎或沉淀并入纯化过程，使用TFF进行澄清的，单一的澄清步骤就足以从高细胞密度悬液中纯化腺病毒。本发明提供一种从具有范围为5x106-150X106细胞/ml的细胞密度的细胞悬液中纯化腺病毒颗粒的方法，所述方法包括a)将所述细胞悬液中的细胞裂解；b)将所述细胞悬液中的宿主细胞DNA破碎和/或沉淀；以及c)通过切向流过滤对得自步骤b)的细胞悬液
进行澄清。在一些实施方案中，所述腺病毒纯化自细胞悬液，其具有的细胞密度范围为 5xl06-150xl06 细胞/ml，例如 5xl06_50xl06 细胞/ml 或 10xl06_30xl06 细胞/ml。在另一实施方案中，所述步骤b)中的沉淀是通过加入选择性沉淀剂来将宿主细胞DNA从腺病毒颗粒沉淀而进行的。在优选实施方案中，用孔径范围为0. 1-0. 65 μ m的膜来进行所述切向流过滤。在其他优选实施方案中，用中空纤维进行所述切向流过滤。在优选的实施方案中， 用ATF系统进行所述切向流过滤。
图 1 低(2. 5x106-3. 5xl06vc/ml)和高(20xl06-30xl06vc/ml 密度细胞悬液中，针对度米芬浓度作图的腺病毒回收率和沉淀的宿主细胞DNA。图 2 低(2. 5x106-3. 5xl06vc/ml)和高(18xl06_25xl06vc/ml)密度细胞悬液中，针对度米芬浓度作图的腺病毒回收率和沉淀的宿主细胞DNA。发明详述本发明涉及用于从高细胞密度悬液纯化腺病毒颗粒的方法。根据本发明，所述高细胞密度悬液通过将细胞培养至高细胞密度而获得。这样的培养可以，例如批量、加料批量或灌注模式来进行。将细胞培养至高细胞密度的方法为本领域技术人员已知。获得高细胞密度培养物的具体方法公开于，例如W02004/099396、W02005/095578、W02008/006494、 W02010/060719。
根据本发明，高细胞密度悬液包含约5χ106-150Χ106细胞/mL，例如约 8x106-120x106 细胞 /mL,如约 12xl06-100xl06 细胞 /mL,如约 20xl06-80xl06 细胞 /mL。在本发明的优选实施方案中，所述高细胞密度悬液的细胞密度范围为约 10x106-50X106细胞/mL，例如至少约15xl06细胞/mL，如至少约20xl06细胞/mL，如至少约 25xl06，如高达约30xl06细胞/mL，如高达约35xl06细胞/mL，如高达约40xl06细胞/mL，如高达约45x106细胞/mL。根据本发明，用腺病毒颗粒感染高细胞密度培养物以允许所述腺病毒在细胞悬液增殖。在本文中，在单一生物反应器中获得高细胞密度悬液，其包含高浓度的腺病毒。感染高细胞密度培养物的方法也是本领域技术人员已知的。获得高病毒浓度的高细胞密度培养物的具体方法在例如EP08168181. 9、Cortin et al. 2004和Yuk et al. 2004中有公开。 这些参考文献描述了用于制备大量重组腺病毒的方法。这些方法依赖于用每细胞高腺病毒产率的保存物感染高细胞密度的培养物的能力。本文则提供了一种在单一生物反应器中获得高腺病毒浓度的高细胞密度悬液的方法。本发明方法的典型收率，例如对于重组腺病毒 35(rAd35)为约1. 5_2. 5xl012VP/mL。根据本发明，一旦腺病毒在细胞培养物中增殖并杀死大部分细胞，则从高细胞密度悬液纯化腺病毒颗粒。本发明方法的第一步骤包括将高细胞密度悬液中所包含的细胞裂解。裂解用腺病毒颗粒感染的高细胞密度悬液导致大量细胞碎片和宿主细胞DNA积累在所述细胞悬液中。 这些积累使得细胞悬液随后的下游加工冗长繁琐。本发明提供一种适合于从高细胞密度悬液的细胞裂解物纯化腺病毒颗粒的方法。 通过向细胞裂解物加入选择性沉淀剂可以从高细胞密度悬液中的腺病毒颗粒选择性沉淀大量宿主细胞DNA，从而从包含腺病毒颗粒的高细胞密度悬液沉淀至少约80 %的宿主细胞 DNA分子。如本文所公开的，在用TFF澄清后，沉淀步骤允许沉淀污染宿主细胞DNA，至少减少80 %的宿主细胞DNA，优选90 %，并且如本文所示例的，甚至更优选减少约95 %的宿主细胞 DNA。藤所述方法的第一步骤包括将细胞悬液中的细胞裂解。其中裂解细胞膜的第一步骤允许从感染的高细胞密度悬液收获细胞相关(细胞内)和非细胞相关(细胞外)腺病毒。 裂解包含病毒的宿主细胞的优选方法宿主细胞洗涤剂裂解可以由非机械裂解方法(如酶处理)和和/或机械剪切方法(如中空纤维超滤)代替以释放最大量的腺病毒。可以用于激活细胞裂解的方法为本领域技术人员已知，并且例如讨论于WO 98/22588, p. 28-35.这一方面可用的方法例如冷冻-解冻、固体剪切、高渗和/或低渗裂解、液体剪切、超声、高压挤出、洗涤剂裂解、上述方法的组合等。在本发明的一实施方案中，利用至少一种洗涤剂将细胞裂解。使用洗涤剂裂解的优势在于其是一种容易的方法，并且容易放大。可以使用的洗涤剂及其使用方法通常为本领域技术人员已知。例如几种实例讨论于TO 98/22588,p. 29-33.本文所用的洗涤剂可以包括但不限于阴离子、阳离子、两性离子和非离子洗涤剂。洗涤剂的实例例如Triton和/或聚山梨酯-80。在一实施方案中，所用的洗涤剂为Triton X-IOO0此外，可以向裂解物或澄清的裂解物加入低浓度的诸如TNBP的溶剂以补充这些洗涤剂失活包装的病毒的能力。另外，感染的宿主细胞由其中的腺病毒的自裂解可以提供细胞内腺病毒的主要释放，并且可以用于本发明的方法。因此，本领域已知的任何形式的宿主细胞裂解可以用于向宿主细胞培养基中释放细胞内病毒以用于通过本文公开的方法进行最后收获。本领域技术人员应当了解，洗涤剂的最优浓度可以变化，例如在0. -1% (w/w)的范围内变化。破碎和诜择件沉淀裂解后，可以将宿主细胞DNA破碎并从包含病毒的细胞悬液沉淀。在一优选实施方案中，通过加入选择性沉淀剂(SPA)溶液来沉淀宿主细胞DNA。这一步骤允许选择性沉淀宿主细胞DNA，同时将未改性的病毒颗粒留在液相中。如本文所示例的，这一早期沉淀步骤在澄清后导致至少约90 %的宿主细胞DNA减少。可以用于实施本发明的SPA包括但不限于胺共聚物、季铵化合物及其任何各自的混合物。更具体地，许多形式的聚乙烯(PEI)非常有效地中和过量的阴离子电荷(DNA 杂质)。可以合适地用于本发明的一系列可能的SPA列于(12栏，56-67行和13栏，1-28 行)，其援引加入本文。适合用于本发明的SPA包括但不限于以下可商购产品的类型和实例单烷基三甲基铵盐(可商购产品的实例包括十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵，CTAB ；四癸基三甲基溴化铵或四癸基三甲基氯化铵(TTA)；烷基三甲基氯化铵； 烷基芳基三甲基氯化铵；十二烷基三甲基溴化铵或十二烷基三甲基氯化铵；十二烷基二甲基-2-苯氧基乙基溴化铵；十六烷基胺盐酸盐或氢溴酸盐；十二烷基胺或盐酸盐；以及十六烷基二甲基乙基溴化铵或十六烷基二甲基乙基氯化铵)；单烷基二甲基苄基铵盐(实例包括烷基二甲基苄基氯化铵和苄索氯铵，BTC) ；二烷基二甲基铵盐(商业产品包括度米芬(DB) ；二癸基二甲基卤化铵和和辛基十二烷基二甲基氯化铵或辛基十二烷基二甲基溴化铵)；杂芳香铵盐(商业产品包括十六烷基卤化吡啶鐺(CPC或氢溴酸盐和十六烷基溴化吡啶鐺或十六烷基氯化吡啶鐺)；顺式异构体1-[3_氯烯丙基]_3，5，7-三氮杂-1-氮鐺金刚烷；烷基-溴化异喹啉鐺；以及烷基二甲基萘基-甲基氯化铵(BTC 1110)。多取代的季铵盐(可商购的产品包括但不限于烷基二甲基苄基糖精铵和烷基二甲基乙基苄基环己基氨基磺酸铵)；双季铵盐(产品实例包括1，10-双O-甲基-4-氨基氯化喹啉鐺)_癸烷； 1，6_双{1-甲基-3-(2，2，6-三甲基环己基)-丙基二甲基氯化铵]己烷或曲比氯铵以及 Buckman Brochures的称为CDQ的bis-quat)；禾口聚合季按盐(包括polyionene，如聚[氧化乙烯(二甲基亚氨基)亚乙基(二甲基亚氨基)亚乙基二氯化物]；聚[N-3-二甲基铵基)丙基]N-[3_亚乙基氧化乙烯二甲基铵基)丙基]脲二氯化物；和α-4_[1-三O-羟基乙基)氯化铵)。本领域技术人员从US73^555应当理解，其中这些化合物中的几种据证实发挥作用，并且其中据证实本领域技术人员可以常规地发现这些化学选择性沉淀DNA的合适浓度，这些为SPA的实例，并且基于其公开和本发明的公开，这些化合物显然也适合于本发明。在一优选实施方案中，阳离子洗涤剂用于本发明。在甚至更优选的实施方案中，二烷基二甲基铵盐如度米芬(DB)用于本发明。尽管大量潜在的SPA可以用于实施本发明，但是度米芬主要由于其作为GMP等级原料的可用性以及目前用在目的是人用途的其他产品而引起特别关注。更特别地，由于度米芬广泛用作口服卫生产品以及局部抗生素乳膏的活性成分，所以这种分子在cGMP条件下大量生产并分配。本文测定在高细胞密度悬液中用于从细胞悬液沉淀宿主细胞DNA的最优SPA浓度。尽管基于现有技术预期，当腺病毒颗粒与高浓度SPA接触时会立即沉淀，但是意料之外的是腺病毒颗粒仍保持未沉淀。确实，例如在US73^555中，据现有技术证实，在低细胞密度悬液(高达IxlO6细胞/ml)中，腺病毒颗粒当阳离子洗涤剂浓度增加时发生沉淀。如本文所公开的，通过裂解高细胞密度培养物而制备的悬液会包含大量增加量的宿主细胞DNA和其他杂质，并因此需要增加量的阳离子洗涤剂(例如，增加2倍)。因此基于低细胞密度结果的外推，预期阳离子洗涤剂浓度的这种增加会导致悬液中存在的腺病毒颗粒的整体的沉淀。然而，令人惊讶地，在高SPA浓度下，从包含病毒颗粒的高细胞密度悬液选择性除去污染宿主细胞DNA仍然是可以的。在本发明的一优选实施方案中，加入的SPA(优选 DB)的浓度为1.2-5mM。在一甚至更优选的实施方案中，加入的SPA(优选DB)的浓度为 1. 3-2. 2mM，如1. 4_2mM，如1. 4-1. 8mM，如1. 5-1. 6mM。基于本发明的公开，本领域技术人员应当清楚对于给定的收获时的细胞密度，如何确定合适的SPA浓度窗。用于处理包含腺病毒的高细胞密度悬液(包含的细胞密度为10χ106-150χ106细胞 /mL)的DB的合适浓度为约1. 2mM-5mM。用于处理包含腺病毒的高细胞密度悬液(包含的细胞密度为10χ106-50χ106细胞/mL)的DB的合适浓度为约1. 3mM_2. 2mM。用于处理包含腺病毒的高细胞密度悬液收获物(包含的细胞密度为10χ106-30χ106细胞/mL)为约1. 3_2mM， 如约 1. 4-1. 9mM,如约 1. 4-1. 8mM,如约 1. 4-1. 7mM,如约 1. 45-1. 65mM,如约 1. 5-1. 55mM。如本文对度米芬(DB)所示例的，本领域技术人员应当了解如何测试本文公开的 SPA的潜在代替物以鉴定有效地从腺病毒颗粒沉淀核酸分子和其他细胞碎片的化合物。因此，本发明部分地涉及从高细胞密度悬液纯化腺病毒颗粒的方法。所述方法包括通过向裂解后宿主细胞培养基中加入选择性沉淀剂来选择性地从裂解后的高细胞密度悬液沉淀宿主细胞核酸分子。尽管从细胞悬液除去宿主细胞DNA的优选方法为选择性沉淀，但是本发明并不局限于此。除去宿主细胞DNA的任何其他方法也包括在本发明中。因此，在一实施方案中，将宿主细胞DNA破碎，即切成碎片。根据本发明，裂解后的宿主细胞DNA破碎可以通过向细胞悬液加入核酸酶来进行。适合用于本发明的示例性核酸酶包括Benzonase 、Pulmozyme 或者本领域中常用的任何其他DNase和/或RNase。 在本发明的优选实施方案中，核酸酶为Benzonase ，其通过水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键而水解核酸，从而降低细胞裂解物的粘性。Benzonase 可以商购获得，例如购自 Merck KGaA (编号 W214950)。充分破碎所需的核酸酶的浓度取决于，例如宿主细胞密度、反应的温度和时间。本领域技术人员了解如何确定和优化成功地破碎宿主细胞DNA所选的核酸酶浓度。膽然后将获得自之前步骤的SPA处理的细胞裂解物澄清以除去沉淀的宿主细胞 DNA、细胞碎片和其他杂质。如本文所示例的(实施例1)，用一步澄清方法直接从高细胞密度悬液纯化腺病毒的尝试导致低病毒回收率。收获后所获得的高细胞密度悬液中的杂质浓度通常过高而不允许直接病毒纯化。通常，如本领域通常使用和推荐以及如本文所示例的，合适的澄清需要至少两个连续滤器的组合。我们令人惊讶地发现并在本文公开，通过利用TFF的澄清步骤合并DNA沉淀允许以高回收率从高细胞密度悬液纯化病毒。单切向流过滤步骤足以从含病毒悬液除去细胞碎片和核酸沉淀物。沉淀超过95%的宿主细胞DNA，并且病毒回收率高于80%。因此，根据本发明可以使用TFF作为单澄清步骤。与本发明方法的原始裂解物(步骤a中获得)相比， 用本发明方法获得的澄清的含病毒悬液大量减少了宿主细胞DNA和其他杂质。根据本发明，TFF设定中所用的滤器为例如来自GE Healthcare或JMs印arations 的中空纤维滤器；其他替代选择为来自Millipore或Sartorius stedim biotech的平面筛 (flat screen)滤器。在所述TFF设定中，在渗透物中收集病毒颗粒，而细胞碎片、沉淀的宿主细胞DNA和其他杂质则保留在渗余物中。本文中证实，中空纤维滤器非常适合于加工高细胞密度悬液。因此，在本发明的一优选实施方案中，用中空纤维滤器进行TFF。根据本发明，所述滤器的孔径优选为0. 1-1 μ m。在本发明的一优选实施方案中，孔径为0. 2-0. 65 μ m。所述孔径允许病毒颗粒通过膜，并使得细胞碎片、沉淀的宿主细胞DNA 和其他杂质被滤器保留。优选按照生产商的说明将滤器模块用水预湿润。利用管道和蠕动泵使液体通过模块再循环。在本发明的某些实施方案中，TFF以交替切向过滤(ATF)的形式使用。ATF是切向流过滤的一种形式，并且本文发现利用ATF的澄清特别适合于从包含高浓度细胞碎片、宿主细胞DNA和其他杂质的悬液回收病毒。切向流可以通过本领域技术人员已知并例如描述于 US 6，544，424 的方法实现。使用 ATF 系统(如 ATF System, Refine Technology, Co.， East Hanover, NJ)的优势在于供料和渗余物流随每次ATF泵循环(循环由加压和排气模式组成)而改变方向。这产生反相流清扫和跨过膜的连续改变的跨膜压力(TMP)。在排气中产生真空，其中一些材料从渗透物侧回流至渗余物侧，导致膜的清理。使用ATF会导致膜较少的污垢，从导致较高的病毒回收率。本领域技术人员可以确定最大收率的最优ATF和渗透物流速。根据本发明，所述ATF系统中使用的滤器为例如来自GE healthcare的中空纤维
1 ' O使用ATF系统的另一优势在于用于澄清的设定可以更早地用于灌注模式培养细胞。连接至ATF系统的生物反应器确实可以首先(in the first place)用于将细胞培养至高细胞密度。使用ATF灌注系统可以获得超过ΙΟΟχΙΟ6活细胞/mL的极高细胞密度，例如通过使用PER. C6细胞(参见，例如Yallop et al，2005and WO 2005/095578)。一旦细胞达到高细胞密度，它们可以进行感染以获得高度浓缩的含病毒细胞悬液。在整个过程汇中保持连接至生物反应器的ATF系统随后可以用于从所述高细胞密度悬液纯化病毒。选择性沉淀与通过TFF的澄清的组合除去至少70%、优选至少80%并且甚至更优选至少90%的收获后获得的高细胞密度裂解物中所含的宿主细胞DNA。进一步纯化的方法在某些实施方案中，将收获的病毒颗粒进一步纯化。如WO 2005080556所述(其援引加入本文)，病毒的进一步纯化可以在几个步骤中进行，包括浓缩、超滤、渗滤或用色谱进行分离。也可以使用其他步骤，例如阴离子交换色谱、灭菌过滤、反相吸附、羟基磷灰石色谱。这些步骤例如公开于US73^5555，其援引加入本文。本领域技术人员了解如何发现每个纯化步骤的最优条件。此外，WO 98/22588描述了制备和纯化病毒颗粒的方法，其援引加入本文。
在本发明的某些实施方案中，澄清的腺病毒颗粒悬液可以通过超滤进行处理。超滤用于浓缩病毒悬液。悬液可以浓缩5-20倍，并可以用核酸酶进行处理(如上文所述)。 本发明的另一方面是随后通过渗滤引入离子交换缓冲液。利用超滤器的渗滤或缓冲液交换是一种除去和交换盐、糖等的方式。本领域技术人员了解缓冲液交换发生的条件以及何种缓冲液适合于这一步骤。所选的特定超滤膜会的大小足够小以保留腺病毒颗粒，但是足够大以有效地清除杂质。取决于生产商和膜类型，IO-IOOOkDa的表观分子量截止是合适的。 利用切向流模式的超滤是优选的。在所述模式中，所述步骤可以通过设定具有或不具有渗余物返回上的背压的固定错流(cross-flow)、设定固定的跨膜压力或者固定错流和渗透物通量来控制。根据本发明，随后步骤可以使阴离子交换色谱。在所述步骤中，腺病毒颗粒结合至带正电荷的材料，如膜、筒或柱。随后的洗脱允许从杂质和剩余的宿主细胞DNA分离病毒颗粒。对于用Mustang Q膜吸附剂纯化腺病毒，用于进样和洗涤的NaCl浓度在pH 7. 5下任何时候大概可以为0. 3-0. 4M，并且在pH交替时可以变化。更优选的NaCl浓度为0. 35M。 缓冲液的PH需要足够高以使得腺病毒结合(大于约6. 5)。此外，缓冲体系的pH也应当足够低以避免病毒不稳定。可用的精确最大PH取决于腺病毒特定的稳定性谱和缓冲液组分， 并且可以由本领域技术人员对于特定应用而容易地确定。作为指导，当然并非限制，PH可以潜在地为约5-10。缓冲液中存在0. 1 % PS-80对于实现产物中的低残留DNA水平是高度优选的，因为这减弱腺病毒/DNA结合和腺病毒聚集。确定可以用于促进腺病毒颗粒与其他腺病毒以及各种细胞污染物解离的较高或较低洗涤剂浓度或替代性洗涤剂在本领域技术人员的常规实验范围内。为方法的缓冲剂选择替代性洗涤剂也在本领域技术人员的常规实验范围内。这样的替代性洗涤剂的实例可见US 7326555.阴离子交换膜色谱产物，如I^ll (如 Mustang series)和Sartorius (如Sartobind系列)生产的那些适合于根据本发明来纯化病毒。美国专利6，485，958或WO 05/080556描述了使用阴离子交换色谱来纯化重组腺病毒。病毒对膜吸附剂如Mustang Q (Pall Corporation)的结合能力非常高，在 7xl013VP/ml数量级。适合于这种方法的腺病毒纯化的其他膜吸附剂包括但不限于Source 15Q 禾口 Source 30Q(GE life sciences)、Q-Sepharose XL(GE life sciences)、Fractogel TMAE (EM industries)、Sartobind Q (Sartorius)、Adsept Q (Natrix separations)、CIM QA(BIA separations) 0优选利用包含NaCl的缓冲液来进行腺病毒洗脱。本领域技术人员了解如何优化NaCl浓度。在某些实施方案中，优选使用至少一个阴离子交换色谱步骤。阴离子交换色谱步骤后，腺病毒可以足够纯。然而，在某些实施方案中，进一步进行尺寸排阻色谱步骤以增加方法的稳健性。这一步骤可以在阴离子交换色谱步骤之前或之后。显然，其他纯化步骤也可以合适地与阴离子交换色谱步骤组合。使用阴离子交换色谱进行腺病毒纯化已经得到广泛描述，因此这一方面也在本领域技术人员的能力范围内。许多不同的色谱基质可以用于纯化腺病毒，并且是合适的，本领域技术人员可以容易地发现纯化腺病毒的最优阴离子交换材料。
在本发明的任何具体实施方案中，可以将阴离子交换产品渗滤入配置缓冲液中， 并灭菌过滤。或者，可以在渗滤之前或之后加入额外的色谱步骤(如阳离子交换)以潜在地改进杂质和/或病毒/朊病毒清除的稳健性。在这一阶段还可以进行额外的超滤步骤。切向流超滤用于除去残留的蛋白和核酸以及将腺病毒交换入配置缓冲液。收率与改进的杂质清除之间的折衷使得选择 300kDa-500kDa的膜。其他膜配置(如中空纤维)是可接受的替代。所选的超滤膜的大小足够小以保留腺病毒颗粒，但是足够大以有效地清除杂质。 取决于生产商和膜类型，IOO-IOOOkDa的表观分子量截止可以使合适的。所述方法可以包括灭菌过滤步骤，这有助于消除生物负荷。产物可以通过0. 22微米的改性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(如Millipore，Millipak)进行过滤。所述方法中可以加入任选的下游加工步骤。这些步骤可以包括，例如尺寸排阻色谱步骤、反相吸附步骤和/或羟基磷灰石色谱步骤。这些步骤的每一个的更多细节可以参见，例如 US 7326555, WO 03/097797、W002/44348。国际申请WO 97/08298描述了利用某些色谱基质纯化腺病毒以防止对病毒的损伤，包括阴离子交换和大小排阻步骤。如WO 2006/108707所公开的，某些超滤方法也非常适合于纯化腺病毒。这样的步骤可以除了某些色谱纯化步骤之外或者代替某些色谱纯化步骤进行。细胞培养系统的放大和下游加工系统本发明的方法可以放大。本发明所用的细胞培养物从小规模培养物(如1-10升运行)至中等规模培养物(如20-1000L运行)，高达大规模商业制备物，如1000-50000L生产运行。初始方法步骤(裂解、深层过滤和超滤)随培养体积而放大，而阴离子交换色谱和后续步骤则随腺病毒颗粒输入而放大。因此，后期步骤的大小基于至少IxlO12腺病毒颗粒 /mL(vp/mL)的生物反应器的产率估计。这些高腺病毒收率可以例如通过感染高细胞密度培养物而获得(例如EP08168181.9所述)。这些含高浓度腺病毒颗粒的高密度细胞悬液的进一步纯化可以利用本发明进行。加工包含大量细胞碎片和宿主细胞DNA的这些悬液的可能性允许纯化每体积悬液的大量腺病毒颗粒。本发明的优点在于提供一种加工包含高浓度腺病毒颗粒的高细胞密度细胞培养物批次的方法，从而允许每加工体积的非常高的病毒收率。尽管应用于大规模细胞培养物的本发明方法允许较小规模培养细胞，但是也应用于较高细胞密度，并达到高腺病毒收率，其可以有效地进一步加工。所述方法提供加工高度浓缩的腺病毒批次的可能性，这对整个腺病毒纯化工业会产生极大影响。腺病毒和生产细胞本发明涉及腺病毒的纯化。本发明的腺病毒可以使任何野生型、修饰的、突变的腺病毒和/或重组腺病毒载体。基因疫苗和/或基因治疗应用中引起特别关注的是使用第一或第二代复制缺陷型腺病毒，带有El或其他缺失，包括“空壳(gutless)”腺病毒载体。腺病毒基因组通常与人的良性病理有关。基因组可进行操作，这取决于构建各自载体所用的策略。复制缺陷病毒如重组腺病毒35(rAd3Q或沈(^(126)载体(如本文示例)要求弥补 (complement)所述缺失的生产细胞系。生产细胞(有时在本领域和本文中称为“包装细胞”或“补充细胞”或“宿主细胞”) 可以使任何生产细胞，其中可以增殖期望的腺病毒。例如，在互补腺病毒缺陷的生产细胞中进行重组腺病毒载体的增殖。这样的生产细胞优选在其基因组中具有至少腺病毒El序列， 由此能够互补重组腺病毒El区中的缺失。另外，腺病毒可以在E3区中具有缺失，其对于Ad 基因组并非必需的，因此，这样的缺失不必被互补。可以使用任何El互补型生产细胞，例如通过El永生化的人视网膜细胞，如911或PER. C6细胞(参见美国专利5，994，128) ；El-转化的羊水细胞(参见欧洲专利1230354) ；El-转化的A549细胞(参见，例如WO 98/39411、 美国专利 5，891，690) ；GH329 =HeLa (Gao et al，2000，Human Gene Therapy 11 :213-219)， 293等。在某些实施方案中，所述生产细胞为例如HEK293细胞、或PER. C6细胞、或911细胞、IT293SF细胞等。优选将PER. C6细胞(ECACC，保藏号9602^40，1996年2月四日保藏于 ECACC，CAMR, Porton Down, Salisbury SP4 OJG, United Kingdom ；参见美国专利 5，994，128)或由其衍生的细胞用作生产细胞。复制缺陷腺病毒载体可以利用作为载体DNA来源的腺病毒或嵌合腺病毒的任何物种、菌株、亚型或者物种、菌株、亚型的混合物产生(参见for instance WO 96/26281,WO 00/030 )，其例如可以提供能够感染某些期望细胞类型的腺病毒载体。在本发明的一优选实施方案中，rAd35或rAc^6用作腺病毒。本领域技术人员应当了解利用例如公开于美国专利6，492，169或W003/104467及其中的参考文献所公开的方法来在特定宿主细胞上增殖不同血清型的腺病毒载体的可能性。如本领域技术人员已知的，例如，对于El-缺陷的rAd35的增殖，可以构建表达Ad35的 Ε1Β-5^(的特定生产细胞，例如基于表达Ad5的ElA和ElB的现有生产细胞，例如PER. C6或 HEK293细胞(参见，例如US 6，492，169)。或者且优选地，例如WO 03/104467充分公开的 (其援引加入本文)，通过将Ad5的E4-orf6编码序列引入rAd35或rAc^6载体，可以使用现有的(Ad5_)互补细胞系(例如PER. C6或HEK293)无需细胞的修饰而用于El-缺陷的 rAd35或rAd26的增殖。因此，任何血清型的腺病毒载体的增殖可以利用本领域技术人员公知的手段和方法在生产细胞上进行。腺病毒载体、其构建方法及其增殖方法为本领域公知，并描述于例如 U. S. Pat. Nos. 5，559，099，5，837，511，5，846，782，5，851，806，5，994，106， 5, 994, 128,5, 965, 541,5, 981, 225,6, 040, 174,6, 020, 191,和 6,113,913 以及 Thomas Shenk, “ Adenoviridae and their Replication" , Μ. S. Horwitz, " Adenoviruses“, Chapters 67 and 68, respectively, in Virology, B. N. Fields et al. , eds. , 3d ed., Raven Press, Ltd. , New York(1996)，及其中所描述的其他参考文献。在以下实施例中进一步解释本发明。这些实施例并不以任何方式限制本发明而仅用于示例本发明。
实施例实施例1 直接TFF澄清对于高细胞密度收获物不起作用使PER. C6细胞于37°C下生长于生物反应器中，并用Ad35在无血清培养基中感染 3天。在20-30xl06细胞/ml的细胞密度和1_1. 5xl012VP/ml的病毒滴度时收获细胞。病毒在加入非离子洗涤剂Triton X-100和Tween_80至终浓度各自为0. 和0.05%时从细胞释放。裂解时间为2-Mhr。裂解后，通过切向流过滤(TFF)澄清含病毒收获物。禾Ij用 0. 2 μ m (GE Healthcare, CFP-2-E-4MA Μ, 0.042m2)或 a 0. 65 μ m(GEHealthcare, CFP-6-D-4MA型，0. 046m2)中空纤维滤器进行澄清。将1升裂解的收获物浓缩至少3倍。澄清后，利用3倍的渗余物体积，在放气(bleed)和进料操作中进行冲洗。过滤实验以15-40LMH的渗透物通量进行。在下表中测定澄清步骤的病毒回收率。表 1
实验
#
方法参数性能参数
孔径细胞密病毒滴度沉淀 的HC-DNA病毒回病毒回收整体病毒 (μιη)度 (xlO11 HC-DNA(%) (ng/lxlO11 收率 ppt 滤澄清(％)回收率(％) (xlO6 细 VP/ml)vp)(%)
胞/ml)
10.2 29.2 11.4 未进行未进行未进行 OO
20.65 20.1 15未进行未进行未进行 OO澄清后无病毒回收。这有些出人意料，因为EP1371723和W02006/052302描述了
将TFF成功地用于腺病毒收获物的澄清。显然，该方法的高细胞密度妨碍这一步骤，并使得 TFF不适合于直接澄清。实施例2 高细胞密度悬液中的选择性宿主细胞DNA沉淀现有技术(Goerkeet al (2005),US7326555)证实了对于高达 IxlO6细胞/ml 的细胞密度的选择性宿主细胞DNA沉淀。其中证实，(在低细胞密度下)，至少80%的宿主细胞 DNA从细胞悬液沉淀，并且病毒颗粒的回收率为90%。然而，目前完全不了解这样的选择性沉淀在高细胞密度下是否可行，因为这样的细胞悬液会包含高得多的量的宿主细胞DNA和细胞碎片，因此预期需要高得多的量的DNA沉淀剂，而从现有技术外推的数据建议这样更高浓度的DNA沉淀剂也会沉淀腺病毒。为了研究高细胞密度下DNA沉淀的可能性，在包含高达30xl06细胞/ml的细胞密度的小规模试管中测试宿主细胞DNA沉淀。小规模试管模型用作快速筛选以测试选择性 DNA沉淀在高细胞密度下是否仍然发生。使PER. C6细胞在生物反应器中生长，用腺病毒35 感染，并于37°C下在无血清培养基中生长3天。在2-30xl06细胞/ml的细胞密度和8χ101(ι-1. 5xl012VP/ml的病毒滴度时收获细胞。通过加入非离子洗涤剂Triton X-100和Tween-80至终浓度各自为0. 1% 和0. 05%，细胞裂解进行2- 小时(hr)。向3. 5ml裂解的收获物中加入40mM NaCl中的渐增浓度的度米芬(DB)，然后立即涡旋1分钟。用0. 45μπι聚偏二氟乙烯(PVDF)注射器滤器除去沉淀的材料。分别利用HPLC-AEX和Q-PCR分析滤液的Ad35和宿主细胞DNA浓度。图1示出对度米芬浓度作图的病毒回收率和沉淀的宿主细胞DNA。三角形标示的曲线获得自细胞密度为2.5x106-3.5xl06细胞/ml的细胞培养收获物。圆形标示的曲线获得自细胞密度为20xl06-30xl06细胞/ml的细胞培养收获物。在图中高亮低和高细胞密度以及相关百分比的沉淀的宿主细胞DNA的Cf (表现出90%病毒回收率的度米芬浓度)。在20χ106-30χ106细胞/ml的细胞密度下，沉淀超过90 %的宿主细胞DNA所需的 DB浓度与低10倍的细胞密度所需的DB浓度相比增加至少2. 5倍。令人惊讶地，如在较低细胞密度获得的曲线外推所预期的，增加的DB浓度不沉淀病毒颗粒。用细胞密度为18x106-25X106细胞/ml的细胞培养收获物重复实验。图2示出对度米芬浓度作图的病毒回收率和沉淀的宿主细胞DNA。三角形标示的曲线获得自细胞密度为2. 5x106-3. 5X106细胞/ml的细胞培养收获物。圆形标示的曲线获得自细胞密度为18Χ106-2&106细胞/ml的细胞培养收获物。在图中高亮低和高细胞密度以及相关百分比的沉淀的宿主细胞DNA的Cf (表现出90%病毒回收率的度米芬浓度)。如图1和2中的图可知，对于高细胞密度悬液表现出90%病毒回收率的DB浓度 (C*)在各个实验中略有不同，这是正常偏差的一部分。然而，图一致地证实，在高细胞密度下DNA的选择性沉淀也是可以的，并且SPA (在本文中为DB)的合适浓度明显高于低细胞密度培养物，但是远低于基于外推所预期的。因此，本领域技术人员应当理解，对于选择性沉淀剂的合适浓度，存在范围而不是固定的点，并且基于本文的公开可以发现合适的范围。例如，对于处理包含约10χ106-30Χ106细胞/mL的细胞密度的含腺病毒高细胞密度悬液收获物，合适的DB浓度为约1. 3-2mM。基于这些结果，本领域技术人员现在了解，DNA沉淀可以外推至含腺病毒悬液，其包含甚至更高的细胞密度，如约40xl06细胞/mL，如约50xl06细胞/mL，如高达约IOOxIO6细胞/mL，如高达约150xl06细胞/mL;并且来自这样的高细胞密度悬液的腺病毒可以用本发明的方法进行纯化。因此，根据本发明，在从高细胞密度悬液纯化腺病毒颗粒中可以使用选择性DNA 沉淀。实施例3 较大规模的高细胞密度悬液中的选择性宿主细胞DNA沉淀以0. 5L-20L的规模测试DNA沉淀。DNA沉淀所用的DB浓度基于之前的实验结果 (图2)。使用约80%的在小规模试管模型中所测定的Cf浓度。在灌注模式中，用ATF系统进行的灌注在约2. 5xl06总细胞/mL的细胞密度接种后4天开始。灌注14天后，将细胞悬液用新鲜的无血清培养基在生物反应器中稀释至细胞密度为约13xl06细胞/mL。随后，将生物反应器用Ad35病毒感染。ATF系统在感染后5小时开始，培养基更新率为每天2容器体积。3天(感染后)后收获细胞。收获时的细胞密度 (CDAH)示于表2。收获之后，通过加入非离子洗涤剂Triton X-100和Tween-80至终浓度各自为 0. 和0. 05%将细胞裂解2-M小时。向裂解的收获物加入度米芬至终浓度为40mM NaCl 中的0. 72mM和1.52mM。将沉淀的裂解物利用不同孔径的两个连续的载样的(charged)深层过滤器澄清。两个滤器估计的孔径分别为 10- 5 ym(Millistak+CE20)and 1- 0.2ym(Cuno Zeta plus 50CP)。第一滤器用于除去大细胞碎片和杂质。所述预过滤后，第二滤器用于除去剩余的杂质和从含病毒悬液沉淀的DNA。以100 LMH(升/平方米/小时) 的恒定通量进行澄清，直至压力达到5psi。表2示出方法参数和纯化方法的结果。利用8种不同的收获物进行裂解、DNA沉淀(DNA ptt)和澄清，这些收获物在体积、收获时的细胞密度和病毒滴度上不同。收获物取自2L或IOL生物反应器。测定了沉淀步骤的沉淀的宿主细胞DNA(HC-DNA)和病毒回收率。表 2实验方法参数结果
DNAppt澄清
# CDAH病毒滴度DB 步骤回收率(％)步骤回收率(％) HC-DNA
(xlO6 细胞/ml) (xlO11 VP/ml) (mM)减少(％)
11.362.13928699.6
22.472.240.72 918699.9
32.371.85909099.2
49.16.7699799.9
518.68.9889899.8
620.1151.52 908298.3
716.711997199.9
825.815.91049299.8结论是高细胞密度时的选择性宿主细胞DNA沉淀是可以的。确实，尽管增加DB浓度0倍)，但是病毒颗粒仍保持未沉淀(参见，回收率高于70%)，并且HC-DNA减少高于 98%。这个过程提供一种从高细胞密度培养物弃去宿主细胞DNA而不损害病毒回收率的方法。在本文中，其允许加工大体积的高细胞密度悬液，这是工业方法所亟需的。应当注意，由于实际原因，在实验4-8中将单DB浓度(1. 52mM)用于选择性DNA沉淀。所述实验表明，具有宽范围(9. 1x106-25. 8xl06vc/ml)细胞密度的含腺病毒悬液可以用 1.52mM的DB进行处理。这与上文的观点是一致的，即选择性沉淀剂的合适浓度与细胞密度之间的关系并非非常固定，而是提供变体从而一系列的沉淀剂浓度对于给定的细胞密度是合适的。用于处理包含10χ106-50Χ106细胞/mL的细胞密度的含腺病毒高细胞密度悬液的 DB的合适浓度为约1. 3mM-2. 2mM。用于处理包含10xl06_30xl06细胞/mL的细胞密度的含腺病毒高细胞密度悬液收获物的DB的合适浓度为约1. 3-2mM。应当注意，对于一些高细胞密度(实验#6和7)实验，观察到与低细胞密度收获物相比，在第二滤器观察到降低的病毒回收率和滤器能力。此外，使用两个连续的不同滤器使得方法需密集劳力且昂贵。实施例4 通过选择性宿主细胞DNA沉淀然后TFF的高细胞密度腺病毒制备物的
单步骤澄清使PER. C6细胞生长于灌注生物反应器中，用Ad35感染，并于36°C下在无血清培养基中生长3天。在20-30xl06细胞/ml的细胞密度和1_1. 5xl012 VP/ml的病毒滴度时收获细胞。加入非离子洗涤剂Triton X-100和Tween_80至终浓度各自为0. 1和0. 05%时病毒从高细胞释放。裂解时间为2-24小时。细胞裂解后，进行DNA沉淀步骤，然后进行澄清。利用40mM NaCl中的0. 063 % -0. 077 %的度米芬(DB)进行DNA沉淀。以 0. 17-1. 52m/s-1的搅拌速度进行DNA沉淀!3hr，并且DB的加入时间为池。澄清利用切向流过滤，通过0. 65 μ m(GE Healthcare, CFP-6-D-4MA型，0. 046m2)中空纤维滤器进行。将1升裂解和DNA沉淀的收获物浓缩至少3倍。澄清后，利用3倍的渗余物体积，在放气和进料操作中进行冲洗。过滤实验以15-40LMH的渗透物通量进行。裂解及随后的DNA沉淀和澄清利用3种不同的收获物进行。表3中测定选择性沉淀和澄清后的沉淀的宿主细胞DNA百分比、每IxlO11病毒颗粒的宿主细胞DNA浓度和病毒回收率。
表3
实验方法参数方法参数
# 细胞密病毒滴度沉淀的 HC-DNA 病毒回收病毒回收率整体病毒回度 (XlOllVPZml)HC-DNA (ng/lxlO11 率 ppt(%)澄清(％) 收率(％) (xlO6(%)vp)
细胞 /ml)
120.114.11008.6889987217.917.499.96.91107481.4323.515.399.923.810081.281.2与之前的实施例类似，本文出人意料地表明高细胞密度时的选择性DNA沉淀是可以的。确实，尽管增加DB浓度，但是病毒颗粒仍保持未沉淀(参见，回收率高于80%)，并且HC-DNA减少高于99 %。尽管在实施例1中未能成功，但是在此实施例中证实，当与选择性HC-DNA沉淀组合时，切向流过滤允许澄清高细胞密度悬液。使用切向流过滤代替一组两个不同深层过滤器(如之前所示例)提供在单过滤步骤中将高细胞密度悬液加工为澄清的腺病毒悬液的可能性。选择性HC-DNA沉淀与使用切向流过滤的组合允许从高细胞密度悬液收获物除去宿主细胞DNA，并且出人意料地并不损害腺病毒回收率。实际上，利用所述方法的整体腺病毒回收率甚至可以高于利用深层过滤器的经典两步澄清过滤方法。另外，与使用深层过滤器的方法相比，所述方法使得纯化过程劳动强度较低并且经济。在本文中，所述方法允许加工大体积的高细胞密度悬液，这也是工业方法所亟需的。参考文献Cortin V, Thibault J, Jacob D, Gamier A. High-Titer Adenovirus Vector Production in 293S Cell Perfusion Culture. Biotechnol. Prog. 2004.Goerke A, To B, Lee A, Sagar S, Konz K. Development of a Novel Adenovirus Purification Process Utilizing Selective Precipitation of Cellular DNA. Biotechnology and bioengineering, Vol. 91, No. 1, July 5,2005.Yuk IHY, Olsen MM, Geyer S, Forestell SP. Perfusion Cultures of Human Tumor Cells :A Scalable Production Platform for Oncolytic Adenoviral Vectors. Biotechnol. Bioengin. 86 :637-641(2004).
权利要求
1.一种从细胞悬液纯化腺病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤a)将所述细胞悬液中的细胞裂解；b)将所述细胞悬液中的宿主细胞DNA破碎和/或沉淀；c)通过切向流过滤对得自步骤b)的细胞悬液进行澄清，以获得纯化的腺病毒悬液， 所述方法的特征在于所述细胞悬液的细胞密度范围为5x106-150xl06细胞/ml。
2.如权利要求1所述的纯化腺病毒颗粒的方法，其中步骤b)中的所述沉淀是通过加入选择性沉淀剂来从所述病毒颗粒选择性地沉淀宿主细胞DNA而进行的。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述选择性沉淀剂为度米芬(DB)。
4.如权利要求3所述的方法，其中度米芬(DB)的浓度范围为1.2-5mM。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述细胞密度范围为约10xl06-30xl06细胞/ml，并且度米芬(DB)的浓度范围为1. 3-2mM。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中用孔径范围为0.1-0. 65 μ m的膜来进行所述切向流过滤。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中用中空纤维进行所述切向流过滤。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中用ATF系统进行所述切向流过滤。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在所述纯化的腺病毒悬液中至少已除去 80%的宿主细胞DNA。
全文摘要
本发明提供利用宿主细胞DNA破碎和/或沉淀，然后进行使用切向流过滤的澄清步骤从高细胞密度悬液大规模纯化腺病毒的方法。
文档编号C12N7/02GK102575233SQ201080046353
公开日2012年7月11日 申请日期2010年10月14日 优先权日2009年10月15日
发明者M·L·德沃克特, M·维斯特拉 申请人:克鲁塞尔荷兰公司