专利名称：多能细胞的诱导的制作方法
多能细胞的诱导对相关申请的交叉引用本申请根据35U. S. C. § I. 119(e)要求2009年10月16日提交的美国临时申请号61/252，548的权益，该美国临时申请的内容通过弓I用整体并入。
背景技术：
产生人诱导多能干细胞(iPSC)的最新进展(Takahashi, K.等，Cell 131,861-72(2007) ；Yu, J.等，Science 318，1917-20 (2007) ;Muller，L. U. W.，等，Mol. Ther. 17，947-53(2009))，已经唤起了它们在生物医学研究和临床应用中实用的希望。但是，iPSC产生仍然是非常慢的(约4周)且低效的(<0.01% (Takahashi, K.等，Cell 131，861-72(2007) ；Yu, J.等，Science 318,1917-20(2007))过程，该过程产生异质细胞群体。从这样的混合物中鉴别出完全重编程序的(repTOgrammecOiPSC是使人厌烦的，且需要在人多能细胞培养方面的专门技能。尽管正在克服外源性重编程序因子的基因组插入的危险，但是重编程序的低效率和缓慢动力学继续代表着人iPSC的最终应用的难克服的问题。例如，在重编程序过程中，可能发生遗传的或后生的异常的增加，其中肿瘤抑制因子可能被抑制，致癌途径可能被激活。尽管最近的研究已经报道，除了最初的4种因子以外，通过遗传操作来提高重编程序的效率(Feng，B.等，Cell Stem Cell 4，301-12 (2009))，但是这样的操作通常使得该过程甚至更复杂，并会增加遗传改变和致瘤性的风险。因而，仍然存在对更安全的、更容易的且更有效的人iPSC生产以及促进对重编程序的基本机理的鉴定和表征的方法的巨大需求。
发明内容
本发明提供了混合物(例如，可用于诱导iPSC)。在一些实施方案中，所述混合物包含哺乳动物细胞；TGF P 受体 /ALK5 抑制剂；MEK抑制剂；和Rho GTP酶/ROCK途径抑制剂。在一些实施方案中，至少99%的细胞是非多能细胞。在一些实施方案中，所有或基本上所有的细胞是非多能细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述TGFP受体/ALK5抑制剂是SB431542。在一些实施方案中，所述MEK抑制剂是ro0325901。在一些实施方案中，所述ROCK抑制剂是具有下式的化合物权利要求
1.一种混合物，其包含 哺乳动物细胞； TGF ^受体/ALK5抑制剂； MEK抑制剂；和 ROCK抑制剂。
2.根据权利要求I所述的混合物，其中至少99%的细胞是非多能细胞。
3.根据权利要求I所述的混合物，其中基本上所有的细胞是非多能细胞。
4.根据权利要求I所述的混合物，其中所述细胞是人细胞。
5.根据权利要求I所述的混合物，其中所述TGFP受体/ALK5抑制剂是SB431542。
6.根据权利要求I所述的混合物，其中所述MEK抑制剂是PD0325901。
7.根据权利要求I所述的混合物，其中所述ROCK抑制剂是具有下式的化合物
8.根据权利要求I所述的混合物，其中所述ROCK抑制剂具有下式
9.根据权利要求I所述的混合物，其中所述ROCK抑制剂具有下式
10.根据权利要求I所述的混合物，其中所述ROCK抑制剂是
11.根据权利要求I所述的混合物，其中当使所述混合物处于足以诱导所述混合物中的非多能细胞转化成诱导多能干细胞的条件下时，所述抑制剂的浓度足以使将所述细胞诱导成诱导多能干细胞的效率提高至少10%。
12.根据权利要求I所述的混合物，其中所述混合物另外包含GSK3抑制剂。
13.一种将非多能哺乳动物细胞诱导成诱导多能干细胞的方法，所述方法包括 在足以诱导至少一些细胞变成多能干细胞的条件下，使非多能细胞接触TGF ^受体/ALK5抑制剂； MEK抑制剂；和 ROCK抑制剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述条件包括将至少一种外源性转录因子导入所述非多能细胞中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一种外源性转录因子是Oct多肽，且所述细胞进一步接触组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述转录因子选自由以下组成的组0ct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽。
17.根据权利要求14所述的方法，所述方法包括将至少2、3或4种外源性转录因子导入所述非多能细胞中，其中所述转录因子选自由以下组成的组=Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽和Sox多肽。
18.根据权利要求14所述的方法，其中通过将多核苷酸导入所述非多能细胞中来导入所述至少一种转录因子，其中所述多核苷酸编码所述至少一种外源性转录因子，从而在所述细胞中表达一种或多种所述转录因子。
19.根据权利要求14所述的方法，其中通过使外源性多肽接触所述非多能细胞来导入所述至少一种转录因子，其中所述多肽包含所述转录因子的氨基酸序列，其中在将所述多肽导入所述细胞的条件下进行所述导入。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述多肽包含增强跨细胞膜转运的氨基酸序列。
21.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
22. 根据权利要求13所述的方法，其中所述TGFP受体/ALK5抑制剂是SB431542。
23.根据权利要求13所述的方法，其中所述MEK抑制剂是TO0325901。
24.根据权利要求13所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是具有下式的化合物
25.根据权利要求13所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是具有下式的化合物
26.根据权利要求13所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是具有下式的化合物
27.根据权利要求13所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是
28.根据权利要求13所述的方法，其中当使所述混合物处于足以诱导所述混合物中的非多能细胞转化成诱导多能干细胞的条件下时，所述抑制剂的浓度足以使将所述细胞诱导成诱导多能干细胞的效率提高至少10%。
29.根据权利要求13所述的方法，其中所述混合物另外包含GSK3抑制剂。
30.一种用于诱导非多能哺乳动物细胞中的多能性的试剂盒，所述试剂盒包含 TGF ^受体/ALK5抑制剂； MEK抑制剂；和 ROCK抑制剂。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述TGFP受体/ALK5抑制剂是SB431542。
32.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述MEK抑制剂是H)0325901。
33.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述ROCK抑制剂是具有下式的化合物
34.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述ROCK抑制剂是具有下式的化合物
35.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述ROCK抑制剂是具有下式的化合物
36.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述ROCK抑制剂是
37.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述试剂盒另外包含GSK3抑制剂和/或组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。
全文摘要
用于产生人诱导多能干细胞(iPSC)的重编程序方法的缓慢动力学和低效率对它们在生物医学应用中的实用性产生重大限制。我们在这里描述了一种化学方法，其在处理7天内，显著提高(＞200倍)从人成纤维细胞产生iPSC的效率。这将为开发更安全的、更有效的、非病毒性的对人的体细胞重编程序的方法提供基础。
文档编号C12N5/00GK102741394SQ201080056597
公开日2012年10月17日 申请日期2010年10月15日 优先权日2009年10月16日
发明者丁生, 林通翔 申请人:斯克里普斯研究所