专利名称：一种增殖甲型流感病毒的方法
技术领域：
本发明属于动物传染病技术领域，具体涉及一种甲型HlNl流感病毒的分离鉴定及该病毒在MDCK细胞上的稳定增殖的方法。
背景技术：
2009年3月墨西哥首次发现甲型HlNl流感病例，自此疫情开始在世界各地迅速蔓延，席卷全球。截止2009年8月6目，已有170多个国家报告病例177457例，造成1462人死亡；2009年8月14日我国报告确诊2429例、2009年6月11日，世界卫生组织(WHO)将该流感大流行警告级别提高至6级。我国卫生部于2009年4月30日宣布将其纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采用甲类传染病的预防、控制措施，同时 将其纳入《中华人民共和国国境卫生检疫法》规定的检疫传染病管理。2009年3月墨西哥此次疫情的病原为变异后的新型甲型HlNl流感病毒。各国流行的甲型HlNl流感病毒目前在氨基酸水平上是高度同源的，而在这次流感病毒的基因组内存在四源重组，其中该病毒的PB2和PA基因源自禽流感HlNl病毒，PBl基因源自人季节性流感H3N2病毒，HA、NP和NS基因源自古典型猪流感HlNl病毒，NA及M基因源自欧亚系猪流感HlNl病毒(殷建华等，2009，第二军医大学学报，第30卷，第6期，637-640)。由于甲型HlNl流感病毒的5个主要基因片段与猪流感病毒同源性很高，猪是猪、禽、人流感病毒共同的易感宿主，是流感病毒基因重组或重配的“混合器”(顾春英等，2009，第二军医大学学报，第30卷，第6期，605-609)流感病毒新流行毒株“孵育器”。SI在人和动物流感的病原学、生态学及流行病学中占有举足轻重的地位。因此，猪流感的影响不仅在于其显而易见的兽医传染病学意义，更在于其深远的公共卫生学意义。猪流感(SI)是一种急性、热性和高度接触性的呼吸道传染病，其临床上以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭和死亡为特征。SI呈地方性流行，世界性分布，可发生于各年龄和各品种猪，发病率高达100%。SI在养猪场中普遍存在，难以根除。SI能引起病猪生产性能下降，肉料比降低，直接影响猪群健康状态及质量，对养猪业危害很大；更值得重视的是，猪流感病毒(SIV)感染猪后可导致胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、猪2型链球菌、猪呼吸道冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的继发或混合感染，使疫情变得复杂、病情加重，造成饲料、人工的巨大浪费及药物的无谓消耗，死亡率增高，由此引起的经济损失更无法估量(李海燕等，2002，中国预防兽医学报，第24卷，第I期，12-17)。SIV与其它病原体共感染或继发感染所造成的损害，已成为制约猪场经济效益的主要原因之一。鸡胚培养和细胞培养进行流感病毒分离是流感病原检测的金标准。鸡胚是流感病毒最为常用的一种培养基质，常用它来分离流感病毒和制备疫苗。但用鸡胚尿囊液分离或传代流感病毒易引起抗原变异；大规模生产时还存在鸡胚数量不足和潜在外源病毒污染的问题。一哺乳动物细胞为基质制备疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、能较好的维持病毒抗原稳定性等优点。鉴于此，本发明着手于利用细胞分离培养新型甲型HlNl流感病毒的，及新型甲型HlNl流感病毒在MDCK细胞上稳定增殖。通过最佳感染剂量、最适TPCK胰酶浓度、最适培养液PH值等培养条件的优化，确定最佳的新型甲型HlNl流感病毒增殖培养方法，为建立甲型流感疫苗生产新体系奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于克服 现有技术缺陷，从发生呼吸道疾病的某猪场中分离到一株HlNl亚型新的流感病毒。本发明的第二个目的是在MDCK细胞上大量增殖HlNl亚型新的流感病毒，为后续开发奠定基础。本发明从中国某地发生呼吸道疾病的某猪场中分离到一株HlNl亚型新的流感病毒，经鉴定该病毒为A/swine/Nanchang/F9/2010 (HlNl)，简称甲型Hl亚型流感病毒。对该病毒本身包含的8个基因片段(Genbank登录号为JF275925-JF275932)的全序列测定和遗传进化分析表明，本发明分离的该甲型Hl亚型流感病毒的8个基因片段与2009年4月报道的甲型HlNl流感病毒A/California/04/2009 (HlNl)的基因同源性高达99%。为了满足专利上的充分公开，申请人将上述分离得到的甲型Hl亚型流感病毒A-influ JML-F9，于2011年I月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC N0:V201105。将上述甲型Hl亚型流感病毒在MDCK细胞上进行增殖培养，确定了其增殖培养的相关条件和方法，结果表明，本发明甲型Hl亚型流感病毒增殖的血凝效价平均达到71og2，最闻达到91og2。申请人:提供了一种甲型流感病毒的增殖方法，其步骤如下所述I)将疑似猪流感感染的气管拭子样品接种含有2 μ g/mL的TPCK-胰酶的细胞维持液分离病毒；2)对步骤I)判定的血凝阳性样品用Hl亚型猪流感的通用引物M684和甲型Hl流感的通用引物H1-292进行RT-PCR扩增，进行流感病毒亚型鉴定，其步骤如下反转录用的引物Unil2的核苷酸序列(单链)如下5’ -AGCAAAAGCAGG-3’ ；流感病毒cDNA的合成步骤如下在20 μ L反转录体系中进行，依次加入以下组分
AMV Reverse Transcriptase XL (50U/pL ) I .Ομ RNase inhibitor(40U/pL )0.5pL
5xRNA PCR Buffer4.0μ
Uni 12 prime(10pmol)r1.5pL
dNTPs (I Ommol)2\xL
RNA 模板Ι μ 将上述组分混匀后置PCR仪上于42°C下60min，95°C 5min进行反转录，反应产物直接用于PCR或4°C保存备用；M-684和H1-292弓丨物核苷酸序列M-684U CAAGACCAATCCTGTCACCTC ； M-684L AAGACGATCAAGAATCCACAA,扩增得到的片段大小为 684bp ；
H 1-292U CATTAATGATAAAGG ；H1-292L :TCCAGCATTTCTTTC，扩增得到的片段大小为 292bp ；PCR反应体系在25 μ L反应体系中进行，依次加入以下组分
Trans-Taq 聚合酶(2 U)0·5μ
IOxBuifer2.5pL
dNTP (2mmol)2μ
正向引物Ιμ
反向引物
cDNA3 μι
ddH2016μ PCR反应参数M684 95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 30 个循环；72°C延伸 IOmin ；Hl-292 95°C 5min ；94°C 30s, 42. 5°C 30s, 72°C lmin，30 个循环；72°C延伸 IOmin ；将PCR产物纯化后连接pMD18-T载体，选取阳性病料克隆M684和H1-292测序，判定是否为甲型Hl流感；3)对甲型Hl流感病毒进行全基因组测序，其步骤如下以步骤2)所述的cDNA为模板，扩增甲型Hl流感病毒8个基因，即PB2，PBl，PA，HA, NP, NA，M和NS，扩增上述8个基因的特异引物的核苷酸序列如下扩增PB2基因P15，AGCAAAAGCAGGTC 3，，P25， AGTAGAAACAAGGTCGTTT 3，；扩增PBl基因P15，AGCAAAAGCAGGCA 3，，P25，AGTAGAAACAAGGCATTT 3’ ；扩增PA基因 P15，AGCAAAAGCAGGTAC 3，，P25，AGTAGAAACAAGGTACTT 3’ ；扩增HA基因P15，AGCAAAAGCAGGGG 3，，P25， AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3，；扩增NP基因P15，AGCAAAAGCAGGGTA 3，，P25， AGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’ ；扩增NA基因P15，AGCAAAAGCAGGAGT 3，P25， AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3，；
扩增M基因P15 ’ AGCAAAAGCAGGTAG 3 ’，P25， AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’ ；扩增NS基因P15，GCAAAAGCAGGGTG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’ ；按步骤2)的方法提取甲型Hl流感病毒RNA，合成甲型Hl流感病毒cDNA ；甲型Hl流感病毒cDNA的PCR扩增
在PCR反应管中加入反转录产物2.0 μ L，LA Taq DNA聚合酶(5U/μ L) O. 5 μ L，10XLA Taq DNA Buffer5 μ L, dNTPsMixture (各 2mM) 2· O μ L，各基因的正向引物和反向引物各2. O μ L，用ddH20调终体积至50 μ L，混匀后于PCR仪上进行扩增；PCR扩增程序预变性95 V 5min,变性94 V 30sec,退火52 °C 30sec,延伸72°C 4min，运行35个循环后于72°C延伸lOmin。对PCR产物进行回收，连接pMD18_T载体，转化后进行菌液PCR鉴定，将判定为阳性的样品进行测序；4)将甲型Hl亚型流感病毒10—1 10_3稀释接种12孔板的MDCK细胞，弃去细胞生长液，换上细胞维持液；5)将甲型Hl亚型流感病毒以10_3稀释接种12孔板的MDCK细胞，在细胞维持液分别加入终浓度为O 4 μ g/mL的TPCK胰酶；6)将甲型Hl亚型流感病毒10_3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2μ g/mL，接种于12孔板的MDCK细胞，然后分别加入pH值为7. O 8. O的细胞维持液，观察细胞病变；7)将甲型Hl亚型流感病毒以10_3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2 μ g/mL ;在pH = 7. 6的条件下，用表面积为160cm2的SOOmL的细胞瓶进行病毒增殖；8)将甲型Hl亚型流感病毒以10_3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2 μ g/mL;在pH = 7. 6的条件下，用表面积为2350cm2的IOL的转瓶进行病毒增殖；其中步骤I)和4)所述的细胞维持液配方如下取商购的DMEM粉剂(购自武汉佰欧乐基生物科技有限公司)一小包，再取HEPES，FREEACID 4. Hg, NaHC037. 4g，溶于ddH20中，待完全溶解后用ddH20定容至1L，再用2M的NaOH调溶液的pH至7. 4，无菌过滤后储存于4°C条件下备用；其中步骤4)所述的细胞生长液配方如下在细胞维持液中加入按V/V计10%的灭活新生牛血清；其中步骤5)所述的细胞维持液的配方如下将TPCK胰酶粉剂配制成100 μ g/mL的母液，用孔径为O. 22 μ m的滤膜过滤备用；其中终浓度为O μ g/mL TPCK浓度的维持液=IOOmL维持液中不加入TPCK胰酶母液；终浓度为O. 5 μ g/mL TPCK浓度的维持液100mL维持液中加入50 μ L的TPCK胰酶母液；终浓度为I μ g/mL TPCK浓度的维持液IOOmL维持液中加入100 μ L的TPCK胰酶母液；终浓度为2 μ g/mL TPCK浓度的维持液IOOmL维持液中加入200 μ L的TPCK胰酶母液；终浓度为4 μ g/mL TPCK浓度的维持液IOOmL维持液中加入400 μ L的TPCK胰酶母液；其中步骤5)所述的细胞维持液的配比如下pH值为7. O的维持液的配方100mL维持液用2M NaOH调pH值至7. 0，用孔径为O. 22 μ m的滤膜过滤备用；pH值为7. 2的维持液的配方100mL维持液用2M NaOH调pH值至7. 2，用孔径为O. 22 μ m的滤膜过滤备用；pH值为7. 4的维持液的配方100mL维持液用2M NaOH调pH值至7. 4，用孔径为 O. 22 μ m的滤膜过滤备用；pH值为7. 6的维持液的配方100mL维持液用2M NaOH调pH值至7. 6，用孔径为O. 22 μ m的滤膜过滤备用；pH值为7. 8的维持液的配方100mL维持液用2M NaOH调pH值至7. 8，用孔径为O. 22 μ m的滤膜过滤备用；pH值为8. O的维持液的配方100mL维持液用2M NaOH调pH值至8. 0，用孔径为O. 22 μ m的滤膜过滤备用。与现有技术相比，本发明具有如下优点用细胞系代替鸡胚组织培养制造流感病毒，可解决鸡胚自身及所受外源病毒污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的病毒的纯净性。本发明可以大量降低生产成本，不会受制于原料供应，而且生产周期短，每个生产周期仅需4天，相比鸡胚培养法的13天以上大大缩短。应用转瓶进行病毒增殖，具有生产工艺简单稳定，易操作、产量大占用地小、无需反复照胚，易于快速扩大生产规模。质量易于实现均衡稳定。应用本方法生产的的病毒液，环境污染少且易于处理。而现有的鸡胚生产法会产生的大量废胚等废物，且处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。本发明的实施案例中，申请人提供了这种新型甲型HlNl流感病毒的分离培养方法，及全基因组测序过程。并描述了该毒株在MDCK细胞上各种条件的优化过程。更详细的技术方案如《具体实施方式
》所述。
SEQIDNO 1是扩增的HA基因片段，序列长度为1780bp。SEQIDNO 2是扩增的M基因片段，序列长度为1028bp。SEQIDNO 3是扩增的NA基因片段，序列长度为1459bp。SEQIDNO 4是扩增的NP基因片段，序列长度为1566bp。SEQIDNO 5是扩增的NS基因片段，序列长度为890bp。SEQIDNO 6是扩增的PA基因片段，序列长度为2234bp。SEQIDNO 7是扩增的PBl基因片段，序列长度为2342bp。SEQIDNO 8是扩增的PB2基因片段，序列长度为2341bp。图I:是甲型Hl亚型流感病毒接种MDCK细胞后，使细胞聚集，部分脱落，并出现拉网的现象(见图Ib :出现病变细胞，且不整齐)和一个未接种前述病毒的MDCK细胞对照(见图la，细胞正常)。图2 :是本发明通过中国动物卫生与流行病学中心公布的M684(H1亚型猪流感的通用引物)和Hl-292(新型甲型Hl流感的通用引物)为引物，进行流感病毒亚型鉴定的结
果O图3 :是本发明通过RT-PCR扩增甲型Hl亚型流感病毒的8个基因片段，O. 8%的琼脂糖凝胶电泳图。泳道 2-9 分别为 PB22341bp，PB12342bp，PA 2234bp, HA 1780bp, NP1566bp, NA 1459bp, M 1028bp, NS 890bp。图4 :甲型Hl亚型流感病毒HA、NA基因遗传进化树。图4a HA基因；图4b NA基因。
具体实施方式
实施例I :新型甲型HlNl流感病毒的分离鉴定样品的采集采集中国江西省某猪场疑似猪流感感染的病猪的气管棉拭子，将采样后的棉拭子置于含100U/mL的青、链霉素灭菌生理盐水中。采集样本立即置2 8°C保存，并在24h内送检，长期保存放_70°C。病毒分离与鉴定80%成片细胞的准备，用40倍镜观察细胞生长状态，选择处于对数生长期的MDCK细胞，轻轻倒出细胞生长液，用灭菌生理盐水分别清洗细胞2次，以清除细胞表面的新生牛血清。加入含有2 μ g/mL的TPCK-胰酶的细胞维持液。细胞培养孔的接种，标本在送检后的24h内用MDCK细胞进行病毒分离。用无菌带滤膜的枪头吸取200 μ I的临床样品置于细胞培养孔中，放置于37°C含5% CO2的培养箱培养。每天观察细胞病变情况。(细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落。)在24h内出现的CPE很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取100 μ I阳性分离物传2代，继续观察。细胞培养物的收获，当75%以上的细胞发生病变时进行收获，没有细胞病变的于第7天收获并进行盲传，收获之前将细胞冻融2次。用I %的鸡红细胞进行初步的鉴定。血凝阳性培养液进行RT-PCR鉴定，RNA的提取参照Invitrogen公司Trizol试剂说明书进行，以流感反转通用引物U12合成cDNA后，可以通过中国动物卫生与流行病学中心公布的Μ684(Η1亚型猪流感的通用引物)和Hl-292(甲型Hl流感的通用引物)为引物，进行流感病毒亚型鉴定。血凝试验(HA)在96孔V型反应板上，每孔加入25 μ I O. OlM pH7. 2PBS，吸取25 μ I待检病毒液于第I孔内，充分混均后吸25 μ I于第2孔，依次倍比稀释至第11孔，弃去25 μ I ;第12孔作为O. OlM pH7. 2PBS对照孔。然后每孔加入I %鸡红细胞悬液25 μ 1，在微量振荡器上摇匀，室温静置30min后观察结果。在O. OlM pH7. 2PBS对照孔不发生红细胞凝集的条件下，即可进行对试验组的结果判读。待检病毒的血凝价为红细胞发生100%凝集的最高病毒稀释倍数。
++++ :凝集的红细胞呈薄膜状均匀覆盖孔底，强烈凝集时则皱缩成团；+++ :凝集的红细胞比较均匀覆盖孔底，有非常少红细胞沉降；++:凝集的红细胞覆盖孔底,但中央有少量红细胞沉降成小圆点；+ :红细胞沉于孔底中央，但周围仍有散在的红细胞凝集；-:红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在的红细胞凝集。病毒RNA的提取I)在I. 5mL的印pendorf管中加入反复冻融的病毒培养物500ul，再加入TRIzolLS 500ul，充分混匀，室温放置lOmin。2)加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管(溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象)，室温放置IOmin (由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心)。3)离心4°C、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管(切忌吸动白色中间相)。4)加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置lOmin。5)离心4°C、13000r/min、15min,用枪小心吸去所有上清。6) ImL 75%乙醇洗一遍,离心4°C、8000r/min、lOmin,用枪小心吸去所有上清,在超净台中干燥5min。7)加入适量25ul DEPC处理水。立即做RT。病毒cDNA的合成
在20 μ L反转录体系中进行，依次加入以下组分
AMV Reverse Transcriptase XL (50U/pL ) I _0pL RNase inhibitor(40U/pL )0.5μ￡
5xRNA PCR Buffer4.0μ
Uni 12 prime(10pmol)rΙ·5μΙ>
dNTPs (I Ommol)2\\L
RNA 模板IlpL混匀后置PCR仪42°C 60min,95°C 5min进行反转录，反应产物直接用于PCR或4°C保存备用。M-684和H1-292弓丨物序列上游引物M-684U CAAGACCAATCCTGTCACCTC下游引物M-684L AAGACGATCAAGAATCCACAA 预期片段大小为 684bp上游引物H1-292U CATTAATGATAAAGG下游引物H1-292L TCCAGCATTTCTTTC预期片段大小为292bpPCR反应体系在25 μ L反应体系中进行，依次加入以下组分Trans-Taq 聚合酶(2 U) 0.5 μ L IOXBuffer2.5 μ L
dNTP (2mmol)2uL
上游引物IuL
下游引物IwL
cDNA3 μ L
ddH2016 U LPCR 反应参数95 °C 5min ；94°C 30s，55°C 30s (Hl-292 退火温度42. 5 °C 30s)，72°C lmin，30个循环；72°C延伸lOmin。将PCR产物纯化后连接pMD18_T载体，选取阳性病 料克隆M684和(或)H1-292送上海生工生物工程有限公司测序，以进一步鉴定。PCR产物回收采用上海生工生物工程技术有限公司的UNIQ-IO柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA片段，按照UNIQ-IO柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒的说明书的步骤进行，具体操作如下I)用O. 8%的琼脂糖胶电泳，使目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，在长波紫外灯下，用在酒精灯火焰上烧过的手术刀片切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入I. 5mL灭菌
离心管中。2)按每 IOOmg 琼脂糖胶加入 400 μ L Binding Buffer,置 50_60°C水浴中 lOmin,使琼脂糖凝胶彻底融化(加热溶胶时，每2min混匀一次)。3)将UNIQ-IO柱放入收集管中，将融化的胶溶液转移到UNIQ-IO柱中，室温静置2min,室温 8000rpm 离心 lmin。4)取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-IO柱放入同一个收集管中，力口A 500 μ L WashSolution,室温 8000rpm 离心 lmin。5)重复步骤4，取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-IO柱放入同一个收集管中，室温12000rpm离心15sec。6)将UNIQ-IO柱放入一个灭菌的I. 5mL离心管中，根据PCR产物量的相对多少，在柱子底部的膜中央加10-20 μ L Elution Buffer或ddH20，室温或37°C放置2min室温12000rpm离心lmin，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于_20°C备用。PCR产物的克隆用TaKaRa公司的PCR产物克隆试剂盒进行，取4μ L PCR回收产物(经O. 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定过有目的片段存在)，1μ L载体DNA(PMDlS-T)JyL Ligation SlutionI，16 °C反应过夜。连接pMD18-T 载体连接产物的转化取感受态细胞DH5a 100μ I加入到I. 5mL EP管中，将连接后的以pMD18_T为载体的重组质粒10 μ I加入并混匀。置冰上30min后，42°C热激90sec，冰浴3min_5min。加Λ 400 μ I LB,于37°C 200rpm振荡培养45min使其复苏。复苏后的重组大肠杆菌悬液于40C 5000rpm离心lOmin，弃去400 μ I上清，用剩余的100 μ I重悬沉淀涂布于含有25 μ g/mL Amp的LB琼脂平板。37°C增殖lh，再将平板翻过来，倒置37°C培养14h_16h至菌落出现。分别挑取5个单菌落用H1-292的引物进行PCR鉴定，鉴定的阳性结果可以送上海生工生物工程有限公司进行测序。结果分析江西省的拭子样品接种MDCK细胞后第一代就观察到明显的细胞病变，细胞间隙增宽，拉成网状，并有部分细胞脱落。(如图1，图Ia为正常的MDCK细胞，图Ib为接毒后的MDCK细胞。)进行血凝检测HA效价达到23，进行第二次传代HA效价达到26。对第二次传代的样品进行RT-PCR鉴定，M684(如图2a)和Hl_292(如图2b)均扩增出阳性目的条带。对PCR产物进行回收，连接pMD18-T载体，转化后进行菌液PCR鉴定，阳性样品送上海生工生物工程有限公司进行测序。结果显示甲型Hl亚型流感病毒同A/California/04/2009 (HlNl)有99%的同源性。说明中国猪群中已经存在新型北美流行株猪流感病毒。实施例2 :新型甲型HlNl流感病毒的全基因组测序
对甲型Hl流感病毒进行全基因组测序，其步骤如下以步骤2)所述的cDNA为模板，扩增甲型Hl流感病毒8个基因序列全长，即HA，M，NA，NP, NS, PA，PBl和PB2，和扩增得到如序列表SEQ ID NO :1_8所示的核苷酸序列(其序列如(Genbank登录号为JF275925-JF275932相对应))，扩增上述8个基因的特异引物的核苷酸序列如下所示扩增HA基因P15，AGCAAAAGCAGGGG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT3’ ；扩增M基因P15，AGCAAAAGCAGGTAG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’ ；扩增NA基因P15，AGCAAAAGCAGGAGT 3，P25’ AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3’ ；扩增NP基因P15，AGCAAAAGCAGGGTA 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’ ；扩增NS基因P15，GCAAAAGCAGGGTG 3，，P25， AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3，；扩增PA基因P15，AGCAAAAGCAGGTAC 3，，P25，AGTAGAAACAAGGTACTT 3，；扩增PBl基因P15，AGCAAAAGCAGGCA 3，，P25，AGTAGAAACAAGGCATTT 3，；扩增PB2基因
P15，AGCAAAAGCAGGTC 3，，P25， AGTAGAAACAAGGTCGTTT 3，；甲型Hl流感病毒RNA的提取，其病毒的cDNA的合成，同实施案例I所述。甲型Hl流感病毒cDNA的PCR扩增在PCR反应管中加入反转录产物2. Oii L，LA Taq DNA聚合酶(5U/ii L) 0. 5 ii L，10XLA Taq DNA Buffer5 u L, dNTPs Mixture (各 2mM) 2. 0 y L，各基因的上下游引物各2. OuL,最后用ddH20将终体积调至50 u L，混匀后于PCR仪上进行扩增。PCR扩增程序为预变性95°C 5min，变性94°C 30sec，退火52°C 30sec，延伸72°C 4min，运行35个循环后于72°C延伸lOmin。同时设未加模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物各取5 y L，在0. 8%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，剩余置4°C保存备用。对PCR产物进行回收，连接PMD18-T载体，转化后进行菌液PCR鉴定，阳性样品送 上海生工生物工程有限公司进行测序。同实施案例I。将测得的HA和NA基因序列经过DNAStar软件包中的SeqMan校对正确后，经Blast比较，从Genbank选取具有代表性毒株以及核苷酸同源性高的毒株序列，应用ClustalX绘制HA和NA的系统进化树和进行遗传分析。因为HA和NA蛋白是穿过双层脂膜突出在病毒表面，形成流感病毒的主要抗原，在诱导宿主动物的抗体反应中具有非常重要的作用。HA、NA 二者在免疫压力下保持高度的变异性，而NP、M等内部蛋白则具有较强的保守性。结果分析本实施例成功扩增了甲型Hl亚型流感病毒的8个基因片段，8个片段的0. 8%琼脂糖凝胶上电泳图(如图3，泳道2-9分别为PB22341bp, PB12341bp, PA 2233bp, HA1778bp, NP 1556bp, NA 1413bp, M 1027bp, NS 890bp)所示。从系统进化树可知，从猪病料中分离的甲型Hl亚型流感病毒的HA(如图4a)和NA (如图4b)基因同A/California/04/2009 (HlNl)处于同一进化分支；HA基因与中国报道的A/swine/Guangxi/13/2006 (H1N2)进化关系较近，NA基因同A/swine/Zhejiang/1/2007 (HlNl)进化关系较近，与 A/swine/Tianjin/01/04 (HlNl)、A/swine/Henan/01/06 (HlNl)处于不同进化分支。实施案例3不同感染剂量对甲型Hl亚型流感病毒在MDCK细胞中增殖的影响I)在12孔板中进行不同感染剂量的甲型Hl亚型流感病毒在MDCK细胞中的增殖试验，取长满MDCK细胞的12孔板(每孔直径2. 2cm，表面积为3. 8cm2)，细胞密度约为2 X IO5个/cm2，弃去培养基，用PBS缓冲液洗3次，以除去残留的培养基。甲型Hl亚型流感病毒粒子浓度约为 I X 107PFU/mLo 按病毒感染复数(Multiplication of Infection, MOI)MOI =(0. 3,0. 03,0. 003)分别接种MDCK细胞，相当于HA效价为81og2病毒原液稀释到10-1，10_2，10_3每孔250 u L，每个剂量接3个孔，在CO2培养箱中37°C条件下吸附I. 5h，弃去病毒液，加入维持液(含2 ii g/mL的TPCK胰酶，不含血清的DMEM培养基，加入青霉素终浓度IO2IU/ml、链霉素终浓度IO2il g/mL) ImL,同时留I孔不接毒只换维持液做空白对照。观察接毒后细胞病变情况，在接毒后每12h收取12孔板中每个孔的细胞培养上清60 u L，放在4°C冰箱保存。直至接毒孔的细胞全部脱落为止。按照(同实施例I中血凝试验)检测各时间段细胞培养上消的血凝价。结果分析
接种不同MOI病毒对病毒HA效价的影响，当接种病毒的MOI为0. 3，0. 03，0. 003时，相当于HA效价为81og2病毒原液稀释到10—1，10_2，10_3，在MDCK细胞中均可大量增殖病毒，HA效价最高值可达29。当MOI = 0. 3时，病毒HA效价最高只能达到27，而在MOI =0. 03 (HA效价为81og2病毒原液稀释到10_2)和MOI = 0. 003 (HA效价为81og2病毒原液稀释到10_3)时，HA效价最高值均可达29。而且MOI = 0. 003 (HA效价为81og2病毒原液稀释到10_3)时细胞上清保持HA效价为29的时间较长，因此选择MOI = 0. 003 (HA效价为81og2病毒原液稀释到10_3)作为之后试验的病毒感染剂量，相当于病毒原液稀释成10_3进行接种。表I接种不同MOI病毒后病毒HA滴度(Iog2)
权利要求
1.一种增殖甲型流感病毒的方法，其步骤包括 1)将疑似猪流感感染的气管拭子样品接种含有2ii g/mL的TPCK-胰酶的细胞维持液分离病毒并进行判定； 2)对步骤I)判定的血凝阳性样品用Hl亚型猪流感的通用引物M684和甲型Hl流感的通用引物H1-292进行RT-PCR扩增，进行流感病毒亚型鉴定，其步骤如下 反转录用的引物Unil2 :其核苷酸序列(单链)如下5’ -AGCAAAAGCAGG-3’ ； 流感病毒cDNA合成 在20ii L反转录体系中进行，依次加入以下组分 AMV Reverse Transcriptase XL (50U/|iL ) I .O^iLRNase inhibitor(40U/|iL )0.5|iL5xRNA PCR Buffer4.0|aLUni12 prime(10pmol)r1.5[iLdNTPs (I Ommol)2juLRNA 模板IlpL 将上述组分混匀后置PCR仪中，42°C 60min,95°C 5min进行反转录，反应产物直接用于PCR反应；其中PCR反应的引物序列如下M-684 和 H1-292M-684U CAAGACCAATCCTGTCACCTC ； M-684L :AAGACGATCAAGAATCCACAA，扩增得到的片段长度为 684bp ；H1-292U CATTAATGATAAAGG ； H1-292L :TCCAGCATTTCTTTC，扩增得到的片段长度为292bp ； PCR反应体系 在25 y L反应体系中进行，依次加入以下组分Trans-Taq 聚合酶(2 U) 0.5^iLIOxBuffer2.5(iLdNTP (2mmol)2|xL上游引物IHL下游引物IpLcDNA3 ^iLddH2016^L PCR反应参数 M684 95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，30 个循环；72°C延伸 IOmin ；Hl-292 95°C 5min ；94°C 30s, 42. 5°C 30s, 72°C lmin，30 个循环；72°C延伸 IOmin ； 将PCR产物纯化后连接pMD18-T载体，选取阳性病料克隆M684和H1-292测序，判定是否为甲型Hl流感病毒； 3)对甲型Hl流感病毒进行全基因组测序，其步骤如下 以步骤2)所述的cDNA为模板，扩增甲型Hl流感病毒8个基因HA，M，NA, NP, NS, PA，PBl和PB2，得到如序列表SEQ ID NO :1_8所示的核苷酸序列，其中扩增上述8个基因的特异引物的核苷酸序列如下所示 扩增HA基因 P15，AGCAAAAGCAGGGG 3'P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’ ； 扩增M基因P15，AGCAAAAGCAGGTAG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’ ； 扩增NA基因P15，AGCAAAAGCAGGAGT 3，P25’ AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3’ ； 扩增NP基因P15，AGCAAAAGCAGGGTA 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’ ； 扩增NS基因P15， GCAAAAGCAGGGTG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’ ； 扩增PA基因P15，AGCAAAAGCAGGTAC 3，， P25，AGTAGAAACAAGGTACTT 3，； 扩增PBl基因P15，AGCAAAAGCAGGCA 3，， P25，AGTAGAAACAAGGCATTT 3，； 扩增PB2基因P15，AGCAAAAGCAGGTC 3，，P25， AGTAGAAACAAGGTCGTTT 3，；按步骤2)的方法提取甲型Hl流感病毒RNA，合成甲型Hl流感病毒cDNA ； 甲型Hl流感病毒cDNA的PCR扩增 在PCR反应管中加入反转录产物2. Oii L，LA TaqDNA聚合酶(5U/u L) 0. 5 u L, 10 X LATaq DNA Buffer5 u L, dNTPs Mixture (各2mM) 2. 0 y L，上述8个基因的正向引物和反向引物各2. 0 ii L，用ddH20调终体积至50 u L，混匀后于PCR仪上进行扩增； PCR 扩增程序预变性 95 0C 5min，变性 94°C 30sec，退火 52 °C 30sec，延伸 72 °C 4min，运行35个循环后于72°C延伸lOmin。对PCR产物进行回收，连接pMD18_T载体，转化后进行菌液PCR鉴定，将判定为阳性的样品进行测序； 4)将HA效价为81og2的甲型Hl亚型流感病毒以10—1 10_3稀释，接种12孔板的MDCK细胞，弃去细胞生长液，换上细胞维持液； 5)将HA效价为81og2的甲型Hl亚型流感病毒以10_3稀释，接种12孔板的MDCK细胞，在细胞维持液分别加入终浓度为O 4 ii g/mL的TPCK胰酶；6)将HA效价为81og2的甲型Hl亚型流感病毒以10_3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2 U g/mL,接种于12孔板的MDCK细胞，然后分别加入pH为7. O 8. O的细胞维持液，观察细胞病变； 7)将HA效价为81og2的甲型Hl亚型流感病毒以10_3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2 u g/mL ;在pH = 7. 6的条件下，用表面积为160cm2的800mL的细胞瓶进行甲型Hl亚型病毒增殖；8)将HA效价为81og2的甲型Hl亚型流感病毒以10_3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2 u g/mL ;在pH = 7. 6的条件下，用表面积为2350cm2的IOL的转瓶进行甲型Hl亚型病毒增殖； 其中步骤I)和4)所述的细胞维持液配方如下 先取 DMEM 粉剂一小包，再取 HEPES，FREE ACID 4. 77g，NaHC037. 4g，溶于 ddH20 中，待完全溶解后再用ddH20定容至1L，最后用2M的NaOH调溶液的pH至7. 4，无菌过滤后储存于4°C条件下备用； 其中步骤4)所述的细胞生长液配方如下 在细胞维持液中按V/V计加入10%的灭活新生牛血清。
2.适用于权利要求I所述方法的专用菌株，其特征在于，所述的专用菌株是甲型Hl亚型流感病毒A-influJML-F9，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCCNO V201105o
全文摘要
本发明属于动物传染病技术领域，具体涉及一种甲型H1流感病毒的分离鉴定及该病毒在MDCK细胞上稳定增殖的方法。本发明通过分离鉴定得到一株甲型H1流感病毒A-Influ/JML-F9，其保藏编号为CCTCC NOV201105。通过优选方法、培养基及培养条件将该甲型H1流感病毒在MDCK细胞上的稳定增殖，大规模增殖该病毒的平均血凝效价达到7log2，其最高血凝效价达到9log2。
文档编号C12R1/93GK102796708SQ20111013724
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者金梅林, 杨影, 陈焕春, 徐高原, 李国红, 郭学波, 张安定, 周红波, 陈章表 申请人:华中农业大学, 武汉科前动物生物制品有限责任公司