专利名称：从稀的水溶液中回收有机组分的方法
技术领域：
本发明涉及一种从例如发酵肉汤的水培养基中回收有机组分的方法，所述水培养 基含有产所述有机组分的微生物。该方法包括通过增加培养基中导致该有机组分盐析的至 少一种亲水溶质的浓度来增强水培养基中的有机组分的活性。与未改造的相应微生物相 比，该微生物被基因改造成能够耐受培养基中更高浓度的亲水溶质。
背景技术：
本发明的方法使得发酵具有改进的容积效率，并且实现了对发酵产物的回收。由 于同时进行的发酵和回收过程增加了发酵产物的浓度，同样量的发酵肉汤所产生和回收的 发酵产物的量得到增加，本发明方法还能够降低在生产中所使用的能源。因此，本发明实现 了在少量的资金和降低的生产成本下进行发酵产物的生产和回收。控制发酵过程的经济表现的关键参数是产物浓度和容积效率。在某些情况下，发酵肉汤中高浓度的发酵产物可能对微生物具有某些毒性作用和 /或抑制进一步的发酵过程，从而导致非常稀释的产物以及低的容积效率。低的有效产物浓度和容积效率对于产物的经济状况的多个方面具有负面影响，包 括设备尺寸和效用成本。随着发酵肉汤中产物浓度的降低，水溶液的回收体积增加，从而导 致更高的资金成本和在生产设备中加工更大体积的材料。回收过程的利用使得发酵产物在生产的同时被移除，因此增加的产物容积效率和 浓度可能强有力地影响产物的经济状况。例如，对于大型工业发酵设备，每完成两次发酵， 其容积效率将节省几乎50%的发酵罐成本。该发酵罐的资金成本和尺寸的下降降低了设备 的折旧和生产成本。同样地，回收过程使得在该过程中形成产物富集相，水富集相被隔离以及丢弃，发 酵肉汤体积中的水负载在下游回收中处理，纯化设备大大减少。例如，对于给定的产品产 量，回收相中产物浓度的加倍几乎使待处理的水量减半，降低了生产和资金成本。许多科技方法已被开发用于从水基发酵培养基中同时移除发酵产物，包括液/液 萃取，薄膜分离(例如，全蒸发)，吸附法以及吸收法。在如上所述的情况中，当发酵罐流中的 发酵产物浓度较低时，这些方法对于操作和资金成本具有重大影响，由于较高的能量损耗 以及昂贵的设备使得任何商业性生产均不能独立生存。例如，目前，在工业水平执行的最广泛使用的原位(in sito)回收技术是液/液萃 取。在该过程中，一种萃取剂被混入该发酵肉汤中。发酵产物被萃取进入该萃取剂中，并通 过反萃取进入另一种萃取剂或者通过蒸馏法得到回收。除了上面所述的缺点之外，还有多 种问题与液/液萃取相关联，例如对细胞的毒性，乳状液的形成，昂贵萃取剂的消耗，以及 微生物细胞在萃取剂与发酵肉汤界面处的累积。全蒸发是一种薄膜基工艺，通过使用一种可选的薄膜被用于将溶剂从发酵肉汤中 移除。该液体或溶剂扩散穿过固体薄膜，而将营养物，糖，和微生物细胞留下。通常与全蒸 发相关联的一个问题在于经济地提供和维持穿过薄膜的化学位梯度。那些使用真空泵或冷凝器以提供必需的化学位梯度的全蒸发工艺属于能源密集型，因此操作昂贵。随着有机化 合物在原料流中的浓度降低为低水平，渗透流中可蒸发的有机化合物的分压必须被保持更 低以用于渗透从而产生分离。如果真空泵被用于维持与液体原料流保持平衡的有机化合物 的分压与蒸汽相渗透中可蒸发的有机化合物的分压之间的差别，该泵则必须维持非常高的 真空度，从而导致高的资金和操作成本。同样地，如果使用冷凝器，必须要维持极低的温度， 从而要求昂贵的以及复杂的制冷系统。因此，对于商业性生产，需要一种低成本的方法，该方法能够使发酵产物在产生的 同时被移除，以阻止有毒的发酵产物的浓度超过培养物的耐受水平，从而提高容积效率，同 样需要一种回收该发酵产物的方法，该方法使用相分离以降低工艺用水体积。现有技术旧2009/0171129ム1描述了ー种从例如发酵肉汤的稀的水溶液中回收 C3-C6醇类(下文也表示为c3_6-醇类)的方法，包括a.増加c3_6-醇类在发酵肉汤的一部分 中的活性至c3_6-醇类在该部分中至少饱和；b.从该发酵肉汤的该部分中形成富含c3_6-醇 的液相和富含水的液相；以及じ将富含ら_6-醇的相从富含水的相中分离。该ら_6-醇的活 性可通过例如盐析来增加，即，将ー种亲水溶质加入该水溶液中。现有技术中所描述的方法具有缺陷被用于发酵的微生物通常不能耐受理想组分 的盐析所要求的亲水溶质的浓度。因此，如果不是对现有技术的方法的功能不利的话，这些 方法的容积效率和成本效率至少大体上下降。
发明内容
因此，本发明所解决的技术问题就是进ー步改进现有技术如US2009/0171U9A1 中描述的方法。上述技术问题的解决方案通过权利要求中所描述的本发明的实施方式提供。本发明涉及ー种分离方法，用于从例如发酵肉汤的稀的水溶液中对有机组分的回 收。该方法使得发酵具有改进的容积效率，并且实现了对发酵产物的回收。由于同时进行 的发酵和回收过程增加了发酵产物的浓度，同样量的发酵肉汤所产生和回收的发酵产物的 量得到增加，本发明方法还能够降低在生产中所使用的能源。因此，本发明实现了在少量的 资金和降低的生产成本下进行发酵产物的生产和回收。特别是，本发明提供了ー种从例如发酵肉汤的水培养基中回收有机组分的方法， 该水培养基中含有产该有机组分的微生物，包括以下步骤(&)增加至少ー种亲水溶质在该水培养基的至少ー部分中的浓度，从而使该有机 组分在该水培养基的该部分中的活性增加至该有机组分在该部分中至少饱和；(b)从该部分中形成富含有机组分的液相和液体的富含水的相；以及(c)将富含有机组分的液相从富含水的相中分离；其中，该微生物被基因改造成与未改造的微生物相比能够耐受水培养基的该部分 中更高浓度的至少ー种亲水溶质。本发明进ー步的主题涉及ー种生产有机组分的方法，包括步骤(A)在发酵培养基中培养微生物使所述微生物生产该有机组分；(B)采用此处限定的从水溶液中回收有机组分的方法，从发酵培养基的至少ー部 分中回收由该微生物释放到发酵培养基中的有机产物。
迄今为止，采用盐析在发酵产物产生的同时移除发酵产物的工艺结合采用具有耐 受高盐的细胞和有机体的发酵工艺从未被报道。
具体实施例方式术语“发酵”或“发酵工艺”被定义为一种微生物在含有例如原料(feedstock)和 营养物的原材料的培养基中进行培养的工艺，其中该微生物将例如原料的原材料转化成产 物。术语“有机组分”可以是由微生物生产的并且出现在例如发酵肉汤中的水溶液中 的任何有机化合物。该有机组分可以是醇类。优选地，该醇类是一种(3_(6-的一元醇或二元醇，特别 是丙醇，丁醇，戊醇，或己醇，或相应的二元醇，例如丙二醇，丁二醇，戊二醇，或己二醇。在一 些实施例中，该丙醇可以是1-丙醇或2-丙醇。在一些实施例中，该丁醇可以是1-丁醇，
2-丁醇，叔丁醇(2-甲基-2-丙醇)，或异丁醇(2-甲基-1-丙醇)。在一些实施例中，该戊 醇可以是1-戊醇，2-戊醇，3-戊醇，2-甲基-1- 丁醇，3-甲基-1- 丁醇，2-甲基-2- 丁醇，
3-甲基-2-丁醇，或2，2-二甲基-1-丙醇。在一些实施例中，该己醇可以是1-己醇，2-己 醇，3-己醇，2-甲基-1-戊醇，3-甲基-1-戊醇，4-甲基-1-戊醇，2-甲基-2-戊醇，3-甲 基-2-戊醇,4-甲基-2-戊醇，2-甲基-3-戊醇，3-甲基-3-戊醇，3，3- 二甲基-1- 丁醇， 2，2-二甲基-1-丁醇，2，3-二甲基-1-丁醇，2，3-二甲基-2-丁醇，3，3-二甲基-2-丁醇， 或2-乙基-1-丁醇。在其他优选的实施例中，该二元醇可以选自1，2-丙二醇，1，3-丙二 醇，1，2- 丁二醇，1，3- 丁二醇，2，3- 丁二醇以及 1，4- 丁二醇。在一些实施例中该有机组分可以是醛类。根据本发明，一种例如氯化钠的亲水溶质被以足够引起盐析的量加入水溶液(例 如发酵肉汤)中，盐析是指溶液分离成两不互溶的相；一个相是水的氯化钠溶液，另一个相 是有机发酵产物溶液。这两不互溶的相通过物理分离(例如，通过重力)，以获得仅含较小比 例的有机组分的主要是亲水溶质的水溶液，以及仅含较小比例的水的主要是有机组分的溶液。该亲水溶质优选被加入到发酵罐中的整个发酵肉汤中以在发酵产物产生的同时 移除该发酵产物，从而阻止有毒的发酵产物的浓度超过培养物的耐受水平。各种盐(例如， 氯化钠，或其他溶解的组分)的存在能够强烈地抑制暴露于这种条件的有机体的生长。在例 如酵母或细菌的有机体中，高盐的培养基能够引起细胞脱水，同时干扰新陈代谢，导致生长 抑制或细胞破坏。因此提供耐盐的有机体对于实现有机体在不利条件下生长是有用的，该 不利条件通常不支持有用水平的生长，或根本不支持生长。根据本发明的一个实施例，增强有机组分的活性可能包括向该水溶液中加入一种 亲水溶质。在一些实施例中，其中该水溶液是发酵肉汤，亲水溶质优选被加入到发酵罐中的 整个发酵肉汤中。关于加入亲水溶质，指的是增加已存在于该溶液的该部分中的亲水溶质 的浓度，或者指的是加入先前不存在于该溶液中的亲水溶质。这些浓度的增加可以是通过 外部的添加完成。作为选择地，或附加地，增加浓度也可以通过对溶液的原位处理进行，比 如通过水解已经存在于该溶液中的溶质，例如，水解蛋白质以将氨基酸加入到该溶液中，水 解淀粉或纤维素以将乳糖加入到溶液和/或水解半纤维素以将戊糖加入到溶液中。根据另一优选实施例，该亲水溶质可以是具有营养价值并且可选地以发酵副产物流流出，比如酒 糟及可溶物(distillers dried grains and solubles, DDGS)。此外或者可选地，该亲水 溶质可以是可发酵的，并且可与富含水的液相转移至该发酵罐中。通常地，该亲水溶质选自 盐，氨基酸，水溶性的溶剂，糖及其组合。该方法进一步包括形成富含有机组分的相，例如从该水溶液的该部分中形成富 含C3_6-醇的液相和富含水的液相，该水溶液的该部分已被处理增加了有机组分(例如， c3_6-醇)的活性。正如使用于此的一样，术语“富含有机组分的相”(例如，富含醇的液相) 指的是一种液相，其中该有机组分与水的比例大于起始水溶液的该比例。术语“富含水的液 相”指的是一种液相，其中水与有机组分的比例大于富含有机组分的液相中的该比例。该 富含水的相也可称为缺乏有机组分的相(organic component-lean phase),例如缺乏醇的 相。形成两相的步骤可以是主动的。例如，在一些实施例中，该形成步骤可以包括冷凝蒸 馏的蒸汽相，以在冷凝之后形成两相。可选地或此外，冷冻或冷却该水溶液的被处理的部 分可导致两相的形成。用于积极形成两相的其他步骤包括使用适合于促进相分离的设备。 相分离可在各种单元操作包括液_液分离器中完成，该液_液分离器包括利用相与水箱(a water boot)之间的特定的比重区别，如离心机中的重力分离的液/液分离器，或者离心式 的液-液分离器。沉降器同样适用，例如用于溶剂萃取工艺的混合沉降器。在一些实施例 中，该形成步骤是被动的，并且可能简单地只是由于在先前的步骤中增加了有机组分(优选 为C3_6_醇)的活性到至少饱和的自然结果。因此，在富含有机组分的液相中，该有机组分的浓度与水的比例有效高于在起始 部分中的该比例。在富含水的相中，该有机组分的浓度与水的比例有效低于在富含有机组 分的液相中的该比例。该富含水的相也可以被称为缺乏有机组分的相(例如缺乏醇的相)。本发明的优选实施例涉及从稀的水溶液中对C3_6_醇类的回收，该水溶液中含有产 此处定义的醇的微生物。关于具体的C3_6_醇类，在富含醇的相中的典型浓度可给出为如下 所示在一些实施例中，该醇是丙醇，在富含醇的相中丙醇与水的重量比约大于0. 2，约大 于0.5，或约大于1。在其他实施例中，C3_6-醇是丁醇，在富含醇的相中丁醇与水的比率约大 于1，约大于2，或约大于8。在其他实施例中，C3_6-醇是戊醇，在富含醇的相中戊醇与水的 比率约大于4，约大于6，或约大于10。对于给定相的浓缩因子或富集因子，可被表示为在该相中有机化合物(例如，醇) 与水的比率除以在稀的水溶液中有机组分与水的比率。因此，例如，对于富含有机组分的相 的浓缩因子或富集因子，可被表示为在该富含有机组分的相中有机组分/水的比率除以在 水的稀溶液中有机组分/水的比率。在一优选实施例中，在该富含有机组分的相中有机组 分(例如c3_6-醇)/水的比率大于起始水溶液(例如发酵肉汤)中有机组分(例如c3_6-醇)/ 水的比率，至少约5倍，至少约25倍，至少约50倍，至少约100倍，或至少约300倍。本发明的方法进一步包括将富含有机组分的液相(例如，富含C3_6_醇的相)从富含 水的相中分离。该两相的分离指的是该两相的物理分离，可包括移除，撇去浮沫，倾倒，倾析 或相反，将一个相从另一个相中转移，并且可以采用本领域中已知的用于分离液相的任何 手段完成。根据本发明的优选实施例，该有机组分(例如醇，优选上面概述的C3-C6_ —元醇或 二元醇)进一步从步骤(c)中获得的富含有机组分的液相中纯化(下文也表示为步骤(d))。在多个实施例中，该步骤(心可以包含步骤蒸馏，透析，水吸附，采用溶剂萃取进行有机组 分的萃取，与烃类液体接触或与亲水化合物接触，该烃类液体与水不互溶。该步骤可以产生 两相，包括含有该有机化合物(例如。厂醇)和水的第一相和含有该有机组分(例如醇) 的第二相，其中第二相中的水与有机组分(例如醇)的比率小于第一相中的水与有机 组分(例如仏一6-醇)的比率。在多个实施例中，第二相可以含有至少约洲被。/。的醇，至少约 95^1^。的醇，或至少约99*1^的醇。
〔0039〕 蒸馏法是一种进一步将该有机组分从步骤化)中富含有机组分的液相中纯化出来 的优选措施。在一些实施例中，蒸馏是在低于大气压以及约20-95。0的温度下进行。在 一些实施例中，蒸馏步骤在大约0丨025-101381-的压力下进行。根据本发明的优选实施例，加 工富含理想的有机组分(例如醇)的液相的步骤可以包含从富含醇的相中蒸馏出 基本上纯的醇。在一些实施例中，加工可以包含从富含醇的相中蒸馏出03一6-醇 的共沸混合物。在一些实施例中，加工可以进一步包含将富含醇的相与醇选择性 吸附剂接触。在一些实施例中，加工可以包含将富含仏一6-醇的相中的仏一6-醇转化成烯烃。 在一些实施例中，加工可以包含将富含醇的相与烃类液体相结合，该烃类液体与水不 互溶。在一些实施例中，该结合可以形成单一的均匀相。在一些实施例中，该结合可以形成 一轻相和一重相，轻相中醇与水的比率可能大于重相中的该比率。
〔0040〕 关于步骤匕)-(^)以及，可选地(心，现有技术中可以找到其进一步的常规指导， 特别是对于03一6-醇，例如，在…2009/0171129^1的各个部分中，相应内容通过引用全部合 并于本说明书中。
〔0041〕 本发明使得微生物通过发酵产具有有限的水溶性的有机产物。该微生物包括导致 其对亲水溶质的耐受度增强的基因改造，该亲水溶质被用于增强微生物所产的有机组分的 活性。与未进行基因改造的细胞(即，相对于这种改造的未改造微生物〉相比，该基因改造优 选引起细胞质中的至少一种小分子(渗压剂)的细胞内累积以中和外部的渗透压。本发明的 宿主细胞可以自然产发酵产物，或被设计成通过设计的代谢途径产发酵产物。
〔0042〕 这种基因改造以及产生的渗透压的耐受度可在多种不同细胞中获得。任何适当的 宿主细胞可被用于本发明的实践中。例如，该宿主细胞可以是基因改造的宿主细胞，其中核 酸分子被插入，删除或改造(即，突变；例如，通过一个或多个核苷酸的插入，删除，替换，和 I或反向兄适用于本发明的方法的有用的典型微生物是细菌和酵母。
〔0043〕 适用于本发明的情况的细菌微生物的例子包括但不限于枯草芽孢杆菌 ^ 880111118解淀粉芽抱杆菌811171011^116^8011168 ^ ；产氨短杆
^ 81~6^11380161~111111 811111101118^61168 ^ ； 81~6^11380161~111111 1 麵狀1 0^)111 1 11111 ’ 010 81^1(1111111
1361^61~1110^11 ；丙酮丁醇梭杆菌((^081^1(1111111 狀61013111711 ⑶爪)，丁酸杆菌也服 13111:711011111)7 阪崎氏肠杆菌8^32成11〉，大肠杆菌001:0， 乳酸乳球菌〔1^101:0(30(^118匕⑶；!^)，百脉根根瘤菌(此如!")!；!^。!^!!!]!匕丨丨)，绿脓假单胞菌
^？861101011101188 861^11^111088^； ？861101011101188 1116^8101111 ；861101011101188尺 110(1013801:61
。叩8111社118，球形红菌〔1^0(10133(31:61 8^11861~01 ^68 ^ ；深红红螺菌〔0110(10邓11~11111111 『油!"!!!]!)，肠道沙门氏菌伤寒沙门氏菌七丫沖土)， 8&11110116118病疾志贺菌 ^ 8111^6118 0178611161~186〉，弗氏志贺菌 ^ 8111^6118
索氏志贺菌(部丨阴丨匕80皿61〉，金黄色葡萄球菌(义叩，aureus),等等。
适用于本发明的情况的酵母微生物的例子包括但不限于构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae),白色念 珠菌(Candida albicans), Chrysosporium lucknowense,禾谷德抱菌(Fusarium graminearum),德抱霉(Fusarium venenatum),乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，粗糖脉抱菌(Neurospora crassa)，安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)， Pichia finlandica，Pichia kodamae，膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)， Pichia methanolica，Pichia opuntiae，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，Pichia pijperi， Pichia quercuum， Pichia salictaria， Pichia thermotolerans，Pichia trehalophila，Pichia stipitis，产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)，金色链霉 菌(Streptomyces aureofaciens)，Streptomyces aureus，贝酵母(Saccharomyces bayan us)，Saccharomyces boulardi，酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Streptomyces fungicidicus，Streptomyces griseochromogenes，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)， 变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)，Streptomyces olivogriseus,枝链霉菌 (Streptomyces rameus),Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus，以及瑞氏 木霉(Trichoderma reesei)。因此，在多个实施例中，该细胞是一种可选自上面所概括的种属中的酵母细胞， 优选是一种酵母属细胞，最优选是一种酿酒酵母细胞。同样地，如已概述如上，该细胞可 以是来自细菌种属，优选是大肠杆菌。适用于本发明的情况的基因改造微生物的其他细 菌种属来源于 hydrocarbonoclastic bacteria(HCB)，食减菌属(Alcanivorax)(例如， A. borkumensis)，角军环菌属(Cycloclasticus)，海杆菌属(Marinobacter)，Neptunomonas， Oleiphilus,Oleispira以及Thalassolitus的代表菌。在优选实施例中，细胞培养物中的 细胞优选以大量这种细胞存在。优选地，该细胞培养物是一种液体培养物。在优选实施例 中，该细胞培养物是一种高密度细胞培养物。有机溶质的累积是所有微生物渗透调节的先决条件为了调节环境的较低的水活 性，以及导致细胞质水的下降，微生物必须累积细胞内离子或有机溶质以恢复细胞渗透压 和/或细胞体积，以及同时保持酶活性。微生物对于渗透调节已发展出两种主要的策略。一种策略是依赖K+从 环境中选择性地流入，有时是极端地，高水平的流入，且该策略被称作“盐在细胞质 中(salt-in-the-cytoplasm)” 型的渗透适应(osmotic adaptation) (Galinski E. A.，Advances in Microbial Physiology 37:272-328 (1995) ; da Costa, M. S. et al.， Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 61:117-153(1998);Roe ^ ler, M. and Milller，V.，Environmental Microbiology 3:743-754(2001))。这种类型的渗透调节 发生在盐杆菌科(Halobacteriaceae)家族的极其嗜盐的古生菌，Order Halanaerobiales (Oren, A. Microbiology and Molecular Biology Reviews 63:334-348(1999))的厌氧适 度嗜盐的细菌，以及极度嗜盐细菌 Salinibacter ruber (Anton, J. et al.，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52:485-491(1999);Oren，A. and Mana, L. , Extremophiles 6:217 - 223(2002))。然而，大部分微生物没有经历过广泛的作为适应盐环境的先决条件的基因改变，并且该细胞内的大分子通常对于高水平的无机离子是敏感的。这些生物体偏爱积 累特定的小分子质量化合物，这种特定的小分子质量化合物被认为是兼容溶质或滲透 剂(Brown, A. D.，Bacteriological Reviews 40:803-846(1976), Brown, A. D. , Microbial Water Stress Pnysiology:Principles and Perspectives. Chichester:jonn Wiley & Sons(1990);Ventosa,A.et al. , Microbiology and Molecular Biology Reviews 62:504-544(1998))。兼容溶质如果存在的话，也可以是从环境中取得，或者可以从头合 成。微生物的最常见兼容溶质是中性的或者两性的，包含氨基酸和氨基酸衍生物，糖，糖 的衍生物(量糖苷)和多元醇，甜菜碱和四氢卩密唳(da Costa, M. S. et al. , Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 61:118 - 153(1998))。一些是普遍存在于微生 物中，即海藻糖，甜菜碱和a-谷氨酸盐，而其他溶质则限于少数生物体内。例如，多元醇普 遍存在于真菌和藻类，但是在细菌中非常稀有，以及在古生菌中未知。四氢嘧啶和羟基四氢 喃唳(hydroxyectoine)均是仅在细菌中发现的兼容溶质的例子。根据优选实施例，微生物累积的滲透剂可选自海藻糖，甜菜碱，脯氨酸，甘油，四氢 口密唳和轻基四氢卩密唳(hydroxyectoine)。这些渗透剂的增强的累积优选通过对微生物体内ー种或多种用于产理想有机组 分的生物途径进行基因改造获得。根据本发明该微生物的基因改造依赖于參与渗透剂或一种或多种其前体细胞的 生产和/或加工和/或细胞运输(输出，输入)的ー种或多种蛋白。通常，根据本发明该改造的微生物携帯允许參与上述途径的ー种或多种蛋白的 (过)表达的基因或基因结构。用于组装基因工具(比如质粒，病毒)，转染和理想结构的表 达的分子生物学操作在现有技术中是已知的(例如，參见Ausubel et al. (eds. ) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 2001-2009)。术语“基因”或“基因改造”是指能够被作为特定蛋白表达的核酸片段，可选地包含 在前的调控序列(5’非编码序列)和在后的编码序列(3’非编码序列)。“原生基因”(Native gene)是指被发现时天然具有其自身的调控序列的基因。“重组基因”是指不是原生基因的 任何基因，包括天然地不能同时发现的调控和编码序列。因此，重组基因可能包括来自不同 来源的调控序列和编码序列，或者来自同一来源的调控和编码序列，但是以不同于自然界 发现的方式排列。“内生基因”(Endogenous gene)是指原生基因位于有机体的基因组中的 天然位置。“外源”基因是指正常情况下不会在宿主有机体内发现的基因，但是通过基因转 移被引入该宿主有机体中。外源基因可包括被插入非原生有机体的原生基因，或重组基因。 “转基因”(transgene)是ー种通过转化程序被引入该基因组的基因。如使用于此，术语“表达”是指来自于本发明的核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA 的转录和持续累积。表达也可以是指mRNA翻译成多肽。通常，描述于此的重组DNA技术中的命名和实验室程序为本领域技术人员熟知。 标准技术被用于克隆，DNA和RNA分离，扩增和纯化。通常，涉及DNA连接酶，DNA聚合酶， 限制性内切酶等等的酶反应根据制造商的说明书进行。这些技术以及多种其他技术通常 根据 Sambrook et al. , Molecular Cloning—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)进行。适用于细菌培养物的日常维护和生长的材料和方法为本领域熟知。适用于以下例子的技术可以参考 Manual of Methods for General Bacteriology (Phi 11 ipp Gerhardt,R. G. E.Murray,Ralph N. Costilow,Eugene ff. Nester,Willis A.Wood, Noel R.Krieg and G.Briggs Phillips,eds. ), American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1994)。使用于此的术语“转化”是指核酸片段转移进入宿主有机体，导致基因的稳定遗 传。含有转化的核酸片段的宿主有机体是指“转基因”或“重组”，或“转化”有机体。对于 许多应用，比如异源基因，编码序列，或调控序列的引入，通常有必要将核酸序列引入各个 细胞中。许多这种方法是已知并且可被利用的，具体的选择取决于特定类型的细胞。用于E. coli菌株转化的感受态细胞可如下制备E. coli在S0B培养基 (Sambrook, J. , Russel, D. ff. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, N. Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press)中生长至 0D600 约为 0. 6-0. 8。该培养物浓缩100倍，冰冻的水洗涤一次，冰冻的10%甘油洗涤三次。然后将细 胞在150iiL的冰冻的10%甘油中重悬，平均分成每份50 ii L。这些小份可被立即用于标 准转化或储存于-80° C。这些细胞通过电穿孔法转化理想质粒。电穿孔之后，S0C培养 基(Sambrook, J. , Russel, D. ff. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3ed. 2001, Cold Spring Harbor, N. Y. :Cold Spring Harbor Laboratory Press)被立即加入细胞中。在 37° C下温育1小时。将该细胞涂平板至含有适当抗生素的LB平板上37° C温育过夜。例如，通过将酵母细胞转移进原生质体实现酵母细胞的转化，例如，使用裂解 酶，溶细胞酶，或蜗牛酶，接下来加入核酸和聚乙二醇(PEG)。该PEG处理过的原生质 体通过在生长培养基中培养再生，例如，在选择性条件下(参见，例如，Beggs, Nature 275:104-108(1978);and Hinnen et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933(1978)) 培养。另一种方法并不涉及细胞壁的去除，而是使用氯化锂或醋酸盐和PEG进行处理，然 后在选择性培养基中生长(参见，例如，Ito et al., J. Bact. 153:163-168 (1983)) 0关 于酵母转化，基因整合进入酵母基因组，以及酵母菌株的生长和筛选的种种方法在分子 生物学技术(Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1 and 2, Ausubel et al. , eds. , John Wiley & Sons, New York (1997)中已有描述。术语“质粒”和“载体”是指通常携带不属于细胞中心代谢的基因的外源的染色 体分子(element)，通常以环状双链DNA片段形式出现。这些分子可以是来自于任何来源， 单链或双链DNA或RNA的，线状或环状的，自主复制序列，基因组整合序列，噬菌体或核酸 序列，其中若干核酸序列已被连接或重组进入唯一的结构，该结构能够将启动子片段和DNA 序列与适当的3'未翻译序列一起引入细胞以形成选定的基因产物。“重组载体”是指特定 的载体，该特定的载体含有外源基因和除了外源基因之外的能够有利于特定宿主细胞转化 的分子。含有必要基因的重组有机体可使用本领域熟知的技术构建，该必要基因将编码酶 催化途径，以将可发酵的碳源底物转化成理想的有机产物，该熟知技术例如参见US-A-2007 0092957, US-A-20090239275, US-A-20090155870, US-A-20090155870, W0-A-2009/103533, U S-A-20090246842。经过基因改造以增加海藻糖产量的本发明的酵母菌株提高了对不同盐的耐受度。 菌株的耐受度可通过试验其在不同盐(包括氯化钠)的浓度下的生长进行评估，这些盐对于亲本菌株(基因改造之前)的生长有害。本发明中使用的发酵培养基含有适当的碳源底物。适当的底物包含，但不局限 于，单糖(例如葡萄糖和果糖)，低聚糖(例如乳糖或蔗糖)，多糖(例如淀粉或纤维素)或 其混合物，以及可再生的原料的未纯化的混合物，该原料例如乳清培养基(cheese whey permeate),玉米浆液，甜菜糖蜜，以及大麦芽。除了一种合适的碳源，发酵培养基通常含有适当的矿物质，盐，辅因子，缓冲液以 及其他本领域技术人员熟知的，适合于培养物的生长的，以及适合于促进生产理想的有机 化合物的必须的酶催化途径的成分。对于细胞培养，细胞通常是在合适的培养基中大约20-37° C范围内的温度下生 长。对于本发明有用的适当的生长培养基可以是常见的商业制备的培养基，例如包含酵母 氮源，硫酸铵和右旋糖(作为碳源/能源)的肉汤或Yro培养基，适用于大多数酿酒酵母菌株 生长的最佳比例的蛋白胨，酵母提取物和右旋糖的混合物。其他限定的或合成的生长培养 基也可以被使用，用于特定的微生物生长的合适培养基为微生物和/或发酵学科领域的技 术人员所知。发酵的适当pH范围通常在约3. 0-7. 5之间，其中初始条件的pH优选为约4. 5-6. 5 之间。产生于发酵培养基中的理想产物(例如乙醇)的量可使用本领域熟知的许多方法 测量，例如，高效液相色谱法(HPLC)或气相色谱法(GC)。US-A-7, 005, 291描述了一种适用于本发明的基因改造的例子，涉及一种从重组有 机体中产甘油的方法，包括将一表达盒(expression cassette)转化进入一适当的宿主细 胞，该表达盒包括(a)编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)活性的蛋白质的基因，和/或， (b)编码具有甘油-3-磷酸磷酸酶活性的蛋白的基因。该基因改造导致增强的甘油细胞内 累积。相应改造的微生物的生产的细节参阅US-A-7，005，291。术语“甘油-3-磷酸脱氢酶”和“G3PDH”是指具有催化磷酸二羟基丙酮(DHAP) 转化成甘油-3-磷酸(G3P)的酶活的多肽。体内的G3PDH可以是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH);还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH);或依赖型FAD (FAD-dependent)。例 如，该NADH-依赖型酶(EC 1. 1. 1.8)通过多个基因编码，包含GPD1 (GenBankZ74071x2), 或 GPD2(GenBank Z35169xl)，或 GPD3(GenBank G984182)，或 DARI(GenBank Z74071x2)。 该 NADPH-依赖型酶(EC 1. 1. 1. 94)通过 gpsA(GenBank U321643, (cds 197911-196892) G466746 和 L45246)编码。该 FAD-依赖型酶(EC 1. 1. 99. 5)通过⑶T2 (GenBank Z47047x23)，或 glpD (GenBank G147838)，或 glpABC (GenBank M20938)编码。术语“甘油-3-磷酸酶”，“sn-甘油-3-磷酸酶”或“d，1_甘油磷酸酶”和“G3P磷 酸酶”是指具有催化甘油-3-磷酸和水转化成甘油和无机磷酸的酶活的多肽。例如，G3P磷 酸通过 GPP1 (GenBank Z47047xl25)，或 GPP2 (GenBankU18813xll)编码。术语“GPP1”，“RHR2”和“YIL053W”可交换地使用，是指编码细胞质的甘油-3-磷 酸酶(cytosolic glycerol-3-phosphatase)的基因，并且具有SEQ ID N0:7的氛基酸序列。术语“6 2”，“11( 2”和“YER062C”可交换地使用，是指编码另一种细胞质的甘 油-3-磷酸酶的基因，并且具有SEQ ID N0:8的氨基酸序列。适用于本发明的其他基因是参与海藻糖代谢的基因。例如，从酵母，特别是啤酒酵母(Sacharomyces cerevisiae)编码具有海藻糖_6_磷酸合成酶功能的蛋白(例如相应 的酶)的基因。这些酶(以及他们的编码基因)中特别有用的代表是Tpslp，Tps2p, Tps3p和 Tsllp0适用于本发明的情况的表达特别是(inter alia)Tpslp的基因改造的微生物的更 多细节描述于US-A-5，422，254中，关于相应的改造的微生物的细节参考现有技术的文献。 Tpslp是海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶复合体的合成酶亚基，合成储存碳水化合物海藻 糖。在自然情况下，这种蛋白的表达通过应力条件诱导(例如渗透压)。Tps2p是酵母海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶复合体的磷酸酶亚基，合成储存碳水 化合物海藻糖。它的表达通过应力条件诱导(例如渗透压)。Tps3p是酵母海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶复合体的调控亚基，合成储存碳水化 合物海藻糖；这种蛋白的表达通过应力条件诱导(例如渗透压)。Tsllp是酵母海藻糖-6-磷酸合成酶(Tpslp) /磷酸酶(Tps2p)复合体的大亚基, 将尿苷_5’ - 二磷酸葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸转化成海藻糖。涉及海藻糖代谢的其他基因已知来自于细菌，特别是E. coli，例如，类似OtsA和 OtsB的海藻糖-6-磷酸合成酶基因。适用于本发明的其他基因是参与四氢嘧啶代谢的基因。编码在四氢嘧啶合 成中发挥作用的蛋白的基因的例子，例如，L-2，4-二氨基丁酸乙酰基转移酶(DABA acetyltransferase),催化L-2, 4_ 二氨基丁酸(DABA)的乙酰化作用形成具有乙酰辅酶A 的 Y-N-乙酉先-a, y - 二氨基丁酸(gamma-N-acetyl-alpha, gamma-diaminobutyric acid, ADABA), 二氨基丁酸-2-氧化戊二酸转氨酶(通过L-谷氨酸盐的转氨作用逆向催化L-天 冬氨酸0半缩醛(ASA)转化成L-2，4- 二氨基丁酸(DABA))，以及L-四氢嘧啶合成酶(催 化Y -N-乙酰-a，y - 二氨基丁酸(ADABA)的环化)。四氢嘧啶(1，4，5，6-四氢化-2-甲 基-4-嘧啶羧酸)是一种极好的渗透保护剂。四氢嘧啶生物合成基因已知来源于例如嗜盐细菌，比如嗜盐海球菌 (Marinococcus halophilus)。特定的例子包括 ectA, ectB 和 ectC ;进一步细节可 参 见“Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine from Marinococcus halophilus and osmoregulated expression in Escherichia coli. "Louis P. , Galinski E. A. ;Microbiology 143:1141-1149(1997)。适用于本发明的情况的其他基因参与运输机制，例如，导致渗透保护化合物的细 胞内摄入升高的各种ATP-依赖型运输蛋白和K+同向和逆向转运蛋白。这种基因的特定的 例子已知来自于，例如E. col i，并且包含ProV, Proff, ProX和ProP。ProV, ProW和ProX基因 表达的蛋白导致甜菜碱，脯氨酸和/或四氢嘧啶在细胞内的累积，并且是多组分结合蛋白 依赖性的(binding-protein-dependent)运输系统(尿蛋白运输proU transporter)的组 分，该系统充当甜菜碱/L-脯氨酸的运输者。ProP编码一种能够运输脯氨酸和甜菜碱的渗 透保护剂/质子同向转运剂，并且调节渗透保护剂的摄入，以适应渗透压的升高。适用于根据本发明的改造微生物的另一类基因结构涉及参与以胆碱进行甜菜碱 合成的基因。编码胆碱合成酶或甜菜碱-醛脱氢酶的基因的例子的代表已知来源于，例如 E. coli,并且包含 betA 和 betB。下表列出了在适用于本发明方法的微生物中表达的蛋白的特定例子。
表 权利要求
1.一种从水培养基中回收有机组分的方法，所述水培养基中含有产所述有机组分的微 生物，包括步骤(a)增加至少一种亲水溶质在所述水培养基的至少一部分中的浓度，使所述有机组分 在所述水培养基的该部分中的活性增加至所述有机组分在该部分中至少饱和；(b)从该部分中形成一富含所述有机组分的液相和一液体的富含水的相；以及(C)将富含所述有机组分的液相从富含水的相中分离；其特征在于，所述微生物被基因改造成与未改造的微生物相比能够耐受所述水培养基 的所述部分中更高浓度的至少一种亲水溶质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水培养基是发酵肉汤。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述有机组分是醇。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述醇是一种C3-C6的一元醇或二元醇。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述(3-(6的一元醇选自由1-丁醇，2-丁 醇，叔丁醇，异丁醇，1-戊醇，2-戊醇，3-戊醇，2-甲基-1-丁醇，3-甲基-1-丁醇，2-甲 基-2- 丁醇,3-甲基-2- 丁醇,2，2- 二甲基-1-丙醇，1-己醇，2-己醇，3-己醇，2-甲 基-I-戊醇，3-甲基-1-戊醇，4-甲基-1-戊醇，2-甲基-2-戊醇，3-甲基-2-戊醇，4-甲 基-2-戊醇，2-甲基-3-戊醇，3-甲基-3-戊醇，3，3- 二甲基-1- 丁醇，2，2- 二甲基-1- 丁 醇，2，3- 二甲基-1- 丁醇，2，3- 二甲基-2- 丁醇，3，3- 二甲基-2- 丁醇以及2-乙基-1- 丁 醇组成的组中。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述(3-(6的二元醇选自由1，2-丙二醇， 1，3-丙二醇，1，2- 丁二醇，1，3- 丁二醇，2，3- 丁二醇以及1，4- 丁二醇组成的组中。
7.如前述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述亲水溶质选自由盐，氨基 酸，水溶性溶剂，糖及其组合组成的组中。
8.如前述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述微生物具有导致至少一种 渗透剂在所述微生物的细胞质内增强累积的基因改造。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述渗透剂选自由海藻糖，甜菜碱，脯氨 酸，丙三醇和四氢嘧啶组成的组中。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述微生物被改造成表达一种选自由Tps 1，Tps2，Tps3，Tsll，GPD1，GPD2，HOR2，RHR2ectA，ectB，ectC，otsA，otsB，ProV, ProW, ProX, P roP，betA以及betB组成的组中的一种或多种基因的蛋白。
11.如前述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述微生物选自由细菌和酵母 组成的组中。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酵母选自由构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)，黑 曲霉(Aspergillus niger)，米 曲霉(Aspergillus oryzae),白色念珠菌(Candida albicans), Chrysosporium lucknowense，禾谷 德抱菌(Fusarium graminearum),德抱霉(Fusarium venenatum),乳酸克鲁维酵 母(Kluyveromyces lactis)，粗糖脉抱菌(Neurospora crassa)，安格斯毕赤酵母 (Pichia angusta)，Pichia finlandica，Pichia kodamae，膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)， Pichia methanolica， Pichia opuntiae，巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)， Pichia pijperi， Pichia quercuum， Pichia salictaria， Pichiathermotolerans, Pichia trehalophila，Pichia stipitis，产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)，金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)，Streptomyces aureus，贝 酵母(Saccharomyces bayanus)， Saccharomycesboulardi,酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)， Streptomyces fungicidicus， Streptomyces griseochromogenes， 灰色链霉菌(Streptomyces griseus)，变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)， Streptomyces olivogriseus, 枝 链 霉 菌(Streptomyces rameus)， Streptomyces tanashiensis，Streptomyces vinaceus，以及瑞氏木霉(Trichoderma reesei)组成的组 中。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细菌选自由枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)，解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefacines),产氨短杆 菌(Brevibacterium ammoniagenes)， Brevibacterium immariophilum， Clostridium beigerinckii，丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)，丁酸杆菌(Clostridium butylicum)，阪崎氏肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，大肠杆菌(Escherichia coli)， 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti),绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa),Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica，Rhodobacter capsulatus，球形红菌(Rhodobacter sphaeroides)，深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum),肠道沙门氏菌(Salmonella enterica),伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)， Salmonella typhimurium，痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)，弗氏志贺菌(Shigella flexneri)，索氏志贺菌(Shigella sonnei)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以 及 hydrocarbonoclastic bacteria 组成的组中。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述hydrocarbonoclasticbacteria选 自由食减菌，解环菌，海杆菌，Neptunomonas, Oleiphilus，Oleispira 和 Thalassolitus 组 成的组中。
15.如前述任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，进一步包括步骤(d)进一步从富含所述有机组分的液相中纯化出所述有机组分。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)包括富含所述有机组分的液 相的蒸馏。
17.—种生产有机组分的方法，其特征在于，包括步骤(A)在发酵培养基中培养一种微生物以通过所述微生物产生所述有机组分；(B)釆用如权利要求1-16中任一项所限定的从水溶液中回收有机组分的方法，从所述 发酵培养基的至少一部分中回收由所述微生物释放到所述发酵培养基中的有机产物。
全文摘要
本发明涉及一种从例如发酵肉汤的水培养基中回收有机组分的方法，所述水培养基含有产所述有机组分的微生物。该方法包括通过增加培养基中导致该有机组分盐析的至少一种亲水溶质的浓度来增强水培养基中的有机组分的活性。与未改造的相应微生物相比，该微生物被基因改造成能够耐受培养基中更高的浓度。
文档编号C12P7/18GK102666863SQ201080056900
公开日2012年9月12日 申请日期2010年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者伊利娅·米肯伯格, 伯恩哈德·克奈塞尔, 弗朗茨·尼尔利希, 沃尔特·伯格-克利 申请人:思德力公司