专利名称：一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗和制备方法
技术领域：
本发明涉及分子免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗和制备方法。
背景技术：
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)为革兰氏阴性杆菌，属于爱德华氏菌属。 近年来大量报道表明，迟缓爱德华氏菌是一种重要的鱼类病原菌，能够感染多种海水和淡水鱼类，包括牙鲆、鲤鱼、鳗鱼、鲶鱼、大菱鲆、罗非鱼等，由此对水产养殖业造成严重经济损失。除了水生动物外，迟缓爱德华氏菌还能感染人类，引起胃肠炎、肌肉坏死等病症。目前， 尚无针对迟缓爱德华氏菌的商业化疫苗，迟缓爱德华氏菌病防治主要依赖抗生素类药物的使用。由于抗生素应用所带来的各种不良后果，其使用已在国际上受到限制。在这种情况下，迟缓爱德华氏菌病的非抗生素控制研究，包括疫苗研发，具有重要意义。亚单位疫苗是一种常见的疫苗形式，这种疫苗通常为病原体的一个蛋白成分，能够诱发特异性强的免疫反应。亚单位疫苗的缺点是其自身诱发的免疫保护效应较低；对于纯化的蛋白质性亚单位疫苗而言，通常需要配以佐剂才能达到理想的免疫效应。由于商业佐剂使用成本较昂贵，因此如何解决佐剂问题也是亚单位疫苗应用所必须考虑的问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗和制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗其疫苗抗原为由序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示。其抗原为转化了重组质粒PETOH的大肠杆菌表达的重组蛋白。所述重组质粒pETOH，以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F3/R1为引物进行PCR 扩增，PCR产物与PCR克隆载体pBS-T连接后得质粒pBSOH ；将质粒pBSOH用NdelAhoI双酶切回收0. 5kb,同时将质粒pBT258用NdeIAhoI双酶切回收4. 61Λ片段，将回收的两片段用T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETOH ；所述弓丨物为F3 5，-GCGCATATGTCATTGACACAACTAGGT-3，和 Rl 5，-CGATATCCTCGAG TATAACCTGTTTCAATACTTGA-3’。迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备1)质粒pETOH的构建以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F3/R1为引物进行PCR 扩增，PCR产物与PCR克隆载体pBS-T连接后得质粒pBSOH ；将质粒pBSOH用NdelAhoI双酶切回收0. 5kb,同时将质粒pBT258用NdeIAhoI双酶切回收4. 61Λ片段，将回收的两片段用T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETOH ；所述弓丨物为F3 5，-GCGCATATGTCATTGACACAACTAGGT-3，和 Rl 5，-CGATATCCTCGAG TATAACCTGTTTCAATACTTGA-3‘；2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化将质粒pETOH转化大肠杆菌BL21(DE3)，得转化子BL21/pET0H ；将BL21/pET0H于含有Kn (50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取过夜后的培养液加入新鲜的LB液体培养基中，于37°C培养至0D_为0. 6，加入终浓度为ImM的IPTG 并于37°C继续培养4-5h，然后在菌液中加入裂解液，室温摇动1-2小时；将菌液离心，回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即得具有序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列的亚单位疫苗蛋白。将上述得到亚单位疫苗蛋白在PBS中稀释至250ug/ml，而后将稀释的疫苗蛋白与佐剂等体积混合。所述佐剂为将5 % (质量比)NaOH和5 % (质量比)Al2 (SO4) 3以2 5体积比混合，将混合物离心后悬浮于PBS中至0. 2mg/ml。本发明具有如下优点1.高保护效应。本发明所得疫苗保护效应可达83%。2.应用时无需配以商业化佐剂。本发明的铝佐剂制备异常简单，造价低廉，并且具有高效免疫增强作用，故可替代商业化佐剂。
图1为本发明实施例提供的纯化的亚单位疫苗(泳道2)。图1 泳道1为蛋白分
子量标准。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。 2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。实施例1迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗抗原为序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列所示(参见序列表1)。序列表1MSLTQLGDGKEFKVKKWLYAAGLGVAMAVSANVQAAEKIAVVNVASVFQQLPQRDAVAKQLESEFKGRA TELQGMERDLQGKMQRLQRDASTMKASERTKMEKEIAAQRETFARKAQAFEQDNRRRQMEERNKLLSRIQDAVRSVAKDK GYDMVIDANAVAYPQSSDDITAQVLKQVI(a)序列特征 长度178
类型氨基酸序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(C)假设否(d)反义否(e)最初来源迟缓爱德华氏菌TXl(f)特异性名称0mpH结构特征该蛋白含有1个OmpH功能域(氨基酸25-178)和两个α螺旋(分别由氨基酸24-48和52-147构成)。实施例2迟缓爱德华氏菌疫苗表达载体的构建方法1)质粒pETOH的构建以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F3/R1为引物进行PCR 扩增，PCR条件为94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s, 50°C 60s, 72°C 60s，5个循环后改为94°C 40s, 60°C 60s, 72°C 60s, 25个循环后再在72°C延伸反应lOmin。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T (购自于“天根生化科技有限公司，，，北京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5 α后在含有lOOug/ml安卡青霉素 (Ap)、40ug/ml Xgal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷)和 24ug/ml 异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为质粒pBSOH。将质粒pBSOH用Ndel/Xhol双酶切回收0. 5kb,同时将质粒pET258用Ndel/Xhol 双酶切回收4. 61Λ片段。所述质粒pET258构建过程参见SiangW，SunK, Cheng S，SunL. Characterization of DegQvh, a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain. Appl Environ Microbiol 2008;74:6254-62。将上述回收两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含卡那霉素(Kn，50ug/ml)的LB固体培养基上培养M小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒 ρΕΤΟΗο所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97. 5%蒸馏水；所述菌株TXl保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2330，分类命名为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。所述弓丨物为F3 5，-GCGCATATGTCATTGACACAACTAGGT-3，和 Rl 5，-CGATATCCTCGAG TATAACCTGTTTCAATACTTGA-3’。2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化将上述步骤1)的质粒pETOH用常规方法转化大肠杆菌BL21 (DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有Kn (50ug/ml)的LB固体培养基上培养18- 小时，而后筛选抗卡那霉素的转化子，挑取一个转化子，将其命名为BL21/pET0H。将BL21/pET0H于含有Kn(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取Iml过夜后的培养液，加入100ml新鲜的含有Kn (50ug/ml)的LB液体培养基中，于37°C下转速200rpm摇动培养至0D_为0. 6，加入终浓度为ImM的IPTG，37°C继续以转速160rpm摇动培养4_5h，而后以5000g，4°C离心lOmin， 收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4°C离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用His Trap HP Columns(购于美国GE Healthcare公司)回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25-30min，随后15v/cm电压下电泳2-2.证)，测定其分子量大小(参见图1)。将纯化的蛋白经N端测序分析，证实其为具有序列表SEQ ID Nol中的氨基酸序列的亚单位疫苗抗原蛋白。同时该蛋白含有1个OmpH功能域(氨基酸25-178)和两个α螺旋(分别由氨基酸 24-48 和 52-147 构成)。所述裂解液为终浓度的IOmM NaH2PO4, IOmM Tris和8Μ尿素，ρΗ 8. 0。实施例3迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的应用步骤1)佐剂及疫苗混合液的制备。佐剂制备将5% (质量比)NaOH和5% (质量比)Al2 (SO4) 3以2 5体积比混合， 将混合物以10，OOOg离心5分钟。将沉淀悬浮于PBS中至0. 2mg/ml。疫苗混合液制备将上述实施例2纯化的疫苗蛋白在PBS中稀释至250ug/ml ；将稀释后的疫苗蛋白与佐剂等体积混合。所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% Na&P04，余量为水。步骤2~)疫苗的免疫应用。将90条牙鲆(每条重约IOg)随机分为3组，每组30 条。将这3组分别命名为A，B和C组。将A组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤1) 的疫苗混合液。A组即为试验组。将B组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤1)的PBS ； 将C组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤1)的佐剂。B和C组即为对照组。步骤幻迟缓爱德华氏菌悬液的制备。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TXl 至OD6tltl为0.7，然后离心(5000g，4°C )10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为 lxl07cfu/ml。步骤4)亚单位疫苗免疫保护效应检测。在步骤幻免疫注射后的第30天，用上述步骤幻的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤幻的3组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后的14天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。14天后，统计各组鱼的总死亡数目A 组，5条；B组，30条；C组，30条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS = 100x(l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)根据此公式算出亚单位疫苗的免疫保护效率为83. 3%。因此，所得亚单位疫苗能够高效地保护牙鲆抵御迟缓爱德华氏菌侵染。
权利要求
1.一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗，其特征在于其疫苗抗原为由序列表SEQ ID No. 1 中的氨基酸序列所示。
2.按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗，其特征在于其抗原为转化了重组质粒PETOH的大肠杆菌表达的重组蛋白。
3.按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗，其特征在于所述重组质粒 pETOH,以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F3/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与PCR克隆载体pBS-T连接后得质粒pBSOH ；将质粒pBSOH用NdelAhoI双酶切回收0. 5kb,同时将质粒pBT258用NdeIAhoI双酶切回收4. 6kb片段，将回收的两片段用T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETOH ；所述引物为 F3 :5，-GCGCATATGTCATTGACACAACTAGGT-3，和 Rl :5，-CGATATCCTCGAGTATA ACCTGTTTCAATACTTGA-3，。
4.一种按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备，其特征在于1)质粒pETOH的构建以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F3/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与PCR克隆载体pBS-T连接后得质粒pBSOH ；将质粒pBSOH用NdelAhoI双酶切回收0. 5kb,同时将质粒pBT258用NdeIAhoI双酶切回收4. 61Λ片段，将回收的两片段用 T4DNA连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETOH ；所述引物为 F3 :5，-GCGCATATGTCATTGACACAACTAGGT-3，和 Rl :5，-CGATATCCTCGAGTATA ACCTGTTTCAATACTTGA-3，；2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化将质粒pETOH转化大肠杆菌BL21(DE3)，得转化子 BL21/pET0H ；将BL21/pET0H于含有Kn的LB液体培养基中过夜培养；取过夜后的培养液加入新鲜的LB液体培养基中，于37°C培养至0D_为0. 6，加入终浓度为ImM的IPTG并于37°C 继续培养4- ，然后在菌液中加入裂解液，室温摇动1-2小时；将菌液离心，回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即得具有序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列的亚单位疫苗蛋白。
5.按权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备，其特征在于将上述得到亚单位疫苗蛋白在PBS中稀释至250ug/ml，而后将稀释的疫苗蛋白与佐剂等体积混合。
6.按权利要求5所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备，其特征在于所述佐剂为将5 % (质量比)NaOH和5 % (质量比)Al2 (SO4) 3以2 5体积比混合，将混合物离心后悬浮于PBS中至0. 2mg/ml。
全文摘要
本发明涉及分子免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗和制备方法。其疫苗抗原为由序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。本发明的亚单位疫苗的应用不需商业佐剂，只需配以简单的氢氧化铝佐剂即可获得高免疫效应。
文档编号C12R1/19GK102240398SQ20111009319
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者孙云, 孙黎 申请人:中国科学院海洋研究所