专利名称：用于灵菌红素生物合成的缩合酶的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药相关的基因工程领域，涉及一种用于灵菌红素生物合成的缩合酶。
背景技术：
灵菌红素是一类主要由一些放线菌、沙雷氏菌及其它海洋细菌产生的具有重要生物活性的典型次级代谢产物。含甲氧基三吡咯环组成的基本骨架结构，具有抗细菌、抗疟疾、抗真菌、抗原生动物等生物活性。近年来，发现其具有特效的免疫抑制和抗癌活性，其中灵菌红素类似物GX15-070(0batoclaX)，在临床上已被用于治疗多种癌症，主要作用机理在于①作为细胞内PH值调节器；②具有铜离子诱导DNA裂解活性激活蛋白激酶(MAPK)作为细胞有丝分裂的调节剂；④作为细胞周期的抑制剂。另外国内外研究还表明灵菌红素 及其类似物在水体污染治理，特别是由各种藻类造成的海洋赤潮和淡水水华等方面具有极佳的治理效果，且不会给水体环境带来二次污染。灵菌红素及其类似物作为生态染料，在羊毛、腈纶等纺织品染色方面，具有较好的色牢度、上染率及抗菌性能。基于灵菌红素特效免疫抑制和抗癌活性，它的合成成为研究的热点。现主要采用两种途径化学合成和生物合成。①化学合成法从二十世纪六十年代，就有关于灵菌红素化学合成的报道，后来研究者陆续报道了不同工艺路线，大多是通过对现有的灵菌红素分子进行化学改性，合成新的灵菌红素类似物，已有研究表明通过化学合成的一些灵菌红素结构类似物较灵菌红素更为高效低毒，比如类似物GX15-070(0batoclaX)，已进入II期临床试验，但产量产率均较低。生物法合成灵菌红素具有对环境友好、成本低等优点，备受关注。目前国内外较多关于发酵生产灵菌红素的研究报道，主要从菌株选育、营养条件、环境因素、培养方式、反应设备等方面进行考察，产量差异很大。通过对灵菌红素的生物合成途径深入研究，发现在参与灵菌红素的基因约有二十个左右，在不同生物体中不尽相同，但均组成基因簇。主要存在四种不同的基因簇组成，每个基因簇基因组成。一些研究表明组成灵菌红素合成的基因簇的一些酶，表现出对底物利用和产物形成的灵活性，其中催化灵菌红素合成最终步骤的灵菌红素缩合酶PigC，在催化前体2-甲基-3-戊基吡咯(MAP)和4-甲氧基-2,2, - 二吡咯-5-羧甲基乙醛(MBC)合成中灵菌红素过程中，也表现出松弛的底物专一性，具有催化前体类似物合成灵菌红素类似物的能力，属于典型的混杂酶，在利用组合生物合成方法开发灵菌红素类似物中将起到关键作用，并在混杂酶机理研究及生物制药方面具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于灵菌红素生物合成的缩合酶，实现开发高效合成灵菌红素及类似物的基因产品奠定基础。本发明所述的一种用于灵菌红素生物合成的缩合酶，其氨基酸序列如SEQ IDNo. I所示,其相应的DNA序列如SEQ ID No. 2所示。
本发明从Serratia marcescens菌株中提取总DNA,采用分段克隆方法获得灵菌红素缩合酶基因全长,分析测定核苷酸序列并研究其特性。第一步，基因组DNA提取将Serratia marcescens jx_l (中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CGMCC4074)菌种过夜培养于LB液体培养基中，收集菌体重悬于TE溶液中，分别利用溶菌酶、蛋白酶K和10% SDS裂解菌体，再采用等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 I)抽提去除蛋白质，重复两次，再用0.6倍体积的异丙醇沉淀，用75%的乙醇洗涤，自然风干，加适量ddH20溶解，4 °C储存备用。 第二步，PCR分段扩增我们根据Genbank数据库中公布来源于Serratia marcescens的PigC序列,利用Premier5. 0 软件设计了四条引物，分别为引物 I :5’-tggatccgaggtgatgtcatgaatc_3’ (BamHI),引物 2 :5，-agccccatggttttgatcgccgggccatg-3’ (NcoI),引物 3 :5，-cccggcgatcaaaaccatggggct-3，(NcoI)，引物 4 :5，_taaagcttcgcatcaccttcgttg_3，(HindIII)。米用分段克隆的方法，获得PigC基因的全片段。第三步，大肠杆菌感受体细胞的制备从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37°C振荡培养过夜。取2mL菌液转接到一个含有50mL LB培养液锥形瓶中，37°C振荡培养2小时，菌体OD约在0. 3至0. 6之间，培养液冰浴5min后，4°C 5000g离心5min，用预冷的去离子水洗涤沉淀，4°C 5000g离心5min。沉淀加入2ml预冷的0. 05mol/L CaC12_15%甘油混合溶液，轻柔重悬，冰浴5min,4°C 5000g离心5min,沉淀加入2ml预冷的0. 05mol/L CaC12-15*%甘油混合溶液，轻柔重悬，即成为感受态细胞悬液。分装成50 100 ill的小份，贮存于_70°C备用。第四步，重组菌DH5a (pUC18_pigC)的构建碱裂解法提取pUC18质粒，利用限制性内切酶BamHI、HindIII同时酶切pUC18和pigC，再用连接酶在4°C条件下，连接过夜，转化感受态细胞DH5 a，经酶切验证。第五步，灵菌红素缩合酶的序列测定及分析本发明对阳性克隆委托上海生物工程有限公司进行核苷酸的序列测定，并注册于Genbank数据库，注册号HQ833702。将其编码的氨基酸序列，通过BlastP工具在NCBI蛋白质序列数据库(http://www.ncbi.nlm.gov)中进行同源性搜索,并利用Clustal W程序进行多重序列比对，利用MEGA4. 0软件,采用相邻连接方法(Neighbor Joining Method),获得该蛋白系统进化树。本发明实现的有益效果本发明所述的用于灵菌红素生物合成的缩合酶，是从高产灵菌红素菌株Serratiamarcescens jx_l获得，它可催化前体物质MAP (2_甲基-3-戊基吡咯)和MBC (4-甲氧基-2，2' - 二吡咯-5-羧甲基乙醛)类似物合成灵菌红素类似物，开发更为高效低毒的抗癌药物。
具体实施例方式以下详细描述本发明的技术方案。
实施例第一步，基因组DNA的提取I)细菌培养Serratia marcescens jx_l菌株接种于5ml液体培养基中,37°C摇床(300rpm)培养过液。2)细菌收集取Iml培养物于I. 5ml Eppendorf离心管中，室温8000rpm离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于Iml TE (pH8. 0)中。3)菌体裂解加入6 u I 50mg/ml的溶菌酶，37°C作用2h。再加2mol/LNaC150 U 1，10% SDS110iil，20mg/ml的蛋白酶K 3 yl，50°C作用3h或37°C过夜。(此时菌液应为透明粘稠液体)4)抽提菌液均分到两个I. 5ml EP管，加等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心lOmin，抽提三次。(上清很粘稠， 吸取时应小心，最好枪头尖应剪去)5)沉淀加0. 6倍体积的异丙醇,混勻，室温放置lOmin。12000rpm离心lOmin。6)洗涤沉淀用75 %的乙醇洗涤。7)自然风干后，溶于50 U I ddH20中，取2-5 yl电泳。作PCR模板用。第二步，pigC基因片段的PCR扩增我们根据Genbank数据库中公布来源于Serratia marcescens的PigC序列,利用Premier5. O 软件设计了四条引物，分别为引物 I :5’-tggatccgaggtgatgtcatgaatc_3’ (BamHI),引物 2 :5，-agccccatggttttgatcgccgggccatg-3’ (NcoI),引物 3-5，-cccggcgatcaaaaccatggggct-3，(NcoI),引物 4-5，_taaagcttcgcatcaccttcgttg_3，(HindIII)。米用分段克隆的方法，获得PigC基因的全片段。具体的扩增体系和程序见表I和表2。表IpigC基因的扩增体系 Sa iiliiiiiiiliiiiiiiliiiiiiiliiii ggSggSggSgggigggigggigggigggigggigggigggiSV^^^
试剂(pL)pigC-FpigC-BpigC
lOxbuffer(pfu)55
I Oxbuffer(Taqplus)5 IOmMdNTPIII
10nmol/L引物 III
10nmol/L 引物2I
10(j_mol/L 引物3I
10nmol/L 引物4II
模板2(基因组DNA)2(基因组DNA)2(pigC-F, pigC-B)
无菌水39.539.5
PfuDNA 聚合酶0.50.5
TaqplusDNA 聚合酶0.5
总反应体积50pL表2表IpigC基因的扩增程序
程序pigC-FpigC-BpigC
预变性一95°CIOminIOmin3 min
变性一95°CIminIminImin
复性65°C/45s60 °C/45 s50°C/45s
延伸一72°CI min30s2min30s4min 循环数 30第三步，重组菌DH5a (pUC18_pigC)的构建碱裂解法提取pUC18质粒，利用限制性内切酶BamHI、HindIII同时酶切pUC18和PigC,分别进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，具体操作参照试剂盒。再用连接酶在4°C条件下，连接过夜，具体酶切连接体系见表3。采用热击法转化感受态细胞DH5 a，37°C下培养lh，涂布于带氨苄抗性的LB平板上，挑选单菌落进行液体培养后，酶切验证。表3酶切与连接体系
权利要求
1.一种用于灵菌红素生物合成的缩合酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.根据权利要求I所述的用于灵菌红素生物合成的缩合酶，其特征在于所述的缩合酶相应的DNA序列如SEQ ID No. 2所示。
全文摘要
一种用于灵菌红素生物合成的缩合酶，是从高产灵菌红素菌株Serratia marcescens jx-1(CGMCC 4074)获得，它可催化前体物质MAP和MBC类似物合成灵菌红素类似物，开发更为高效低毒的抗癌药物。
文档编号C12N15/52GK102653732SQ20111005172
公开日2012年9月5日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者刘晓侠, 孙诗清, 王玉洁 申请人:嘉兴学院