专利名称：一种与植物耐盐性相关的miRNA——gma-miRN11及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与植物耐盐性相关的miRNA，尤其是一种来源于大豆根瘤的、能够调节大豆耐盐性的新miRNA ；本发明还涉及此miRNA的前体、其前体的编码基因及其用途。
背景技术：
miRNA是近年来研究发现的一种长20 24 nt的内源性非蛋白编码RNA。miRNA 基因最初转录产生具有颈环结构的pre-miRNAs。随后pre-miRNA被转运出核，在细胞质中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通过序列互补与特定靶基因的mRNA结合，引起mRNA 降解或抑制mRNA翻译从而对基因的表达起到负调节作用(Llave et al. , 2002; Palatnik et al. , 2003; Tang et al. , 2003)。土壤盐渍化严重影响着植物的生长与发育，制约着农业生产。大豆是世界上重要的蛋白和油料作物。植物在应对盐胁迫时会有一系列的保护机制，研究大豆抗盐的分子机制，培育大豆耐盐新品种是提高大豆产量的一个主要途径。目前，在植物抗盐机制研究中， 研究较为清楚的是SOS途径(Qiu et al. , 2002; Quintero et al.，2002)，大豆中也克隆到了一些抗盐相关的基因(Li et al. , 2005; Liao et al. , 2008; Xie et al. , 2009; Cheng et al.，2009)。另外，有研究表明，microRNA (miRNA)在植物抗盐机制中也发挥重要作用(Zhu et al. , 2004; Jung et al. , 2007; Zhao et al. , 2009)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种与植物耐盐性相关的miRNA、其前体序列及其前体序列的编码基因，利用此miRNA能够提高大豆的耐盐性，对提高大豆产量具有重大的意义。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。一种与植物耐盐性相关的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO 1所示的序列。上述与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列，其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。编码上述与植物耐盐性相关的miRNA前体序列的DNA序列，其具有序列表中SEQ ID NO 3所示的序列。上述与植物耐盐性相关的miRNA在培育耐盐转基因植物中的应用。作为上述应用的一种优选技术方案，所述耐盐转基因植物为大豆。作为上述应用的一种优选技术方案，在大豆中过表达SEQ ID NO :1所示的miRNA， 或抑制SEQ ID NO 1所示miRNA的表达，培育出具有高耐盐性的转基因大豆。采用上述技术方案所产生的有益效果在于本发明提供了一种新的大豆miRNA， Solexa测序和实时荧光定量PCR检测结果表明，本发明miRNA的表达受到盐胁迫的调节，说明其在大豆适应高盐胁迫机制中起重要作用，基于此，可利用其培育具有高耐盐性的转基因大豆，对提高大豆产量具有重大的意义。
图1为gma-miRNll在Solexa测序中盐胁迫和非盐胁迫条件下表达次数的较， 结果显示，gma-miRNll在正常生长条件下表达数为0，盐处理后表达次数为475，表明 gma-miRNll的表达受到盐胁迫的调节，说明其在大豆适应高盐胁迫机制中起重要作用。图2为gma-miRNll前体序列的茎环结构图，可见其前体序列折叠成一种稳定的茎环结构，属于miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA前体的结构特征。图3为实时荧光定量PCR对gma-miRNll在盐胁迫条件下和非盐胁迫条件下表达特征的分析结果，结果显示gma-miRNll的表达受盐诱导明显上调，说明其在大豆适应高盐胁迫机制中起重要作用。
具体实施例方式以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验， 结果取平均值。本发明提供的miRNA来源于大豆成熟根瘤，命名为gma-miRNll，其长度为21nt ；参看附图2，其前体序列可折叠成一种稳定的茎环结构，属于miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA前体的结构特征。实施例1 =Solexa测序分析验证gma-miRNll在大豆耐盐机制中的作用一、材料培养及NaCl处理
猴子毛大豆种子用70%的酒精灭菌30 S，dH20冲洗6遍后播种于无菌培养皿中，皿底置2张无菌滤纸，dH20浸湿，28 °C暗萌发3天；芽长至2 cm时，移至放有湿润滤纸的试管中，芽长至4 5 cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接种30 min，低N水培，10，000 lx，温度为26 °C，相对湿度为70%，培养28天，125 mM NaCl处理5小时，对照为正常环境，取根瘤， 液氮冷冻，_80°C储藏。二、Solexa 测序分析
上步所得样品送往华大基因公司，进行solexa测序及分析，参看图1，结果显示， gma-miRNll在正常生长条件下表达数为0，盐处理后表达次数为475，这表明gma-miRNll的表达受到盐胁迫的调节，说明其在大豆适应高盐胁迫机制中起重要作用，在大豆中过表达 gma-miRNll，或抑制gma-miRNll的表达，将影响大豆对盐胁迫的适应能力，培育出具有高耐盐性的转基因大豆，对提高大豆的产量具有重大的意义。实施例2 实时荧光定量PCR (Real-time PCR)分析验证gma-miRNll在大豆耐盐机制中的作用
一、材料培养及NaCl处理
猴子毛大豆种子用70%的酒精灭菌30 S，dH20冲洗6遍后播种于无菌培养皿中，皿底置2张无菌滤纸，dH20浸湿，28 °C暗萌发3天；芽长至2 cm时，移至放有湿润滤纸的试管中，芽长至4 5 cm，移至活化的根瘤菌菌液中，接种30 min，低N水培，10，000 lx，温度为26 °C，相对湿度为70%，培养28天，125 mM NaCl处理5小时，对照为正常环境，取根瘤， 液氮冷冻，"80°C储藏；
4二、miRNA的分离，用microRNA提取试剂盒(百泰克公司，Cat# RP5301)取样提取小片段RNA，提取方法如下
(1)勻浆处理所取根瘤用液氮在研钵内快速磨碎，每50 100mg组织加1 ml试剂盒内的裂解液后勻浆；
(2)将勻浆样品剧烈震荡混勻，在15 30°C条件下孵育5min以使核蛋白体完全分
解
(3)在4°C的条件下12，000rpm离心10 min，小心取上清转入一个新的RNase free 的离心管中；
(4)每1ml裂解液加0. 2 ml氯仿；盖紧样品管盖，剧烈振荡15s并将其在室温下孵育 3min ；
(5)样品于4°C、12，000rpm离心10 min，会分成三层下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中；水相层的容量大约为所加裂解液体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作；
(6)加入0.6倍体积70%乙醇，颠倒混勻(此时可能会出现沉淀)；得到的溶液和可能沉淀一起转入microRNA提取试剂盒内的吸附柱RA中；
(7)10，000rpm离心45 s，收集下滤液(下滤液中含有miRNA)，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，颠倒几次混勻，将混合液倒入到microRNA提取试剂盒内的吸附柱RB中，10，000 rpm离心30 s，弃掉废液；
(8)加入700μ 1试剂盒内的漂洗液RW，12，000 rpm离心60 s，弃掉废液；
(9)加入500μ 1试剂盒内的漂洗液RW，12，000 rpm离心60 s，弃掉废液；
(10)将吸附柱RB放回空收集管中，12，000rpm离心2 min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
(11)取出吸附柱RB，放入一个RNasefree离心管中，在吸附膜中间部位加60 80 μ 1 RNase free water (事先在65 70°C水浴中加热)，室温放置2 min，然后12,000 rpm离心1 min ；收集得到纯净microRNA保存于-80 °C冰箱；
三、反转录为cDNA，利用天根miRNAcDNA第一链合成试剂盒将纯化的miRNA反转录为 cDNA
(DmiRNA的Poly㈧加尾，反应液配方为(除miRNA外的各成分均取自上述试剂盒) miRNA, 6 μ 1 ;E_PAP (5U/μ 1 )，0. 4 μ 1 ;10XPAP Buffer, 2 μ 1 ；5XrATP solution, 4 μ 1 ；Nuclease-free Water, 7. 6 μ 1 ；总体积，20 μ 1 ；轻轻混勻上述配制的反应液，短暂离心使得管壁上的反应液沉落，37°C反应60min;所得反应液可以直接进行下游实验，也可以放置在-20°C短暂保存，如需长期保存存放于-80°C ；
(2) Poly(A)修饰的miRNA进行逆转录反应，反应液配方为(除Poly (A)反应液外的各成分均取自试剂盒):Poly(A)反应液，2 μ 1 ；10XRT primer,2y 1 ；10XRT Buffer,2y 1 ；超 t屯 dNTP Mixture(2. 5Mm),1 μ 1 ；Rnasin(40U/μ 1)，1 μ 1；Quant Rtase,0. 5μ 1 ；RNase-free ddH20,1. 5μ 1 ；总体积，20 μ 1 ；轻轻混勻上述配制的反应液，短暂离心使得管壁上的反应液沉落，37。C反应60min ；合成的cDNA反应液放置_20°C保存，也可以直接进行下游荧光定量检测；
四、实时荧光定量PCR:混勻如下反应体系，然后分装入96孔光学板中，并覆盖上光学膜，扩增使用的仪器为 ABI公司的荧光定量PCR仪；
扩增程序为95 "C 30s ；95 "C 5 s，60 "C 34s,45 cycles ；95 "C 15 s，60 "C lmin, 95 "C 15 s ；
20 μ 1 反应体系配制如下DNA 模板，2 μ 1 ；SYBR Primix Ex taq (2X), 10 μ 1 ；PCR Forward PrimerClOy Μ),0. 4μ 1 ；PCR Reverse PrimerClOy M),0. 4μ 1 ；ROX Reference Dye II (50 X)，0. 4 μ 1 ;ddH20，6. 8 μ 1 ；总体积，20 μ 1 ;
弓丨物序列 *:N11-F:AAAGCCATGACTTACACACGC(SEQ ID NO 4) ；5. 8S rRNA-F ACGCCTGCCTGGGTGTCACAC (SEQ ID NO 5) ；AMRM :GCGAGCACAGAATTAATACGACT (SEQ ID NO: 6) ；(5. 8S rRNA为内参，AMRM为反向引物)； 五、结果
参看图3，实时荧光定量PCR分析的结果显示gma-miRNll的表达受盐诱导明显上调， 这同样表明gma-miRNll的表达受到盐胁迫的调节，在大豆中过表达gma-miRNll，或抑制 gma-miRNll的表达，将影响大豆对盐胁迫的适应能力，培育出具有高耐盐性的转基因大豆， 对提高大豆的产量具有重大的意义。 上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
权利要求
1.一种与植物耐盐性相关的miRNA，其特征在于其具有序列表中SEQ ID N0:1所示的序列。
2.权利要求1所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列，其特征在于其具有序列表中SEQ ID NO 2所示的序列。
3.编码权利要求2所述的与植物耐盐性相关的miRNA前体序列的DNA序列，其特征在于其具有序列表中SEQ ID NO 3所示的序列。
4.权利要求1所述的与植物耐盐性相关的miRNA在培育耐盐转基因植物中的应用。
5.根据权利要求4所述的与植物耐盐性相关的miRNA的用途，其特征在于所述耐盐转基因植物为大豆。
6.根据权利要求5所述的与植物耐盐性相关的miRNA的用途，其特征在于在大豆中过表达SEQ ID NO :1所示的miRNA，或抑制SEQ ID NO :1所示miRNA的表达，培育出具有高耐盐性的转基因大豆。
全文摘要
本发明公开了一种与植物耐盐性相关的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO1所示的序列；在大豆中过表达SEQ ID NO1所示的miRNA，或抑制SEQ ID NO1所示miRNA的表达，以培育出具有高耐盐性的转基因大豆，对提高大豆产量具有重大的意义。
文档编号C12N15/113GK102220331SQ20111015539
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年6月10日
发明者李霞, 石磊, 董章辉 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所