生物检测方法以及组合物的制作方法

专利名称：生物检测方法以及组合物的制作方法
技术领域：
本发明的实施方式总体上涉及使用分子倒置探针技术(molecular inversion probe technology)与数据库技术结合用于检测生物材料。相关技术的描述生物检测方法(例如，病原体检测方法)在多种领域(例如，生物安全、微生物法医学(microbial forensics)、农业、医院诊断、临床诊断、公共卫生(例如检测和鉴别变应原、病毒、真菌和新发疾病(emerging diseases)，以及食品安全中的菌株分型)等方面是至关重要的。现有生物检测技术包括基于DNA的检测方法(例如，实时PCR、微阵列杂交)，基于配体的方法(例如，肽、抗体、单链可变片段、适体以及碳水化合物)，基于光谱学的传感器方法(例如，生物体理化性质的振动特征标志(vibrational signature))，以及转导方法(例如，细胞环境感测，例如嗜中性细胞中的G蛋白信号级联以及通过视紫质进行光子检测)。这些现有技术具有多种缺点。例如，它们不能检测以前未知的、突变工程化的或药物耐受性的生物体，它们需要大量的样本用来检测，并且在菌株鉴别方面它们提供了有限的分辨率，并且它们不能在病原体和无毒的邻近种类之间进行区别。因此，需要生物检测的新型方法。

发明内容
提供了用于确定样本中生物体表型的方法。这些方法包括以下步骤得到一个样本，使该样本与一种分子倒置探针(MIP)接触，其中该MIP包括与生物体中感兴趣的靶核酸序列同源性的两个区域以及两个探针扩增区域，其中使用对于该表型具有特异性的 MIP数据库来选择同源性的两个区域，使该MIP杂交到该感兴趣的核酸序列上，将该感兴趣的靶核酸序列转化成环状DNA，将该环状DNA扩增，从该扩增的DNA中释放出该MIP，对扩增的DNA进行测序，以及确定是否存在相应于该表型的DNA序列。在一些方面中，该生物体是以下中的一种或多种细菌(例如鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)、布鲁菌属(Brucella)、 禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Ε. coli)、喹诺酮耐药性大肠杆菌(Quinolone resistant Ε· coli)、立克次体(Rickettsiae)、B 族链球菌(Group B Str 印 tococci)、鼻疽伯克菌(Burkholderia mallie)、副百日咳博德特氏菌(副百日咳博德特菌，Bordetalla parapertusis) > M ft ft J^ (drug resistant P. falciparum) > ^n tl ^v fe ff ^ (M. tuberculosis)、霍舌L 弧菌(V. cholera)、炭疽芽孢杆菌(B. anthracis)、屎肠球菌 (E. faecium)、土拉热弗朗西丝菌(F. tularensis)、百日咳博德特氏菌(B. pertussis)、以及甲氧西林耐受性金黄色葡萄球菌(methicillin resistant S. aureus)中的一种或多种)，病毒(例如，HIV-1、禽流感以及登革热病毒中的一种或多种)，真菌以及原生动物。在一些方面中，该扩增步骤是通过滚环扩增(rolling circle amplification) (RCA)来实现的。在其他方面中，该测序步骤是通过多重测序来实现的。在另外的其他方面中，该MIP数据库是单核苷酸多态性(SNP)数据库、抗生素耐受性基因数据库、毒力基因数据库或它们的任意组合。在别的其他方面中，该表型是抗生素耐受性和/或毒力。本发明实施方式的优点包括经济效率和时间效率。本发明的实施方式进一步提供了一种优异的基于DNA序列的生物检测技术，提供了检测以前未知的、突变的和/或工程化的生物体的能力，提供了在病原体与无毒的“邻近(near neighbor) ”种类之间进行区别的能力，提供了检测多态性出现的能力，以及一种非常有效的、省时的多路复用(multiplex) 方法。在下面实施方式的说明和它们的附图中，以及从权利要求中，本发明一些实施方式的进一步特征和优点将变得更加完全清楚。


本专利或申请文件包含至少一幅以彩色完成的附图。当请求并且支付必要费用时，具有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开的复印件可以由专利局提供。由结合附图取得的下面的说明性实施方式的详细说明可以更全面地理解本发明上述的和其他特征以及优点，其中图1示意性地说明了分子倒置探针技术(关于综述，参见Li et al. (2009) Science 324:1210 ；Ball et al. (2009)Nat. Biotech. 27 361 ；Porreca et al. (2007)Nat. Meth. 4 931)。图2示意性地说明了多重捕获。在一单一反应中可以探测超过30，000个靶(目标)(Li et al.，同上)。图3示意性地说明了可以通过本文所描述的方法检测的重要细菌病原体。图4A-4C示意性地说明了可以通过本文所描述的方法检测的病毒病原体。(A)DNA 病毒。(B)反转录病毒。(C)其他病毒。图5示意性地说明了可以通过本文所描述的方法检测的真核病原体。图6说明了针对2009中存在的药物耐受性监测的蛋白酶和逆转录酶突变(以粗体形式说明了新突变)。
具体实施例方式本领域已知的生物检测系统不能检测和鉴别新的和/或工程化的病原菌株。通过着手解决针对传染性疾病鉴别灵敏度和宽度的重要挑战和在病原体与邻近种类之间进行区别以及鉴别出突变的或工程化的生物威胁(例如使用病原体进行生物战或恐怖活动)，本文所描述的生物检测方法部分地弥补了这些不足。本文所描述的生物检测方法和组合物可以用于广泛多样的应用中，例如血制品监测、农业、法医微生物学、流行病学、食品安全以及生物防御。本文所描述的生物检测方法和组合物使用在每个末端具有识别序列的分子倒置探针，这些序列杂交到匹配的靶DNA序列上。通过聚合酶驱动的从捕获探针的3’端延伸从而拷贝该靶标，紧接着连接到5’端上从而完成该循环来实现捕获事件。对得到的环化探针进行富集(例如，通过滚环扩增)以及测序。该多重反应紧接着测序，允许在一个单一反应中检测超过75，000个靶基因区域。在某些示例性实施方式中，用于本文所描述的生物检测方法中的分子倒置探针 (MIP)被设计成靶核酸序列(例如，已知对于已经显示对病原性菌株独特(独特性，unique) 的一种蛋白(以其野生型亦或突变体形式)进行编码的基因中感兴趣的管家基因或区域)。 这类靶核酸序列(例如基因)可以控制毒力、药物耐受性(耐药性)和/或包含在有毒病原体与“邻近”种类之间进行区别的单核苷酸多态性(SNP)。在包含类似无毒菌株的混合物中可检出这些靶核酸序列(例如管家基因)，并且对于基因转移具有耐受性。已经确定的是所实验(受试，subject)病原体的任何工程化的或突变的形式可以通过对感兴趣的基因进行测序来鉴别。本文所描述的方法和组合物在传染性疾病诊断领域中是特别有用的，包括但不限于分子诊断产物、免疫测定、培养产物等。关于监测和鉴别变应原、病毒、真菌、新发传染性疾病等，目标市场包括但不限于医院生物监测(例如，HAI以及其他传染性疾病)；医院、临床以及参考实验室诊断；公共卫生机构(例如，⑶C和DHS)；食品微生物学。病原性目标 (靶标)包括证实的和潜在的生物武器，证实的生物犯罪剂，全体和/或医学相关的动物病原体，全体和/或医学相关的植物病原体，具有生物工程化高潜力的生物体，动物传染剂 (zoonotic agents)，毒素，食物传播的病原体，新发传染剂等。特异性病原性目标(靶标) 进一步包括但不限于种类A、B、C优先病原体(变态反应和传染病国家研究院(National institutes of Allergy and Infectious Disease))，选择剂(卫生与公共服务部(Health and Human Services))，高后果性的植物和动物病原体(美国农业部(U. S. D^artment of Agriculture))，须申报的试剂(疾病控制中心(Centers for Disease Control))等，以及在本文中进一步说明的其他病原体。本文所描述的方法和组合物还广泛地用作诊断工具用于监测受试者(对象)体内多种失调和/或疾病。在一非限制性实例中，可以使用包括特异性癌标志物的数据库来设计MIP以用来诊断、预测和/或监测样本(例如，生物样本)中癌的存在。本文所描述的生物检测方法包括下面步骤收集样本，制备文库，MIP杂交和随后捕获，扩增，以及测序。可以从与本发明一起使用的广泛多样的来源(包括但不限于细胞培养物、动物或植物组织、病人活检、环境样本等)收集包含靶多核苷酸的样本或样品(例如基因组DNA和 /或基因组RNA的片段)。使用常规技术来制备样品，这些技术典型地取决于从中取得样本或样品的来源。如本文使用的，术语“样本”是指来自其中寻找靶核酸检测或测量的生物的、环境的、医学的、或病人来源的大量材料。另一方面它是指包括样品或培养物(例如，微生物培养物)。另一方面，它是指包括生物样本和环境样本两者。样本可以包括合成来源的样品。生物样本可以是动物，包括人类，流体，固体(例如，粪便或组织)，以及液体或固体食物和饲料产品以及成分例如奶制品，蔬菜，肉和肉类副产物，以及废物。生物样本可以包括从病人体内取得的材料，包括但不限于培养物、细胞、组织、血、唾液、脑脊髓液、胸膜液、乳、淋巴、痰、精液、针吸物等。可以从所有这些不同科的家养动物以及野化的或野生的动物体内得到生物样本，包括但不限于这类动物，例如有蹄动物、熊、鱼、啮齿动物等。环境样本包括环境材料例如表面物质，土壤，水和工业样本，以及从食品和乳制品处理仪器、器具、装备、 器皿、一次性以及非一次性物品中得到的样本。这些实例不应被解释为限制可用于本发明的样本类型。在样本上进行反应之前，通常理想的是在该样本上进行一个或多个样品制备操作。典型地，这些样本制备操作会包括这类操作如提取细胞内材料，例如来自全细胞样本的
核酸、病毒等。考虑到适合从紧密相关物中差异性地鉴别出病原性菌株的遗传标志特征，基于对药物耐受性、抗原、毒素以及表面蛋白进行编码的基因区域编译了一个病原体多态性数据库。这些感兴趣的区域还显示出对环境样本中靶病原体具有特异性。选择出已经显示对表型性状，例如药物耐受性(耐药性)、毒力、毒素、表面蛋白等(它们还显示出对于处于其野生型亦或突变型形式病原体的独特性)进行编码的基因中感兴趣的基因或区域。下面的标准(它们提供了质量控制)用于在添加到数据库中之前对候选基因进行评估1)临床和环境病原体隔离群的公开研究中的基因参照；2)感兴趣的区域出现在已经通过表型的药物敏感性测试表征的隔离群中；幻可以通过说明基因核苷酸位置以及核苷酸或氨基酸改变来鉴别出感兴趣的区域；以及4)进行BLAST评估用来验证感兴趣基因的独特性。使用软件例如MIPTAG ftx)，可以将MIP探针设计成捕获包括感兴趣区域(像例如，SNP，耐受性突变或类似物)的基因中感兴趣的整个基因或区域。输入核苷酸位置以及一组基因组。使用这些标准产生MIP探针。然而应当理解的是可以使用本领域熟知的方法和试剂来设计额外的数据库用来针对多种目的(例如疾病诊断，疾病预测，疾病监测等)适配多种已知生物标记。如本文使用的，"MIP技术”是指能够大规模询问(查询，interrogating)感兴趣核酸序列(例如，单碱基改变，单核苷酸多态性，药物耐受性突变等)的一种高通量基因分型技术。在SNP的高度多重基因分型中使用分子倒置探针技术的方法是已知的。参见 Hardenbol et al. Genome Res. (2005) 15 269 以及 Hardenbol et al. (2003)Nat. Biotechnol. 21 6730在等位基因定量中分子倒置探针技术的应用也是已知的。参见Wang et al. (2005) Nucl. Acids Res. 33^1)。总体上，MIP技术是针对在每个末端处与识别序列，并且可选地与一个或多个条形码序列一起使用寡核苷酸探针。使该探针与靶(例如基因组)核酸序列杂交使得它形成环形结构，其中探针末端对接。这在感兴趣的核酸序列的位置处留下一个单碱基缺口。具有缺口长度大于一个碱基的探针设计也用于其中希望捕获较长靶DNA序列的测定中。然后在四个分开的反应(各自存在一个单一 dNTP种类)中对该缺口双链体进行测试，其中成功的聚合反应和连接作用提供了等位基因差异。随后从靶核酸序列中释放出探针并且使用“通用”PCR引物对来扩增在适当的等位基因/核苷酸反应组合中已经共价环化的那些。选择标签以便具有类似Tm以及碱基组成并且在序列互补性方面最大地正交。根据本发明的多个方面，基于Hardenbol，Nature Biotech.，Vol. 21，No. 6.，6 June 1993 ；Hardenbol et al. , Genome Research,2005 ； 15 (2) :269-75 ；Fakhrai et al. (2003) Nature Biotech. 21 (6) :673 以及 Wang et al. (2005) Nucl. Acids Res. 33 :el83 中所描述的方法使用分子倒置探针。该探针包括位于该探针末端或端部的与靶核酸序列 (例如，SNP、抗生素耐受性基因或类似物)具有同源性的两个区域以及与所有探针共同的两个PCR引物区域，以及两个共同的切割位点。可以任选地包括通用的检测标签序列用于对扩增的探针进行阵列检测。切割位点用于从靶核酸序列中释放环化的探针并且用于扩增后加工。根据本发明的一个方面，提供了由此使用可共享探针池的多种方法。根据这个方面，以可收集和可扩增的(并且因此易于共享)方式在寡核苷酸芯片(例如，安捷伦 (Agilent))上产生了大量的和不同数量的MIP探针。每个MIP寡聚物在侧翼上为可以去除的用于扩增的通用寡聚物。下面的方法用来分离双链PCR产物的适当链以及用来去除上述的通用引物区域(1)使用该两个引物之一上的一个或多个3’硫代磷酸化核苷酸 (3' phosphothioate nucleotide), (2)使用对3，或5，突出端(或其缺少)敏感的核酸外切酶，一个引物具有一个或多个dU并且可以通过USER(它是尿嘧啶DNA糖基化酶与DNA 糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物)去除，然后另一个引物具有rU，它可以通过碱来切割，(3)使用固相固定(例如磁珠链亲合素)一个引物，其中使用碱或加热解链(熔融，melting)该碱基对以选择性地释放另一条链，(4)使用不对称PCR(使用过量的合乎要求的链的引物)以及( 通过将寡聚物工程化为具有不同长度(使用rU或dU方法亦或 2’ 0甲基基团来阻断PCR延伸超过该2’ Ome)而通过两条链的尺寸和/或电泳差异来使用分离。根据本发明的一些方面，可以制造具有大于一个核苷酸的缺口并且不延伸分子倒置探针长度的分子倒置探针。根据一个方面，在连接反应过程中，该MIP的单链区域自由延伸远超过常规的0.34nm/碱基并且自由地旋转(与完美的CCC不同)。可替代地，根据 Bates et al. (1989)EMBO J. 8 :1861中说明的方法可以制造非常小的DNA环。根据本发明， 针对较大靶标(目标)的较小MIP探针被认为在300个碱基对至900个碱基对的范围内更好地执行，这对于外显子和其他保守元件是有利的。在一些示例性实施方式中，将样本核酸序列、多种探针以及耐热的连接酶和聚合酶的混合物热变性并且到达退火温度。使靶向探针每个末端的两个序列杂交到靶核酸序列中的互补位点上，产生在探针末端之间具有单核苷酸缺口的环形构象。根据一个替代实施方式，该缺口可以大于一个核苷酸。然后将基因组DNA分裂成四个分开的样本。将未标记的dATP、dCTP、dGTP或dTTP添加到四个样本的每一个中。在其中添加的核苷酸与单个碱基缺口互补的反应中，DNA聚合酶添加核苷酸并且DNA连接酶封闭该缺口从而形成一个共价封闭的环形分子，该分子环绕将它杂交到其上的基因组链。添加核酸外切酶用来消化当添加的核苷酸未与缺口互补时反应中的线性探针以及当环形分子形成时反应中过量的线性探针。然后将反应加热用来使核酸外切酶失活。为了从样本核酸序列中释放出探针，添加尿嘧啶-N-糖基化酶用来使探针中的尿嘧啶残基脱嘌呤。然后将混合物加热用来在无碱基位点处切割分子并且从样本核酸序列中将它释放。可替代地，可以通过与切割不同的方法从样本核酸序列中去除该分子，由此以其环形形式留下该分子。然后可以进行扩增。用于扩增核酸的示例性方法包括聚合酶链式反应(PCR)(参见例 ia, Mullis et al. (1986)Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.51 Pt 1 263 和 Cleary et al. (2004)Nature Methodsl :241 ；以及美国专利号 4，683，195 和 4，683，202)，锚式 PCR，RACE PCR，连接链式反应(LCR)(参见例如 Landegran et al. (1988) Science 241 :1077-1080 ；以及 Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 91 360-364)，自续式序列复制(自主序列复制，self sustained sequence replication) (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. ki. U. S. Α. 87 :1874)，转录扩增系统(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 :1173), Q-β 复制酶(Lizardi et al. (1988) BioTechnology 6 :1197)，递归式 PCR(Jaffe et al. (2000)，J. Biol. Chem. 275 :2619 ；以及 Williams et al. (2002)，J. Biol. Chem. 277 :7790)，美国专利号 6，391，544,6, 365，375、 6，294，323,6, 261，797,6, 124，090以及5，612，199中描述的扩增方法，等温扩增(例如滚环扩增(RCA)，超分支滚环扩增(hyperbranched rolling circle amplification) (HRCA)， 链置换扩增(SDA)，螺旋酶依赖型扩增(HAD)，PWGA)或使用本领域技术人员熟知技术的任何其他核酸扩增方法，聚合酶和/或连接酶链式反应，热循环(PCR)或等温的方法(例如， RCA, hRCA, SDA, HAD, PWGA(环球网biohelix. com/technology, asp))。几种适当的RCA方法是本领域已知的。例如，线性RCA通过聚合酶延伸的互补引物来扩增环状DNA。这个过程产生了环状DNA模板的串联拷贝从而产生末端至末端串联排列的DNA序列的多拷贝。指数RCA类似于线性过程，除了它使用与该DNA环具有相同序列的第二引物之外(Lizardi et al. (1998)Nat. Genet. 19 :225)。这种双引物系统实现了等温的指数扩增。指数RCA已经用于通过使用在其两个末端上结合到靶DNA连续区域上的线性探针来扩增非环状DNA，紧接着使用DNA连接酶进行环化(例如，锁式RCA) (Nilsson et al. (1994) Science 265(5181) :2085)。超分支RCA使用与滚环复制(RCR)产物互补的第二引物。这允许通过链置换机理来复制RCR产物，该机理可以在一等温反应中产生十亿倍扩增(Dahl et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 101 (13) :4548)。“聚合酶链式反应”或“PCR”是指一种用于通过同时引物延伸DNA的互补链进行体外扩增特定DNA序列的反应。换言之，PCR是一种用于制造在侧翼上为引物结合位点的靶核酸多拷贝或复制的反应，这类反应包括下面步骤的一次或多次重复(i)使靶核酸变性，(ii)使引物退火到该引物结合位点上，以及(iii)在核苷三磷酸存在下通过核酸聚合酶来延伸引物。通常地，在热循环仪仪器中通过针对每一步优化的不同温度将该反应循环。具体温度、每一步的持续时间，以及步骤之间变化的速率取决于本领域普通技术人员熟知的多种因素，例如通过参考下面各项举例说明的=McPherson et al.，editors, PCR =A Practical Approach \)JsR PCR2 :A Practical Approach ( ^vSiJ^ IRL Press, Oxford, 1991 和1995)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，可以在大于90°C的温度下使双链靶核酸变性，在50-75°C范围内的温度下使引物退火，并且在72-78°C范围内的温度下使引物延伸。术语“PCR”包括该反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR，实时PCR，巢式PCR，定量PCR，多重PCR等。反应体积范围从数百纳升(例如200nL)至数百微升(例如200微升)。“逆转录PCR”或“RT-PCR”是指在逆转录反应之前的一种PCR，它将靶RNA转化成互补的单链DNA，并且然后对该单链DNA进行扩增，例如Tecott等人，美国专利号5，168，038。 “实时PCR”是指随着反应进行对反应产物数量例如扩增子进行监测的一种PCR。存在多种形式的实时PCR，其差异主要在于用于监测反应产物的检测化学，例如Gelfand等人，美国专利号 5，210，015(" Taqman”) ；Wittwer 等人，美国专利号 6，174，670 和 6，569，627 (嵌入染料)；Tyagi等人，美国专利号5，925，517(分子信标)。实时PCR的检测化学在Mackay et al. ,Nucleic Acids Research. 30 :1292-1305(2002)中进行了综述。“巢式PCR”是指一种两阶段PCR，其中一个第一 PCR的扩增子成为使用一组新引物的对于第二 PCR的样品，它们中至少之一结合到该第一扩增子的一个内部位置上。如本文使用的，关于巢式扩增反应， “初始引物”是指用于产生第一扩增子的引物，而“第二引物”是指用于产生第二、或巢式、 扩增子的一个或多个引物。“多重PCR”是指其中在同一个反应混合物中多个靶序列(或一个单个靶序列和一个或多个参考序列)同时进行的一种PCR，例如Bernard et al. (1999) Anal. Biochem.，273 :221-228 (双色实时PCR)。通常地，针对有待扩增的每个序列使用不同组的引物。“定量PCR”是指设计用来测量样本或样品中的一种或多种特异性靶序列丰度的一种PCR。定量PCR包括这类靶序列的绝对定量和相对定量两者。用于定量PCR的技术是本领域普通技术人员熟知的，如在下面参考文件中举例说明的=Freeman et al., Biotechniques,26 :112-126(1999) ；Becker-Andre et al. ,Nucleic Acids Research, 17 9437-9447(1989) ；Zimmerman et al.，Biotechniques，21 :268-279(1996) ；Diviacco et al. , Gene,122 :3013-3020(1992) ；Becker-Andre et al.，Nucleic Acids Research,17 9437-9446(1989)等。在一些实施方式中，提供了确定一种或多种核酸序列(例如靶核酸序列)中该核酸序列的方法。可以使用本领域已知的多种测序方法实现靶核酸序列的确定，包括但不限于通过杂交测序(SBH)，通过连接测序(SBL)，定量递增的荧光核苷酸添加测序 (QIFNAS)，逐步连接和切割，荧光共振能量转移(FRET)，分子信标，TaqMan报告基因探针消化，焦磷酸测序，荧光原位测序(FISSEQ)，FISSEQ珠(美国专利号7，425，431)，摇摆测序 (wobble sequencing) (PCT/US05/27695)，多重测序(于2008年2月6日提交的美国系列号 12/027，039 ；Porreca et al (2007) Nat. Methods4 :931)，聚合克隆(POLONY)测序(美国专利号 6，432，360,6, 485，944 和 6，511，803，以及 PCT/US05/06425)；纳米格栅滚环测序(nanogrid rolling circle sequencing) (R0L0NY)(于 2008 年 5 月 14 日提交的美国系列号12/120，Ml)，等位基因特异性寡聚物连接测定法(例如寡聚物连接测定法(OLA)、 使用连接的线性探针以及滚环扩增(RCA)读出的单模板分子0LA、连接的锁式探针、和/或使用连接的环形锁式探针和滚环扩增(RCA)读出的单模板分子0LA)等。例如使用多种平台(例如 Roche 454，Illumina Solexa，AB-SOLiD，Helicos，Polonator 平台等)在环形阵列测序上还可以使用高通量测序方法。高通量测序方法在于2009年3月M日提交的美国系列号61/162，913中进行了说明。多种基于光的测序技术是本领域已知的(Landegren et al. (1998)Genome Res. 8 :769-76 ；Kwok(2000)Pharmocogenomics 1:95-100;以及 Shi (2001)Clin. Chem. 47 :164-172)。在一些示例性实施方式中，提供了用于鉴别病原体是否存在的方法。如本文使用的，术语“病原体”包括但不限于病原性生物体，例如病毒、细菌、真菌、寄生虫、传染性蛋白寸。病毒包括但不限于DNA或RNA动物病毒。如本文使用的，RNA病毒包括但不限于多个病毒科(virus families)，例如细小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒属(polioviruses))，呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，轮状病毒属(rotaviruses))，披膜病毒科(Togaviridae)(例如，脑炎病毒(encephalitis viruses),黄热病毒(yellow fever virus),风疫病毒(rubella virus)),正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒(influenza viruses)),副粘病毒科 (Paramyxoviridae)(例如，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus),麻疫病毒(measles virus),腿腺炎病毒(mumps virus),苜1J 流感病毒(parainfluenza virus))，弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，狂犬病毒(rabies virus))，冠状病毒科 (Coronaviridae)，布尼亚病毒禾斗(Bunyaviridae)，黄病毒禾斗(Flaviviridae)，纤丝病毒科(Filoviridae)，砂粒病毒科(Arenaviridae)，布尼亚病毒科(Bunyaviridae)以及逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人T细胞淋巴营养病毒(人T细胞亲淋巴病毒，human T cell lymphotropic viruses) (HTLV),人免疫缺陷型病毒(human immunodeficiency viruses) (HIV))。如本文使用的，DNA病毒包括但不限于多种病毒科例如乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)(例如乳头瘤病毒(papilloma viruses)),腺病毒科(Adenoviridae) (例如腺病毒(adenovirus))，疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如，单纯疱疹病毒(herpes simplex viruses))，以及痘病毒禾斗(Poxviridae)(例如天花病毒(variola viruses))。细菌包括但不限于革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌，耐酸细菌等。如本文使用的，革兰氏阳性细菌包括但不限于放线菌科(Actinomedurae)，衣氏方文线菌(Actinomyces israelii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、赌样芽孢杆菌(蜡状芽孢杆菌，Bacillus cereus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)破伤风梭菌(Clostridium tetani)、棒状杆菌(Corynebacterium)、獎肠球菌(Enterococcus faecalis)、单核细胞增生李斯特菌(单核细胞增多李斯特菌，Listeria monocytogene)、 诺卡氏菌(Nocardia)、痤疫丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epiderm)、变异链球菌 (Streptococcus mutans)、月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)等。如本文使用的，革兰氏阴性菌包括但不限于猫阿菲波菌属(猫阿菲彼亚杆菌， Afipia felis)、类杆菌属(Bactericides)、杆状巴尔通体(Bartonella bacilliformis)、 百曰咳博德特菌(Bortadella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、 回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、布鲁菌属(Brucella)、肉芽肿鞘杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)、弯曲杆菌(Campylobacter)、大肠杆菌 (Escherichia coli)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、阴道加德纳菌 (Gardnerella vaginalis)、士矣及嗜血杆菌(Haemophilius aegyptius)、杜氏嗜血杆菌(Haemophilius ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilius influenziae)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、嗜月市军团菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺方宠体 (Leptospira interrogans)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidia)、牙銀口卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、其Jf式普罗威登其Jf菌(Providencia sturti)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠炎沙门菌(Salmonella enteridis)、伤寒沙门菌 (Salmonella typhi)、粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)、鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、念珠状链杆菌(Streptobaci 1 Ius moniliformis)、化胺链球菌(Streptococcuspyogenes)、苍白密螺旋体(Tr印onema pallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、小肠结肠炎耳口尔森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耳口尔森菌(Yersinia pestis)等。如本文使用的，耐酸细菌包括但不限于鸟分支杆菌(Myobacterium avium)、麻风分枝杆菌(Myobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Myobacterium tuberculosis)等。如本文使用的，未落在其他三个类别中的其他细菌包括但不限于汉氏巴尔通体(Bartonella henselae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体 (Chlamydia trachomatis)、伯氏考克斯体(Coxiella burnetii)、月市炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、小株立克次体(Rickettsia akari)、普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、恙虫热立克次体(Rickettsia tsutsugamushi)、斑疹伤寒立克次体(Rickettsia typhi)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)、月市炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)、查菲埃立克体(Ehrlichia chafensis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、脑膜炎球菌(Meningococci)等。如本文使用的，真菌包括但不限于曲霉(Aspergilli)、假丝酵母属(Candidae)、 白色念珠菌(Candida albicans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、隐球菌属 (Cryptococci)、以及它们的组合。如本文使用的，寄生性微生物包括但不限于结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、小球隐孢子虫(小隐孢子虫，Cryptosporidium parvum)、卡曼环孢子球虫 (Cyclospora cayatanensis)、脑胞内原虫属(Encephalitozoa)、溶组 只内可米巴 (Entamoeba histolytica)、比氏肠胞微抱子虫(Enterocytozoon bieneusi)、兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、利什曼原虫属(Leishmaniae)、疟原虫(Plasmodii)、鼠弓形体 (Toxoplasma gondii)、维虫属(Trypanosomae)、梯形阿米巴虫(trapezoidal amoeba)等。如本文使用的，寄生虫包括蠕虫类(例如蠕虫(helminthes))，尤其是寄生性蠕虫类包括但不限于线虫动物门(圆虫类，例如，鞭虫类(whipworms)、钩虫类、蛲虫类、蛔虫类、 丝虫类等)，多节绦虫亚纲(例如，绦虫类(条虫类，tapeworms))。如本文使用的，传染性蛋白包括朊病毒类。由朊病毒引起的失调包括但不限于人类失调，例如克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease) (CJD)(包括例如医源性克-雅二氏病(iCJD)、变异型克-雅二氏病(vCJD)、家族性克-雅二氏病(fCJD)、以及散发性克-雅二氏病(sCJD))，杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征(Gerstmann-Strausslerlcheinker syndrome) (GSS)，家族致命性失眠症(fFI)，散发性致命性失眠症(sFI)，库鲁病等，以及动物体内的失调，例如瘙痒症(绵羊和山羊)，牛海绵状脑病(疯牛病)(BSE)(牛)，传染性水貂脑病(TME)(水貂)，慢性消耗性疾病(CWD)(驼鹿，黑尾鹿(mule deer))，猫海绵状脑病 (猫)，外来有蹄类脑病(exotic ungulate enc印halopathy) (EUE)(尼牙薮羚，长角羚，大弯角羚)，鸵鸟的海绵状脑病等。在一些示例性实施方式中，提供了预测、诊断和/或监测一种或多种细胞增生性失调的方法。细胞增生性失调意在包括与快速增殖相关的失调。如本文使用的，术语“细胞增殖性失调”包括多种失调，其特征为多细胞生物体内一个或多个细胞亚群不希望的或不适当的增殖。术语“癌”是指各种类型的恶性瘤，它们中的大多数可以侵入外围组织，并且可以转移到不同部位(参见例如PDR Medical Dictionary 1 st edition(1995)，出于所有目的通过引用将其全部内容结合在此)。术语“瘤(neoplasm)”和“肿瘤(tumor) ”是指通过比正常情况更快地细胞增殖所生长的异常组织。同前。这种异常组织显示部分地或全部地缺少结构组织以及与正常组织的功能协调(它可以是良性的(例如良性肿瘤)或恶性的 (例如恶性肿瘤))。意在被本发明包括的瘤类型的实例包括但不限于与神经组织、血液形成组织、乳 (胸部)、皮肤、骨、前列腺、卵巢、子宫、子宫颈、肝、肺、脑、喉、胆囊、胰腺、直肠、甲状旁腺、 甲状腺、肾上腺、免疫系统、头和颈、结肠、胃、支气管、和/或肾的癌相关的那些瘤。对于其中对全细胞、病毒或其他组织样本进行分析的那些实施方式，典型地将有必要在继续进行不同样本制备操作之前，从细胞或病毒中提取核酸。因此，在样本收集之后，可以从收集的细胞、病毒衣壳等中释放核酸进入粗提取物中，紧接着进行额外处理来制备样本用于随后操作，例如污染(DNA结合)蛋白的变性、纯化、过滤、脱盐等。从样本细胞或病毒中释放核酸，使DNA结合蛋白的变性一般可以通过化学的、物理的、或电解的溶解方法来实现。例如，化学方法一般使用溶解试剂来破裂细胞并且从细胞中提取核酸，紧接着用离液盐例如异硫氰酸胍或脲处理提取物从而使任何污染的和潜在地干扰蛋白变性。总体上，当使用化学提取和/或变性方法时，可以将适当的试剂结合到样品制备室、分离的可进入室中，或者可以外部引入。在提取之后，通常可以期望的是从粗提取物的其他元件中(例如变性的蛋白、细胞膜颗粒、盐等)分离这些核酸。去除微粒物质一般通过过滤、絮凝或类似方法来实现。可以将多种过滤器类型容易地结合到该设备中。此外，当使用化学变性方法时，可以期望的是在进行下一步之前将该样本脱盐。样本脱盐和分离核酸一般可以在单一步骤中实现，例如通过将核酸结合到固相上并且洗掉污染盐类或对样本进行凝胶过滤层析，使盐通过透析膜等。用于核酸结合的适当固体载体包括例如硅藻土、硅石(例如，玻璃棉)或类似物。适当的凝胶排阻介质(也是本领域熟知的)也可以容易地结合到本发明的设备中，并且可以从例如 Pharmacia 禾口 Sigma Chemical 商购。在一些应用中(例如测量来自病人血液的稀有细胞中的靶多核苷酸)，在进行测定之前可以例如通过免疫磁分离、荧光细胞分选、或其他这类技术执行富集步骤。可以使用本领域已知的多种技术和材料来进行这类分离或富集，如在下面的代表性参考文献中披露的Terstappen等人，美国专利号6，365，362 ；Terstappen等人美国专利号5，646，001 ； Rohr等人，美国专利号5，998，224 ；Kausch等人，美国专利号5，665，582 ；Kresse等人，美国专利号6，048，515 ；Kausch等人，美国专利号5，508，164 ；Miltenyi等人，美国专利号 5，691，208 ；Molday，美国专利号 4，452，773 ；Kronick，美国专利号 4，375，407 ；Radbruch 等入，Chapter 23, in Methods in Cell Biology,Vol. 42(Academic Press,New York,1994)； Uhlen 等人，Advances in Biomagnetic Separation (Eaton Publishing, Natick, 1994)； Safarik 等人，J. Chromatography B, 722 :33-53(1999) ；Miltenyi 等人，Cytometry,11 231-238(1990) ；Nakamura 等人，Biotechnol. Prog.，17 :1145-1 155(2001) ；Moreno 等人， Urology, 58 :386-392(2001) ；Racila 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. , 95 :4589-4594 (1998)； Zigeuner 等人，J. Urology, 169 :701-705 (2003) ；Ghossein 等人，Seminars in Surgical Oncology,20 :304-311(2001)。本文使用的核酸化学、生物化学、遗传学、以及分子生物学的术语和符号遵循本领域中的标准论述和文本的那些，例如Komberg and Baker, DNA Replication,Second Edition(W. H. Freeman, New York,1992) ；Lehninger, Biochemistry, Second Edition(Worth Publishers, New York,1975) ；Strachan and Read, Human Molecular Genetics, Second Edition(Wiley-Liss, New York,1999) ；Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogs :A Practical Approach(Oxford University Press, New York,1991) ；Gait,editor,Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach(IRL Press, Oxford, 1984)等。“互补”或“基本上互补”是指核苷酸或核酸之间(像例如双链DNA分子的两个链之间或一个寡核苷酸引物与单链核酸上的一个引物结合位点之间)杂交或碱基配对或形成双链体。互补的核苷酸通常是A和T(或A和U)，或C和G。当一个链的核苷酸(最佳地比对和比较的并且具有适当的核苷酸插入或缺失)与另一个链的至少约80%核苷酸配对时(通常是至少约90%至95%，并且更优选地从约98%至100% )，两个单链RNA或DNA分子被称为是基本上互补的。可替代地，当在选择的杂交条件下一个RNA或DNA链可以杂交到其互补物上时，存在实质的互补性。典型地，当在至少14至25个核苷酸的一段序列上存在至少约65%互补性时(优选地至少约75%，更优选至少约90%互补性)，可以发生选择性杂交。参见Kanehisa(1984)Nucl. Acids Res. 12 :203。根据本发明，有用的MIP引物序列杂交到侧翼为待捕获的核苷酸碱基或碱基系列的序列上。“复合物”是指彼此直接或间接接触的分子组装体或聚集体。一方面，关于分子复合物或关于特异性或特异性结合，“接触”，或更具体地，“直接接触”是指两个或更多分子足够接近使得吸引性非共价相互作用例如范德华力、氢键、离子键以及疏水相互作用等主导了分子的相互作用。在这样的方面中，分子复合物是稳定的因为在这些测定条件下该复合物在热力学方面比其组分分子的未聚集或未复合状态更有利。如本文使用的，“复合体”是指多核苷酸的双链体或三链体或两种或更多种蛋白的稳定聚集体。就后者而言，通过抗体特异性结合到其相应的抗原上形成一种复合物。“双链体”是指全部或部分互补的至少两个寡核苷酸和/或多核苷酸在其核苷酸全部或大多数中经历沃森-克里克(Watson-Crick)类型碱基配对从而形成一种稳定的复合物。术语“退火”和“杂交”可互换地使用，用来指形成一种稳定的双链体。一方面，稳定的双链体是指通过严格(例如包括下面各项的条件温度为小于该双链体的链的Td々5°C，以及低单价盐浓度，例如小于0. 2M，或小于0. 1M)洗涤而未破坏的一种双链体结构。关于双链体，“完美匹配”是指组成双链体的多核苷酸或寡核苷酸链彼此形成一种双链结构使得每个链中每个核苷酸与另一个链中的一个核苷酸经历沃森-克里克碱基配对。术语“双链体” 包括可以使用的核苷类似物的配对，例如脱氧肌苷、具有2-氨基嘌呤碱基的核苷、PNA等。 双链体中两个寡核苷酸或多核苷酸之间的“错配”是指该双链体中的一对核苷酸未能经历沃森-克里克结合。关于基因组或靶多核苷酸，“基因位点”或“基因座”是指该基因组或靶多核苷酸的一个连续亚区或区段。如本文使用的，基因位点或基因座可以指核苷酸、基因、或基因的一部分在基因组(包括线粒体DNA)中的位置，或它可以指基因组序列任何连续部分无论它是否在基因内或与基因相关联。一方面，基因位点是指基因组序列(包括线粒体DNA)长度从一个单核苷酸至数百个(例如100-300)核苷酸的一个区段的任何部分。通常地，可以通过其核苷酸序列或邻近或侧翼区之一或两者的一个或多个核苷酸序列鉴别出特定基因位点。另一方面，基因位点是指基因的表达的核酸产物，例如其RNA分子或cDNA拷贝。“杂交”是指其中两个单链多核苷酸非共价地结合从而形成一个稳定的双链多核苷酸的过程。术语“杂交”还可以指三链杂交。得到的(通常地)双链多核苷酸是“杂交体” 或“双链体”。“杂交条件”典型地可以包括盐浓度小于约1M，更通常地小于约500mM，并且甚至更通常地小于约200mM。杂交温度可以低至5°C，但是典型地高于22°C，更典型地高于约30°C并且通常超过约37°C。通常在严格条件下进行杂交，即在其中探针可以杂交到其靶子序列的条件下。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境中是不同的。较长的片段可能需要较高的杂交温度进行特异性杂交。因为其他因素可以影响杂交的严格性(包括碱基组成以及互补链的长度，有机溶剂的存在以及碱基错配的程度)，参数的组合比单独任何一项的绝对测量值更重要。总体上，选择严格条件是在定义的离子强度和PH下比特定序列的Tm 低约5°C。示例性的严格条件包括在pH 7. 0至8. 3并且温度为至少25°C下盐浓度为至少 0. OlM至不大于IM Na离子浓度(或其他盐类)。例如，5XSSPE (750mM NaCl、50mM磷酸钠、 5mM EDTA，pH 7.4)和25_30°C温度的条件适合于等位基因特异性探针杂交。关于严格条件参见例如 Sambrook,Fritsche and Maniatis,Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)以及Anderson Nucleic Acid Hybridization, 1st Ed. ,BIOS Scientific Publishers Limited(1999)。“特异性杂交到...上”或“特异性地杂交到...上”或类似表达是指当该序列存在于复合体混合物(例如全细胞)DNA或RNA 中时，在严格条件下使一个分子实质性地结合、形成双链、或杂交到或仅结合、形成双链、或杂交到一个或多个特定核苷酸序列上。“基于杂交的测定”是指依赖于由于特异性结合事件形成稳定复合体的任何测定。 一方面，基于杂交的测定是指依赖于在探针和靶核苷酸序列之间形成稳定双链体或三链体用于检测或测量这样序列的任何测定。一方面，这类测定的探针在从8至100个核苷酸的范围内退火到靶序列的区域上(或与其形成双链体)；或在其他方面中，它们在从8至40个核苷酸的范围内，或更通常地在从8至20个核苷酸的范围内退火到靶序列上。关于基于杂交的测定，“探针”是指具有一种序列的多核苷酸，该序列能够与靶核酸中的其互补物形成稳定的杂交体(或三链体)并且能够被直接地亦或间接地检测出来。基于杂交的测定包括但不限于使用一个或多个寡核苷酸特异性碱基配对作为靶识别组分的测定，例如聚合酶链式反应，NASBA反应，寡核苷酸连接反应，单碱基延伸反应，可环化探针反应，等位基因特异性寡核苷酸杂交(处于溶液相中亦或结合到固相载体上，例如微阵列或微珠粒等)。基于杂交测定的一种重要亚类包括这类测定它们具有杂交步骤之后至少一个酶处理步骤。这个亚类的基于杂交的测定包括但不限于聚合酶链式反应，NASBA反应，寡核苷酸连接反应，切割酶反应(例如在INVADER 测定中)，单碱基延伸反应，探针环化反应等。在文献中在基于杂交测定方面存在广泛的指导，例如 Hames et al. ， editors, Nucleic Acid Hybridization a Practical Approach(IRL Press,Oxford,1985) ；Tijssen,Hybridization with Nucleic Acid Probes,Parts I & II (Elsevier Publishing Company,1993) ；Hardiman,Microarray Methods and Applications (DNA Press,2003) ；Schena, editor, DNA Microarrays a Practical Approach (IRL Press, Oxford，1999)等。一方面，基于杂交的测定是溶液相测定；即在对反应速率基本上没有表面效应或影响的条件下探针和靶序列两者杂交。溶液相测定包括下面的情况，其中探针亦或靶序列附连到微珠粒上从而使得附连的序列具有基本上与自由序列相同的环境(例如允许试剂接入等)。另一方面，基于杂交的测定包括其中抗体使用基于扩增的核酸报告基因的免疫测定。在这类测定中，在分开的反应中抗体探针特异性地结合到靶分子(例如蛋白)上，此后这些反应的产物(即抗体-蛋白复合物)相结合并且对核酸报告基因进行扩增。优选地，这类核酸报告基因包括通过酶促的方式转化成标记的寡核苷酸标签用于在微阵列上进行分析的寡核苷酸标签(如下所描述)。下面示例性参考文献披露了用于免疫测定的抗体-核酸结合物=Baez等人，美国专利号6，511，809 ； Sano等人，美国专利号5，665，539 ；Eberwine等人，美国专利号5，922，553 ；Landegren等人，美国专利号6，558，928 ；Landegren等人，美国专利
发明者乔治·M·丘奇, 阿德耶米·阿德索卡恩 申请人:哈佛大学校长及研究员协会