专利名称：猪雌激素诱导启动子及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物基因工程技术领域。具体涉及猪雌激素诱导启动子及应用。本发明包括猪HoxalO基因DNA的提取、引物设计、基因克隆、启动子预测、雌激素诱导启动子质粒构建的相关技术。从猪中获得了 HoxalO基因雌激素诱导型启动子质粒，并在细胞水平对其功能进行了验证，证实了该质粒在受体细胞中具有增强猪HoxalO基因表达的作用。
背景技术：
猪的产仔数是繁殖性状中重要的经济性状，直接关系到养猪业的经济收益。在英国，如果每头母猪的产活仔数每胎提高I头，英国的养猪业每年就可增加利润7亿英镑，整个欧盟养猪业可多获利20亿英磅(Chris Hale, 1996);在我国，如果母猪产仔数每胎提高I头，每年也将增收190亿人民币的纯利(王莉兴，2008)。母猪产仔数性状是一个由排卵、受精、着床、胎儿发育等多个具有时间顺序特征的组分性状构成的复合性状。从目前的研究情况来看，猪早期胚胎丢失率和中期胎儿死亡率是决定母猪产仔数的主要原因之一。母猪 早期胚胎丢失与子宫内环境密切相关，而胚泡异常发育与着床失败是导致母猪早期胚胎丢失的主要原因。HoxalO基因是同源异型基因的一种，在进化上高度保守，其表达产物是一种转录因子。目前，在人及其他哺乳动物中的研究表明，HoxalO基因是调控子宫微环境、影响子宫内膜容受性和胚胎着床的关键因子，该基因在子宫内膜上皮细胞中持续上调是正常妊娠的必要条件。HoxalO基因在“着床窗口期”高表达，与其辅因子PBX2及Meisl相互作用形成不同的异源二聚体或三聚体(Sanro JL, 2005),调控0 3 (Gaurang S. Daftary, 2002)、EMX2 (Patrick J. Troy, 2003), IGFbp-I、FKbp52、EP3、EP4 (T Svingen, 2006)等下游基因，参与雌性生殖系统的发育和正常子宫内膜形态的构建，并对子宫内膜的增殖与分化、子宫内膜容受性的建立、胚胎的定位及粘附、胞饮突的形成、子宫内膜的蜕膜化以及血管通透性的增强发挥着重要作用。研究表明，妊娠初期，雌激素和孕酮分别通过它们的受体直接调控HOXAlO基因的表达(Taylor HS, 1998 ；Bagot CN，2007)，阻碍成体母鼠子宫内膜中HoxalO基因的表达导致胚胎附植和窝产仔数降低(Akbas GE，2004)。HoxalO基因参与调节子宫内膜间质细胞及腺上皮细胞周期性的增殖和分化，从而使子宫内膜进入容受状态，并参与子宫内膜的蜕膜化和妊娠的维持，是调节胚胎着床的重要基因。由于在人和小鼠等的研究表明HoxalO基因在子宫内膜高表达，雌激素可以通过ER与HOXAlO的ERl及ER2结合，使HOXAlO转录激活，增加HOXAlO的表达(Melissa B. Taylor，2007)。HoxalO基因是调控子宫微环境、影响子宫内膜容受性和胚胎着床的关键因子，并且与母鼠产仔数有关，而HoxalO基因在物种间高度保守，启动子序列分析表明与人HOXAlO基因启动子研究结果吻合；因此推测猪HoxalO基因具有类似繁殖性状相关功能。启动子是一段对基因的表达起调控作用的DNA片段，是精确调控基因表达的“开关”。因此对雌激素诱导的猪HoxalO基因启动子的分离克隆及深入研究，不仅有助于研究猪HoxalO基因对母猪妊娠和胚胎发育的作用，还可以指导转基因育种，创造巨大的经济效益和社会效益，更好的为人类生产生活服务。本发明就是利用有关分子生物学方法，从猪基因组中分离克隆了 HoxalO基因及其上游四个不同长度的启动子区域，分别构建不同长度的启动子荧光素酶质粒，鉴定雌激素刺激条件下在受体细胞中调控活性最高的启动子片段，并在受体细胞验证了该启动子的调控作用。为下一步研究子宫内膜特异高表达启动子制备高繁殖力的转基因猪，达到增加母猪产仔数的目的奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得一种适用于猪雌激素诱导的启动子及应用。本发明通过基因克隆方法，从猪基因组中分离克隆一个子宫内膜高表达的HoxalO 基因包含完整CDS区域的DNA片段及该基因启动子区域DNA片段，该启动子片段在雌激素诱导条件下可以增强子宫内膜细胞中猪HoxalO基因的表达。通过分子克隆的方法构建猪HoxalO基因雌激素诱导启动子荧光素酶质粒，在细胞水平对其功能进行验证，以便用于猪HoxalO基因功能研究，子宫内膜高表达启动子筛选，以及提高母猪繁殖力的研究。本发明的技术路线见图I所示。本发明所采用的技术方案是猪HoxalO基因包含完整⑶S区域的DNA片段扩增及组织表达谱分析，它包括下列步骤I)利用美国国立生物研究所网站NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)数据库信息中人和小鼠HoxalO基因序列信息钓取猪HoxalO基因DNA序列(猪基因组登录号(即第18号染色体)Gene ID : 100521236)，设计引物，以猪总DNA为模板，通过PCR扩增得到猪HoxalO基因包含完整⑶S区域的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，其中外显子区域位于该序列的第10-970和第2160-2434bp处；内含子区域位于第971-2159bp处，序列长度为2552bp，并进行测序。序列分析表明猪HoxalO基因包含一个1236bp的开放阅读框，编码411个氨基酸的蛋白质，包含一个Homo家族同源结构域(site:370to 393)BLASTP分析显示其与已有报道的人HOXAlO基因、小鼠HoxalO基因的氨基酸序列同源性分别高达95%和 90%。2)为研究猪HoxalO基因在猪不同组织中表达情况，申请人利用半定量RT-PCR技术对该基因在猪子宫内膜等18个不同组织中的表达谱进行了分析，结果见图2。表明猪HoxalO基因在子宫内膜中高度表达。申请人:构建了一种猪HoxalO基因雌激素诱导启动子质粒，它包括下列步骤I)为进一步研究猪HoxalO基因在子宫内膜的表达调控，通过BLAST比对以及启动子预测软件分离克隆了该基因启动子区域DNA片段(2076bp)，该引物核苷酸序列如下实施例I所示，并进行测序，其核苷酸序列如SEQ IDNO :3所示。经启动子分析软件分析该启动子片段结构，发现该序列含有一些顺式作用元件，其中包含ERl (位于该序列的第-543-(-530)bp处)、ER2(位于该序列的第-295-(-283) bp处)、SPl (位于该序列的第-739-(-734)、第-355-(-350)和第-255-(-246)bp处)等转录因子结合位点；2)克隆猪HoxalO基因启动子区HProl、HPro2、HPro3、和HPro4共4个不同长度的启动子片段(其核苷酸序列分别如SEQ ID NO :3-6所示)，扩增上述四个启动子片段的引物对的核苷酸序列如实施例3所示。将这些启动子片段分别插入pGL3-Basic质粒的MluI和HindIII酶切位点间，构建4个猪HoxalO基因启动子荧光素酶载体，转染ISHIKAWA子宫内膜癌细胞系，经雌激素刺激后检测荧光素酶活性，鉴定活性最高的启动子片段，申请人将该启动子荧光素酶载体命名为PGL3-P1X)，该载体的核苷酸序列如SEQID NO 7所示；3)设计特异引物引入HindII和KpnI酶切位点扩增猪HoxalO基因包含完整CDS的DNA片段，将该DNA片段插入pcDNA3. I (+)质粒的HindII和KpnI酶切位点间，构建包含猪HoxalO基因包含完整⑶S的DNA片段的pc3. I-DNA质粒，筛选得到经雌激素刺激后荧光素酶活性最高的启动子片段(其序列见SEQID NO 5)插入到pc3. I-DNA质粒的MluI和HindIII酶切位点间，构建得到pc3. I-Pro-DNA质粒(其核苷酸序列如SEQIDN0 8所示)；转染ISHIKAWA子宫内膜癌细胞系，验证该质粒pc3. I-Pro-DNA对猪HoxalO基因的调控作用。本发明的优点在于
I)本发明首次分析了猪HoxalO基因启动子不同长度的片段的活性，找到活性较高的片段HPix)3，构建启动子载体pGL3-Pix)，该启动子受雌激素诱导后活性提高。2)本发明获得了受雌激素诱导的在子宫内膜癌细胞活性较高的启动子，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。更详细的技术方案参见《具体实施方式
》的内容。
序列表SEQ ID NO I是本发明分离克隆的猪HoxalO基因包含完整⑶S区域的核苷酸序列，其中外显子区域位于该序列的第10-970和第2160-2434bp处；内含子区域位 于第971-2159bp处，序列长度为2552bp。序列表SEQ ID NO 2是本发明用于检测猪HoxalO基因组织表达谱利用RT-PCR扩增得到的HoxalO部分cDNA应用的核苷酸序列，长度为425bp。序列表SEQ ID NO 3是本发明克隆的猪HoxalO基因启动子HProl的核苷酸序列，长度为2076bp。序列表SEQ ID NO 4是从所述的SEQ ID NO :3核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子HPro2应用的核苷酸序列，长度为1527bp。序列表SEQ ID NO 5是从所述的SEQ ID NO :3核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子HPro3应用的核苷酸序列，长度为1062bp。序列表SEQ ID NO 6是从所述的SEQ ID NO :3核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子，即本发明用于构建猪HoxalO基因雌激素诱导启动子质粒的启动子HPro4应用的核苷酸序列，长度为474bp。序列表SEQ ID NO 7是本发明构建的包含猪HoxalO基因雌激素诱导启动子片段的真核表达质粒pGL3-Pro的核苷酸序列,全长5848bp。序列表SEQ ID NO 8本发明构建的包含猪HoxalO基因雌激素诱导启动子片段和猪HoxalO基因包含完整⑶S区域的DNA片段，全长8365bp。序列表SEQ ID NO 9本发明用于检测猪HoxalO基因定量表达谱利用Q-PCR扩增得到的HoxalO部分cDNA应用的核苷酸序列，长度为113bp。
图I :本发明的技术路线图。图2 :半定量RT-PCR分析HoxalO基因在猪18个不同组织中的表达模式；上下列分别表示的为HoxalO基因和内参猪P -actin基因在各个组织中的表达情况，其中I心2肝3脾4肺5肾脏6脑7胃8肌肉9脂肪10淋巴11膀胱12肠13骨髓14睾丸15附睾16皮肤17卵巢18子宫内膜。图3 :猪HoxalO基因不同缺失片段转染人子宫内膜癌细胞后，双荧光素酶活性检测结果。图4 :猪HoxalO基因启动子受雌激素诱导后调控功能细胞验证定量验证结果。图5 :人子宫内膜癌细胞(ISHIKAWA)RNA提取电泳图。图6 :本发明所用的pEasy-Blunt Simple载体信息。
图7 :本发明所用的pGL3-Basic载体信息。图8 :本发明所用的pcDNA3. I (+)载体信息。图9 :本发明构建的p-Easy-DNA载体信息。图10 :本发明构建的pGL3_Pro载体信息。图11 :本发明构建的pc3. I-Pro-DNA载体信息。
具体实施例方式猪子宫内膜高表达基因HoxalO基因的克隆、表达、雌激素诱导启动子分离及细胞验证。实施例I猪HoxalO基因包含完整⑶S区域的DNA片段克隆(相应分子生物学常规操作参考J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》，1996版，科学出版社)梅山猪基因组DNA的抽提以成年“梅山猪”(一种报道的中国地方猪品种，购自华中农业大学试验猪场)耳组织为实验材料抽提其基因组DNA，具体方法参照Murray报道的CTAB法(Murray and Thompson. 1980)，抽提出的DNA完全溶解后置于_20°C冰箱保存。在生物信息学网站NCBI (http:"www. ncbi. nlm. nih. gov/)中提取人、小鼠Hoxa10基因mRNA序列，通过BLASTN比对，该基因在人和小鼠中核酸序列同源性达90 %。利用DNAstar软件拼接两条序列，利用该拼接产物在NCBI网站钓取猪EST序列，将所有EST序列拼接得到猪Hoxa10基因全长cDNA序列；根据猪Hoxa10基因全长cDNA序列在GeneBank中找到了对应的基因组序列(猪基因组登录号Gene ID : 100521236)，位于猪第18号染色体上。利用Primer5软件设计特异性引物，并在引物上下游分别加入限制性内切酶HindIII (购自Fermentas湖北晶茂生物技术有限公司)和KpnI (购自Fermentas湖北晶茂生物技术有限公司)酶切位点(以下划线部分表示，)及相应的保护碱基(以斜体表示)，利用PCR法，以抽提的梅山猪基因组DNA为模板，通过设计特异引物HFl (5/ -AAAMGCTTTGCACAAGAAATGTCAGCCAGA-3' )、HF2 (5' -AAAGGTACCGCAGAGCCGATGACAGAG-3')，用高保真酶PrimerStar with 2*GC Buffer (购自宝生物工程大连有限公司)扩增猪HoxalO基因包含完整CDS区域在内的DNA片段2552bp。PCR反应条件98°C 30s，98°C 10s，60°C5s，72°C lmin30s，30个循环，72°C 5min，4°C保存。反应体系为2*GC Buffer50ul
dNTP Mix8ul
引物HFl3ul
引物HF23 ul
PrimerStarIul
DNAIOul
ddH2025ul
TotalIOOul 取5ulPCR产物用1%琼脂糖电泳检测。剩余的PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收(购自北京百泰克生物技术有限公司)后连pEasy-Blunt Simple质粒(购自北京全式金生物技术有限公司)上，37°C连接15min，转化后涂板，筛选阳性克隆p-Easy-DNA (图9)并送Invitrogen公司测序,序列为SEQ ID NO :1。连接体系为HoxalOPCR 产物4 U IpEasy-Blunt Simple Vctor IulTotal5ul测序结果显示来源于“梅山猪”基因组的HoxalO基因序列与拼接出的预测序列100%相同。实施例2猪HoxalO基因的组织表达谱检测的材料准备取“梅山猪”的心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肌肉、脂肪、淋巴、膀胱、肠、骨髓、睾丸、附睾、皮肤、卵巢和子宫内膜共18个组织样品，RNA提取使用RNAprep pure Tissue Kit (购自天根生化科技(北京)有限公司)的进行，按照试剂盒的说明书操作。总RNA经I. 2%琼脂糖胶电泳检测和浓度测定确认质量合格(18S、28S两条主带清晰无拖尾，0D260/0D280 = I. 8-2. 0)后方可进行后续试验。将各个组织的RNA反转录成cDNA，置于_20°C冰箱保存。反转录使用的试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (购自 Fermentas 湖北晶茂生物技术有限公司)，按照产品说明书操作即可。猪HoxalO的⑶S区域大小为1236bp，编码411个氨基酸(见序列表SEQIDN0 1)。设计能扩增跨内含子的部分mRNA的RT-PCR引物(HBF1 5 ' -TGCCTGTGCCCGGCTACTT-3 '，HBRl 5 ' -CAGCGTCTGGTGCTTGGTGT-3 '，扩增大小为425bp，序列为SEQ ID NO :2)，以心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肌肉、脂肪、淋巴、膀胱、肠、骨髓、睾丸、附睾、皮肤、卵巢和子宫内膜共18个组织的RNA反转录产物为模板，以猪P -actin基因(登录号 gi I 298162948)为内参(扩增引物为 actFl 5 ' -TCTGGCACCACACCTTCT-3 '，actRl :5' -TGATCTGGGTCATCTTCTCAC-3' )。PCR 反应条件95°C 5min,95°C 30s, 60°C 30s,72°〇408，30个循环，7215111111。反应体系为I O5lcBufferIuI
dNTP Mix0.8ul
HBFl/actFl0_3ul
HBRl/ actRl0.3ul
rTaqO.lul
cDNAIul
ddF^O6.5ul
TotalIOul PCR产物经2%琼脂糖胶电泳检测。检测结果见附图2。结果显示，猪HoxalO基因在子宫内膜、肾脏和膀胱中高表达，在肌肉、淋巴、附睾和卵巢中有较弱表达，在其他组织不表达。实施例3猪子宫内膜高表达基因HoxalO启动子候选片段及相应缺失片段的获得(相应分子生物学常规操作参考J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》，1996版，科学出版社)梅山猪基因组DNA的抽提以成年梅山猪耳组织为实验材料抽提其基因组DNA，具体方法为Murray报道的CTAB法(Murray and Thompson. 1980)，抽提出的DNA完全溶解后置于-20°C冰箱保存。在生物信息学网站NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上提取猪 HoxalO 基因(Gene ID =100521236)的上游序列，具体来讲是-2058至+18 (转录起始点为+1)区间共计2076bp，其序列如SEQ ID NO :3所示，作为启动子候选片段，将该启动子命名为HProl。利用Primerf软件设计特异性引物，并在引物上下游分别加入限制性内切酶MluI (购自Fermentas湖北晶茂生物技术有限公司)和HindIII (购自Fermentas湖北晶茂生物技术有限公司)酶切位点(以下划线部分表示)及相应的保护碱基(以斜体表示)，利用PCR法，以抽提的梅山猪基因组DNA为模板，设计了如下所示的引物对，其核苷酸序列如下所示HPF I :5' - Trn ACGCGTTGTGTGTTTGTGCGATGTGGA-3'； HPRl : 5' - CCC AAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'；用高保真酶PrimerStar with 2*GC Buffer (购自宝生物工程大连有限公司)扩增 HProl 启动子片段。PCR 反应条件98°C 30s, 98°C 10s, 60 °C 5s, 72°C lmin30s，30 个循环，72°C 5min，4°C保存。反应体系为2*GC Buffer50ul
dNTP Mix8ul
HPFl3ul
HPF23ul
PrimerStarIul
DNAIOul
(WH2O25ul
TotalIOOul取5ul的HProlPCR产物用I %琼脂糖电泳检测。剩余的PCR产物回收用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)后连入pEasy-BluntSimple质粒(购自北京全式金生物技术有限公司)上，37°C连接15min,转化后涂板,筛选阳性克隆并送Invitrogen公司测序，其序列见序列为SEQ ID NO :3。连接体系为HProlPCR 产物4 y IpEasy-Blunt Simple Vctor IulTotal5ul测序结果显示来源于“梅山猪”基因组的HProl序列与NCBI上报道猪HoxalO基因序列为100%相同。三个5'缺失片段与HProl启动子片段共用同一个反向引物，其核苷酸序列如下所示(引物前面的英文字母F代表正向引物，R代表反向引物)，如下 HPRl : 5' - CCC AAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'；HPF2:5' - AAA ACGCGTTCCAGGCGTTCAGCAGTTCC-3'；HPF3 :5' - AAA ACGCGTGTTCTTGTCATAGCCTCGGG-3'；HPF4:5' - AAA ACGCGTGGCTGAATGGGAAGAGCTTG-3'；在每条正向引物5'端都引入MluI酶切位点(以下划线部分表示)及相应的保护碱基(以斜体表示)。PCR模板为测序正确的p-Easy-HProl质粒。得到扩增产物之后，后续操作按照构建p-Easy-HProl的方法进行。采用一系列启动子分析软件，如Softberry 网站(http://www. softberry. com)的 TSSP 软件、PROSCAN 软件(http://bimas. dcrt. nih. gov/molbio/proscan)、TESS 软件http://searchlauncher. bcm. tmc. edu/seq-search/gene-search. html)、PromoSer 软件(http://biowulf.bu.edu/zlab/PromoSer/)、以及 FirstEF 软件(http://rulai.cshl.org/tools/FirstEF/)等分析猪HoxalO基因启动子的结构。发现在HoxalO基因启动子第-543- (-530) bp处是雌激素受体结合位点ERl，第-295- (-283) bp处是雌激素受体结合位点ER2，第-739-(-734)、第-355-(-350)和第-255-(-246) bp处分别是三个SPl结合位点(见序列表SEQ ID NO 3) o实施例4猪子宫内膜高表达基因HoxalO启动子候选片段及相应缺失片段的荧光素酶质粒构建(相应分子生物学常规操作参考J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》，1996版,科学出版社)将实施例3 中所述 p-Easy-HProl、p-Easy-HPro2> p-Easy-HPro3> p-Easy-HPro4质粒用MluI (购自Fermentas湖北晶茂生物技术有限公司)和HindIII限制性内切酶(购自Fermentas湖北晶茂生物技术有限公司)双酶切，回收纯化后，分别插入到pGL3_Basic质粒(购自promega普洛麦格(北京)生物技术有限公司)的MluI和HindIII酶切位点之间，得到四个重组质粒，将获得的重组质粒测序鉴定，结果表明四个启动子片段均成功插入到pGL3-Basic质粒中；将鉴定表明正确的启动子荧光素酶重组质粒命名为pGL3_HProl、pGL3-HPro2、pGL3-HPro3 和 pGL3_HPro4。插入四个启动子片段的p-Easy质粒酶切体系为
MluI8ul HindIII8ul
Buffer R20ul
质粒20ul
ddH2021ul
Total200ulpGL3-Basic质粒酶切体系为
MluI8ul
HindIII8ul
Buffer R20ul
pGL3-Basic12ul
ddH20152ul Total 200ul37。〇酶切411。连接体系为
10*T4 Ligase Buffer Iul
T4 DNA LigaseO.lul
连接产物2ul
载体0.5ul
dd H2O6.5ul
TotalIOulI6 °C连接过夜。实施例5猪子宫内膜高表达基因HoxalO启动子候选片段及相应缺失片段雌激素刺激条件下转录活性的体外鉴定，具体方法是将人子宫内膜癌细胞系ISHIKAWA培养于1640完全培养基中(购自美国Gibco公司(武汉生命技术有限公司代理))(10%胎牛血清FBS(购自美国Gibco公司(武汉生命技术有限公司代理))、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺)37°C，5% CO2条件下培养。转染前一天，将细胞分别传代于两个24孔板(各传15个孔，每种处理设三个重复)，用不含双抗的培养基培养过夜，第二日按Roche FuGENE HD转染试剂盒(购自Roche(武汉飞羿科技有限公司代理))说明书的要求将pGL3-HPix)l、pGL3-HPro2、pGL3-HPro3和pGL3_HPro4四个启动子荧光素酶重组质粒以及pGL3_Basic质粒(购自Promega普洛麦格(北京)生物技术有限公司)分别转染人子宫内膜癌细胞系ISHIKAWA。转染后24h，一个24孔板内加入浓度为l(T7mol/l的17Beta_estradiol (购自Sigma-Aldrich公司(上海))，继续培养IOh后检测双荧光素酶活性，以另一个24孔板的未加17Beta_estradiol (未诱导组)的ISHIKAWA细胞作为对照。启动子荧光素酶活性检测结果(见图3)表明，四个启动子质粒荧光素酶活性均高于pGL3-Basic质粒，其中pGL3_HPro3质粒在未诱导组四个启动子质粒中荧光素酶活性最低，而在雌激素(UBeta-estradiol)诱导组中荧光素酶活性最高(上升了 4. 3倍)，并 且两组数值差异显著(P < 0. 05)。因此鉴定出长度1062bp的HPro3启动子片段在雌激素(UBeta-estradiol)诱导条件下转录活性最高，将该启动子荧光素酶质粒片段命名为pGL3-Pro (图 10)。实施例6pc3. l-Pro-DNA 载体构建以猪HoxalODNA为目的基因，以HPro3为调控元件，以pcDNA3. 1(+)质粒(购自Promega普洛麦格(北京)生物技术有限公司)为框架，替换cmv启动子,构建目标质粒pc3. I-Pro-DNA(图11)。将实例5中所述pGL3_Pro质粒和pcDNA3. I (+)质粒分别用MluI (购自Fermentas生物技术深圳有限公司)和HindIII (购自Fermentas生物技术深圳有限公司)限制性内切酶(双酶切，将回收纯化后的PGL3-P1X)质粒，插入到回收纯化后的pcDNA3. I (+)质粒的MluI和HindIII酶切位点之间，得到重组质粒，将获得的重组质粒测序鉴定。将实施例I中所述p-Easy-DNA质粒用HindIII和KpnI限制性内切酶双酶切，回收纯化后插入到鉴定表明正确重组质粒pc3. I-Pro的HindIII和KpnI酶切位点之间，将得到的重组质粒命名为pc3. I-Pro-DNA (图11)。pGL3-Pro质粒酶切体系为
MluI2.5ul
HindIII2.5ul
Buffer R5ul
质粒25ul
ddH2015ul
Total50ulpcDNA3. I (+)质粒酶切体系为MluI7.5ul
HindIII7.5ul
Buffer R15ul
pGL3-Basic29ul
ddH209 Iul
Total150ul 37 dC 酶切 4h。
连接体系为
10*T4 Ligase BufferIul
T4 DNA LigaseO.lul
连接产物7.4ul
载体1.5ul16DC连接过夜。pc3. I-Pro质粒酶切体系为
KpnI2ul
HindIII8ul
Buffer KpnIIOul
质粒20ul
ddH2060ul
TotalIOOulp-Easy-DNA质粒酶切体系为
KpnIIul
HindIII4ul
Buffer KpnI5ul
质粒IOul
ddH2030ul
Total50ul37 dC 酶切 4h。连接体系为
10*T4 Ligase BufferIul
T4 DNA Ligase0.2ul
连接产物7.5ul
载体1.3ul16 °C连接过夜。
实施例7HPro3雌激素刺激下上调HoxalO基因表达体外验证将人子宫内膜癌细胞ISHIKAWA培养于1640完全培养基中(10% (v/v)胎牛血清FBS((购自美国Gibco公司(武汉生命技术有限公司代理)))，100u/ml青霉素，100mg/ml链霉素，2mmol/LL-谷氨酰胺)37°C，5% C02条件下培养。转染前一天，将细胞分至24孔板(传12个孔)，用不含双抗(100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素)的培养基培养过夜，第二日按Roche转染试剂盒说明书的要求将载体质粒pc3. I-Pro-DNA转染其中7_12共6个孔的人子宫内膜癌细胞ISHIKAWA，转染后24h换液并在4_6孔和7-9孔中加入10_7mol/l的雌激素(17Beta-estradiol (E2)(购自Sigma-Aldrich公司(上海)))继续培养IOh后，收集细胞，提取细胞RNA。RNA提取使用RNAPrep pure Cell/Bacteria Kit(购自天根生化科技(北京)有限公司)的进行。将人子宫内膜癌细胞ISHIKAWA中提取的细胞总RNA经I. 2%琼脂糖胶电泳检测和浓度测定确认其质量合格(图5) (18S、28S两条主带清晰无拖尾，RNA的纯度与浓度纯度利用NanoDrop 2000Spectrophotometer (购自美国NanoDrop公司)检 测，根据记录的A260/A280比值，估测RNA质量，一般A260/A280在I. 8_2. O之间，蛋白质含量为零时可以满足本试验的要求)后方可进行后续试验。将各个细胞的RNA反转录成cDNA，置于-20°C冰箱保存。反转录使用的试剂盒RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit(购自Fermentas湖北晶茂生物技术有限公司)，按照产品说明书操作即可。对提取的细胞cDNA进行实时定量PCR分析，用目的引物与内参引物分别对样品cDNA进行扩增。目的引物(HDLF1:5, -TGGGAGGCAAGCGCAATG-3'，HDLRl :5' -CGCGTCCAGCCACAAGTCTAT-3'，扩增大小为113bp，其序列见SEQ ID NO :9所示)，以只转染pc3. I-Pro-DNA质粒、转染pc3. I-Pro-DNA 质粒 24 小时后用 10 7mo 1/1 的 17Beta_estradiol 刺激；只用 10 7mol/l 的17Beta-estradiol刺激和空白对照(每种处理设三个重复)共12个细胞的RNA反转录产物为模板，以人GAPDH基因(Gene ID :2597)为内参(用于扩增的引物为homo-GAPDHFl 5 ’ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，，homo-GAPDHRl 5，-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，)。PCR反应条件95°C 5min，95°C 15s，60°C 30s，72°C 30s，40 个循环，熔解曲线从 58V到 95°C，每2. 2°C循环一次20s。反应体系为
SYBGIOul
HDLFI / homo-GAPDHF I0.4ul
HDLF2/ homo-GAPDHRl0.4ul
RoxDyeIII0.4ul
cDNA2ul
ddH206.8ul
Total20ul检测结果见图4。结果显示，转染pc3. I-Pro-DNA质粒后，ISHIKAWA细胞中HoxalO基因的表达量比处理细胞升高了 I. 2倍，差异不显著。转染pc3. I-Pro-DNA质粒后，又加A 17Beta-estradiol刺激的ISHIKAWA细胞中HoxalO基因的表达量比未处理细胞升高了28. 5倍,差异显著(p = 0. 03)。证明pc3. I-Pro-DNA载体可以通过雌激素诱导增强HoxalO基因的表达。
参考文献I.王莉兴等，猪产仔数相关候选基因的研究进展，上海畜牧兽医通讯，2008，(4)，11-142. Bagot CN,Troy PJ,Taylor HS. Alteration of maternal HoxalOexpression byin vivo gene transfection affects implantation. Gen Ther 2000 ；7 :1378-84.3. Taylor HS，Arici A,Olive D，Igarashi P. H0XA10 is expressed in responseto sex steroids at the time of implantation in the human endometrium. J ClinInvest 1998 ；101 :1379-84.4.Akbas GE，Song J, Taylor HS. A H0XA10 estrogen response element(ERE)isdifferentially regulated by 17Beta Estradiol and Diethylstilbestrol(DES). J MolBiol 2004 ；340 :1013-23.
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权利要求
1.一个猪雌激素诱导启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:5所示。
2.ー种包含猪雌激素诱导启动子的荧光素酶质粒的构建方法，其特征包括以下步骤 1)通过猪基因组与NCBI小鼠和人HoxalO基因DNA序列比对，设计一对引入HindIII和 KpnI 双酶切位点的引物HF I :5' -AAAAAGCTTTGCACAAGAAATGTCAGCCAGA-3'，HF2 :5'-AAAGGTACCGCAGAGCCGATGACAGAG-3'，以猪总DNA为模板，扩增猪HoxalO基因包含完整CDS区域的DNA片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO : I所示，片段长度为2552bp ； 2)提取猪组织的RNA，设计ー对跨猪HoxalO基因内含子的引物，该引物的核苷酸序列如下HBFl :5' -TGCCTGTGCCCGGCTACTT-3 ' , HBRl :5' -CAGCGTCTGGTGCTTGGTGT-3 ';通过RT-PCR方法，扩增得到长度为425bp的猪HoxalO基因cDNA片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示；检测该基因在猪组织中的表达，确定该基因在猪子宮内膜中是否高表达； 3)通过猪基因组与NCBI小鼠和人HoxalO基因DNA序列比对,设计如下所不的引物对 HPF I :5' -TCGACGCGTTGTGTGTTTGTGCGATGTGGA-3'；HPRl :5' -CCCAAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'；HPro2:5' -AAAACGCGTTCCAGGCGTTCAGCAGTTCC-3'；HPRl :5' -CCCAAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'；HPro3 :5' -AAAACGCGTGTTCTTGTCATAGCCTCGGG-3'；HPRl :5' -CCCAAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'；HPro4:5' -AAAACGCGTGGCTGAATGGGAAGAGCTTG-3'；HPRl :5' -CCCAAGCTTACATGCTGAATACGATTAGCAATC-3'； 引入MluI和HindIII双酶切位点，以猪总DNA为模板，扩增猪HoxalO基因启动子区域四个DNA片段，其长度分别为2076bp、1527bp、1062bp和474bp，将其命名为HProl、HPro2、HPro3和HPro4启动子片段，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO :3_6所示； 4)将步骤3)所述的带有MluI和HindIII酶切位点的启动子片段HProl、HPro2、HPro3和HPro4，构建至双荧光素酶载体报告系统pGL3-Basic中获得pGL3_HProl，pGL3_HPro2，pGL3-HPro3 和 pGL3_HPro4 载体； 5)将步骤4)中四个启动子荧光素酶载体转染两组子宫内膜癌细胞ISHKAWA，第一组直接检测荧光素酶活性，第二组经雌激素刺激后检测荧光素酶活性，筛选得到检测活性最高的质粒，将其命名为PGL3-P1X)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 7所示； 6)将pcDNA3.I (+)质粒用MluI和HindIII双酶切切除该质粒CMV启动子； 7)将步骤5)中筛选出的荧光素酶活性最高的质粒定向插入步骤6)中pcDNA3.1(+)质粒的MluI和HindIII双酶切切点之间，构建得到ー个中间质粒； 8)将步骤7)中的中间质粒用HindIII和KpnI双酶切； 9)将步骤I)中扩增得到的HoxalO基因的包含完整⑶S区域的DNA片段定向插入到步骤8)所述的中间质粒的HindIII和KpnI双酶切切点之间，构建包含猪HoxalO基因雌激素诱导启动子片段和猪HoxalO基因包含完整CDS区域的DNA片段的质粒pc3. l-Pro_DNA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:8所示。
3.权利要求I所述的启动子在调控猪HoxalO基因表达中的应用。
全文摘要
本发明属于动物基因工程应用领域。具体涉及猪雌激素诱导启动子及应用。从梅山猪中克隆Hoxa10基因DNA片段(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示)及其上游4个不同启动子缺失片段，它们分别为HPro-1、HPro-2、HPro-3和HPro-4。将这些片段构建至pGL3-Basic载体中，经过雌激素(17Beta-estradiol)后确定HPro-3活性相对较强(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO5所示)。将HPro-3片段与包含猪Hoxa10基因完整CDS区域的DNA片段插入pcDNA3.1(+)质粒，构建猪Hoxa10基因雌激素诱导启动子质粒pc3.1-Pro-DNA，在人子宫内膜癌细胞系中验证该启动子经雌激素诱导后可以增强猪Hoxa10基因表的表达。本发明同时公开了四个不同缺失启动子片段的获得、相应重组表达载体的制备方法，从而为雌激素诱导外源基因在子宫内膜组织中高效表达提供了新的遗传资源。
文档编号C12N15/66GK102796738SQ20111013737
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月21日 优先权日2011年5月21日
发明者赵书红, 吴迪, 李长春, 李新云, 曹建华, 余梅 申请人:华中农业大学