无载体固定化培养微生物絮凝剂的方法

专利名称：无载体固定化培养微生物絮凝剂的方法
技术领域：
本发明涉及微生物与细胞工程技术领域，尤其是涉及一种利用自絮凝菌在摇床中不借助载体介质进行无载体固定化培养、同时产生絮凝率较好的微生物絮凝剂的方法。
背景技术：
微生物絮凝剂是微生物的代谢产物，并不是微生物生存所必需的，而是它对环境的应激反应。它是利用微生物技术，由细菌、真菌等微生物发酵获得的，是一类具有絮凝效果的高效、无毒、无二次污染的水处理剂。相对于无机高分子和合成有机高分子絮凝剂，微生物絮凝剂具有使用方便、絮凝范围广、活性高、安全无毒、不污染环境的特点，对大肠杆菌、酵母、泥浆水、河水、粉煤灰水、活性碳粉水、膨胀污泥、纸浆废水等均有极好的絮凝和脱色效果，可广泛用于畜产废水、膨化污泥、有色废水的处理。因此微生物絮凝剂的研究是当今世界絮凝剂方面研究的重要课题。通过构建能产高效的复合菌群并对絮凝菌进行固定化，经研究发现，利用海藻酸钙包埋后的微生物絮凝菌能在较长时间内保持较高的活性， 且固定化后的细胞对染料废水具有较好的脱色效果。如果对固定化菌群不断地重新培养复活，可达到连续生产微生物絮凝剂的目的。为提高絮凝剂的絮凝率，现在主要有两种方法1、优化复合型絮凝剂。发明专利“新型复合絮凝剂及其制备方法(CN03115197. 3)”指出，将30— 40份硫酸亚铁铁晶体和10— 40份的硫酸铝混合均勻，边搅拌边加入98%硫酸10-15份，冷却至常温后慢慢加入 6-20份双氧水，慢速搅拌后静置，制得一种复合絮凝剂。该种絮凝剂对卤制品废水的脱色和化学需氧量(chemical oxygen demand, COD)去除效果明显，但是该絮凝剂不能长期保存， 需要随配随用，不易保存；2、选育能够产生高效絮凝剂的菌株。论文《一种高效微微生物絮凝剂产生菌的筛选及培养基优化》指出，经过多次传代培养与纯化，从活性污泥中挑选出一株具有絮凝活性的菌株MBF-33，该菌株所产的絮凝剂对高岭土悬浮液体系有较好的絮凝作用。通过培养基优化后，对高岭土悬浊液的絮凝率从81. 3%提高到95%。上述两种方法制取絮凝剂均需分离菌体与絮凝剂，在实际生产过程中会增加分离成本。固定化细胞培养是利用物理或化学手段将游离的细胞或酶与固态的不溶性载体相结合，使其保持活性并可反复使用的一种技术。与传统分批游离发酵相比，固定化细胞培养技术具有细胞负荷高、生物催化高效、细胞可反复使用等优点，易于实现细胞与产物分离，有利于实现工艺过程的自动化、连续化，降低生产成本。具体表现在(1)生物反应器中可以获得极高的菌体浓度，因而发酵速率可以大大提高，生物反应器设备的生产强度得以强化；(2)产物分离纯化过程中，菌体与发酵液的分离十分容易；(3)固定化培养出的菌体可以重复或长期使用，这样既能够简化游离细胞培养过程中，需要不断培养菌体的操作步骤，又减少了营养物质的浪费，提高了生产率。
目前，已存在的固定化培养方法主要为微载体细胞培养法(专利《一种新型米根霉固定化发酵载体单元》)。这种培养方法是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的微载体(支撑材料)，使细胞在微载体表面附着和生长，并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。但是，影响细胞在微载体表面生长的因素很多，主要包括三个方面(1)细胞群体大小、状态和类型。(2)微载体表面状态、吸附的分子类型。(3)培养基组成、温度、pH以及代谢废物。另外，传统的载体固定化细胞技术还存在以下问题1、生理方面载体材料有时会对细胞产生比较大的生理毒性，影响目标代谢物的生物合成；2、生态方面载体材料使细胞和小细胞群体相互分隔，这样容易形成不利于细胞之间彼此协调的环境，影响代谢产物的生物合成；3、工艺方面载体固定化细胞的大规模制备过程复杂，容易引起杂菌感染；4、工程方面一方面载体固定化细胞的传质性能较差，外部营养基质和内部代谢产物浓度梯度较大，使其整体活性较低，另一方面生物反应器中流体流动的冲刷和代谢过程内部所产气体的胀裂还会造成载体固体化细胞的破裂，影响其连续使用的寿命；5、经济方面 载体材料的使用和不断消耗带来了附加成本。所以载体固定化细胞技术尚未出现真正大规模工业化应用的实例。基于以上问题，人们提出了无载体固定化细胞培养技术。无载体固定化细胞培养技术具有非常突出的优点，具体表现为1、方法非常简单，可以在生物反应器中逐级扩大培养，降低细胞培养过程的附加成本；2、自絮凝细胞颗粒内部结构松散，传质阻力很小，而且颗粒内部表面不断自我更新，颗粒整体活性非常好；3、在一定的生理、生态、物理、化学和流体力学条件下，小颗粒的絮凝和大颗粒的解离可以呈动态平衡，故不存在载体固定化细胞的强度问题，如发明专利“米根霉无载体固定化细胞培养方法(CN. 101157894A)”，但是该方法必须使用化学性质稳定的甲基硅油作为添加剂，以达到菌体形态均一规则的目的，这就增加了工业无载体固定化培养的附加成本。综上所述，无载体固定化技术具有操作简便、 不消耗辅助材料、生物反应器中菌体浓度高、发酵强度大、连续使用寿命长等优点，展示了良好的工业化应用前景。不足的地方是需要使用细胞生长和代谢产物生物合成所需营养物质以外的化学物质。(引自论文《无载体固定化细胞的研究进展》)。

发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简便、培养成本低、培养时间短、菌体与代谢产物分离方法简单的无载体固定化培养微生物絮凝剂的方法，本方法在不需添加额外添加剂的情况下，就可实现高效率微生物絮凝剂产生菌的规模生产，而且培养所得的菌丝球与微生物絮凝剂均可产生絮凝作用。本发明的目的是这样实现的
一种无载体固定化培养微生物絮凝剂的方法，特征是在培养基中加入占培养基体积 0. 1%-1%的自絮凝菌孢子悬浮液，其中每毫升悬浮液中含自絮凝菌孢子IO6个，放入摇床中培养发酵，培养条件:150-180转/min,温度20-30°C，pH 3. 5—10. 5，培养24-120小时后，将由自絮凝菌生成的菌丝球与发酵液静置分离，固体部分是菌丝球，液体部分是微生物絮凝剂；所述培养基为C:N=5 :1-30:1，硝酸钠1-10 g/L，磷酸氢二钾0. 1-2 g/L，硫酸镁 (MgSO4 ·7Η20) :0. 1-0. 5 g/L，硫酸亚铁0. 01 g/L,蔗糖是碳源；氯化钾0. 1-60 g/L 和氯化钠0. 03—30g/L中的一种或两种。所述培养基中含有氯化钾为30-50 g/L或含有氯化钠10—25g/L。所述的自絮凝菌为曲霉中的米曲霉、土曲霉、酱油曲霉中的一种或多种混合物。
本发明是以蔗糖作为碳源，硝酸钠为氮源，利用自絮凝菌能形成菌丝球的特点，通过控制培养基中的盐分，使自絮凝菌产生应激反应，达到丝状菌产微生物絮凝剂目的，通过本方法制备的微生物絮凝剂有如下优点①成本低，用无机氮源替代价高的有机氮源，②微生物絮凝剂与菌体的分离仅需静置而无需目前常用的离心分离的方法。③生产条件粗放， 能产生微生物絮凝剂的pH、C:N适应范围较大，在pH:3. 5 10. 5、C:N=5:1 30:1的范围内皆能产生微生物絮凝剂，容易实现大规模培养。④絮凝活性高，发酵产生的微生物絮凝剂，在高岭土絮凝实验中絮凝效率在95%左右，染料废水实验中的脱色率在拟％左右，可以用于处理多种印染废水。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。实施例1
在500ml的锥形瓶中加入蔗糖30g/L，硝酸钠lg/L，磷酸氢二钾lg/L，硫酸镁 (MgS04 ‘ 7H20) 0. lg/L，硫酸亚铁 0. 01g/L，氯化钾60g/L，氯化钠 30g/L 的 300ml 查氏完全培养基，并加入接种量为3ml的米曲霉悬浮液，每毫升悬浮液中含自絮凝菌孢子IO6 个，放入摇床中培养发酵，摇床控制在温度为30°C，转速150r/min，pH为5，培养Mh，将由自絮凝菌生成的菌丝球与发酵液静置分离，固体部分是菌丝球，液体部分是微生物絮凝剂。实施例2:
在500ml的锥形瓶中加入蔗糖20g/L，硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁 (MgS04 ·7Η20) :0. 5g/L，硫酸亚铁0. 01g/L，氯化钾:50g/L的300ml发酵培养基，并加入接种量为6ml的酱油曲霉悬浮液，每毫升悬浮液中含自絮凝菌孢子IO6个，摇床控制在温度为30°C，转速180r/min，在不同pH值下培养36h ，将由自絮凝菌生成的菌丝球与发酵液静置分离，固体部分是菌丝球，液体部分是微生物絮凝剂。酱油曲霉发酵制备微生物絮凝剂对高岭土、染料废水絮凝效率的测定。结果如表 1
表1 不同PH值条件下发酵培养微生物絮凝的絮凝性能比较
权利要求
1.一种无载体固定化培养微生物絮凝剂的方法，特征是在培养基中加入占培养基体积0. 1%-1%的自絮凝菌孢子悬浮液，其中每毫升悬浮液中含自絮凝菌孢子IO6个，放入摇床中培养发酵，培养条件:150-180转/min,温度20-30°C，pH 3. 5—10. 5，培养24-120小时后，将由自絮凝菌生成的菌丝球与发酵液静置分离，固体部分是菌丝球，液体部分是微生物絮凝剂；所述培养基为C:N=5 :1-30:1，硝酸钠1-100 g/L，磷酸氢二钾0. 1-2 g/L，硫酸镁(MgSO4 · 7H20) :0. 1-0. 5 g/L，硫酸亚铁0. 01 g/L,蔗糖是碳源；氯化钾0. 1-60 g/ L和氯化钠0. 03—30g/L中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的无载体固定化培养微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述培养基中含有氯化钾为30-50 g/L和含有氯化钠10—25g/L中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的无载体固定化培养微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的自絮凝菌为曲霉中的米曲霉、土曲霉、酱油曲霉中的一种或多种混合物。
全文摘要
本发明公开了一种无载体固定化培养微生物絮凝剂的方法，特征是培养基中加入占培养基体积0.1%-1%的自絮凝菌孢子悬浮液，其中每毫升悬浮液中含自絮凝菌孢子106个，放入摇床中培养发酵，培养条件150-180转/min,温度20-30℃，pH3.5-10.5，培养24-120小时后，静置，使由自絮凝菌生成的菌丝球与发酵液分离，固体部分是菌丝球，液体部分就是微生物絮凝剂。本发明是以蔗糖作为碳源，硝酸钠为氮源，利用自絮凝菌能形成菌丝球的特点，通过提高培养基中的盐浓度，使自絮凝菌产生应激反应，达到自絮凝菌产微生物絮凝剂的目的，通过本方法制备的微生物絮凝剂具有成本低、生产条件粗放、絮凝活性高的优点，可以用于处理多种印染废水。
文档编号C12P1/02GK102174582SQ201110053509
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月7日 优先权日2011年3月7日
发明者周松, 曾建忠, 林俊岳, 胡萃, 贺根和, 陈红梅, 黄翔峰 申请人:井冈山大学