抗蓝藻重组抗体多肽及其基因与制备方法

专利名称：抗蓝藻重组抗体多肽及其基因与制备方法
技术领域：
本发明涉及环保生物技术，特别是一种抗蓝藻重组抗体多肽及其基因与制备方法。
背景技术：
水体过度营养化造成的蓝藻增生、水体污染是目前威胁世界范围水环境的最大危害，给人类造成巨大的经济损失，给地球生物圈造成无法修复的危害。随着我国经济发展造成的加速工业化和城镇化，生态环境污染和恶化日益加剧，水环境生态防治已成为我们必需面对和解决的重大问题。现用抗菌药物对蓝藻基本无效；蓝藻属细菌域第X门-蓝细菌门的一类原核细胞，目前能够控制蓝藻的只有重金属类化学制剂，如硫酸铜等。而在实际应用中，由于效果有 限，往往不惜超剂量多次重复用药，造成的结果是在杀伤蓝藻的同时也将水体中其他有益藻类、水生植物和生物破坏殆尽，给环境造成了无法逆转的永久性破坏。同时重金属类化学制剂在环境和农产品的残留量越来越大，因此人类急需开发高效且使用安全的抗蓝藻药物。

发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新型的重组抗蓝藻多肽的基因、重组质粒、多肽；此种多肽能特异的杀灭蓝藻细胞而不会伤害其他藻类细胞、植物和动物。本发明的再一目的是提供上述重组抗蓝藻多肽的制备方法。杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No. 4783。上述杂交瘤分泌的单克隆抗体。具有蓝藻识别结合能力的模拟抗体多肽，是上述单克隆抗体的抗原结合片段，或根据上述单克隆抗体的抗原结合片段上的功能区域设计而得的小分子多肽。所述模拟抗体多肽其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。编码上述模拟抗体多肽的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。抗蓝藻重组抗体多肽，由上述具有蓝藻识别结合能力的模拟抗体多肽可操作地线性连接在大肠菌素多肽的羧基端构成，所述大肠菌素选自大肠菌素El, la, lb, A, B或N。所述抗蓝藻重组抗体多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。编码上述抗蓝藻重组抗体多肽的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。含有编码上述抗蓝藻重组抗体多肽的基因的重组表达载体。上述抗蓝藻重组多肽的制备方法，其步骤如下将编码抗蓝藻重组抗体多肽的基因导入到大肠杆菌表达系统中，培养转化的大肠杆菌，然后分离大肠杆菌表达的多肽。上述抗蓝藻重组抗体多肽在治理水体过度营养化中的应用。
本发明提供一种抗蓝藻重组抗体多肽，由大肠菌素多肽和抗蓝藻细胞表面抗原的抗体模拟物多肽组合而成。在该多肽分子中，抗蓝藻细胞表面抗原的抗体模拟物用于识别并结合蓝藻使分子中的大肠菌素攻击蓝藻。由于抗体模拟物为识别蓝藻表面抗原的抗体模拟物，因此本发明的多肽具有专门攻击蓝藻细胞而不损害其它水体生物，因而不会污染水源，用于水体蓝藻污染的治理非常环保和安全。本发明的抗蓝藻重组抗体多肽的基于CGMCCNo. 4783杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的抗原结合片段(Fab)的轻链和重链的氨基酸序列及核苷酸序列设计出的具有蓝藻识别结合能力的抗体模拟物，如单链抗体、抗体小分子模拟物等本领域已经熟知的抗体模拟物。在本发明中，设计的抗体模拟物只需要具有抗原识别能力即可实现发明目的，因为抗体模拟物的任务只是引导重组多肽分子到达目标生物细胞表面，然后由重组多肽中的大肠菌素在目标细胞膜上制造离子通道从而是目标细胞内溶物泄露而死。因此，基于上述单克隆抗体设计的抗体模拟物，只要能起到识别目标抗原的目的，这些抗体模拟物与大肠菌素连接而成的重组多肽都属于本发明保护的范围。在本发明的优选实施方式中，抗体模拟物为抗蓝藻原生质体表面抗原的单克隆抗体(由CGMCC No. 4783的杂交瘤细胞分泌)的几个结构域VfDRl、VHFR2和Vl⑶R3按 VHCDRl-VHFR2-VfDR3结构连接而成的28肽抗体模拟物。室内外实验证明，该抗体模拟物构成的抗蓝藻多肽可以在水介质中自由游动，具有自动寻找蓝藻细胞表面抗原的生物学活性。28肽抗体模拟物构成具有易于克隆和表达且具有与原始抗体相同的识别活性的优点，可以引导重组多肽中的大肠菌素到达蓝藻细胞膜上形成离子通道来杀伤这些蓝藻细胞，该重组多肽具有现用治理水污染药物(如硫酸铜等)所无法比拟的、具有生态-环境安全性。本发明中，构建重组抗蓝藻多肽的大肠菌素可选自能形成离子通道的大肠菌素El, la, lb, A，B或N，在本发明的实施例验证了大肠菌素Ia与抗蓝藻抗体模拟物构建的重组多肽，但但发明利用的是这些大肠菌素在细菌胞膜上形成离子通道来杀死细菌的这一共性，因此，按照本发明的构思，这些大肠菌素与抗蓝藻的抗体模拟物多肽线性连接构成的重组多肽都能够实现本发明的目的-即提供能够杀死蓝藻的重组多肽。本发明还提供了包含重组多肽的基因的重组质粒的制备方法，是将编码抗体模拟物的核苷酸序列经双链寡聚核苷酸点突变技术插入大肠菌素的羧基端形成本发明的重组质粒。以选用大肠菌素Ia为例，将编码抗体模拟物的核苷酸序列插入Ia基因的第626位氨基酸后(羧基端)而形成本发明的重组质粒。构建重组质粒的原始商用质粒pSELECT-1来自于Promega公司，其中装载了大肠菌素Ia和相应的Immunity蛋白基因，针对抗体模拟物基因设计了数对引物，其序列见实施例I。利用双链寡聚核苷酸点突变技术，按照Strategene公司试剂盒操作获得重组质粒,例如pCHCcyanoMAl。本发明的又一方面，提供本发明所述抗蓝藻多肽的制备方法，将编码抗体模拟物的基因可操作地与大肠菌素基因连接获得编码重组抗蓝藻多肽基因的重组质粒，将获得的重组质粒转染入大肠杆菌工程菌中而获得可产生重组抗蓝藻多肽的工程菌细胞。用离子交换柱分离纯化即获得本发明所述的抗蓝藻多肽。本发明所述抗蓝藻多肽可用于治理水污染。可以通过将本发明中的多肽添加可接受的载体或赋形剂或可选的其它成分而制成适于环境使用的药物组合物。其机理是多肽中可与蓝藻细胞表面抗原识别的抗体模拟物诱导大肠菌素到达蓝藻细胞膜附近，然后大肠菌素离子通道结构域的疏水区段插入蓝藻细胞膜中，进而大肠菌素离子通道结构域在蓝藻细胞膜上形成离子通道，使蓝藻细胞内容物泄漏而致蓝藻细胞死亡，从而达到杀死蓝藻细胞的目的。本发明所述的抗蓝藻多肽相较于传统抗蓝藻药物的优点在于，其具有特异的靶向性，因而在治理过程中不会攻击其他藻类、植物和动物细胞，其毒性和不良反应远低于传统抗蓝藻药物。再由于它是 在蓝藻细胞膜上直接形成离子通道来杀伤蓝藻细胞，因此在抗蓝藻多肽-离子通道造成泄漏而致蓝藻细胞死亡的这一较短时限内，蓝藻细胞较难利用突变基因-蛋白表达方式来修复抗蓝藻多肽-离子通道在蓝藻细胞膜上造成的几何缺损，所以蓝藻细胞对本发明的抗蓝藻多肽产生耐药性的概率较低。这预示本发明所述抗蓝藻多肽具有良好的应用前景。杂交瘤保藏信息保藏号CGMCCNo. 4783杂交瘤名称抗蓝藻细胞表面抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞保藏日期2011年4月20日保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号。


图I.是含有抗体模拟物和大肠菌素Ia基因的重组质粒pCHCcyanoMAl的结构示意图。图2.为抗蓝藻多肽结构示意图。图3.是含有部分基因颠倒N-C顺序的抗体模拟物基因和大肠菌素Ia基因的重组质粒pCHCcyanoMA2的结构示意图。图4.为本发明抗蓝藻多肽对生长于液体培养基中铜绿微囊藻的抑制试验结果。图中A，空白对照液，B，氨苄青霉素50ii g/ml，C，广谱信息菌素(Ph-NM) 50 y g/ml，D，抗蓝藻多肽(l)50iig/ml，E，抗蓝藻多肽(2)50iig/ml。图5.为本发明抗蓝藻多肽(I)对生长于液体培养基中铜绿微囊藻的抑制试验结果。图中A，处理48小时后，B，处理72小时后，C，处理96小时后。图中每一列从左至右共6个烧瓶，依次为1，对照，2，0. Iii g/ml抗蓝藻多肽(1)，3，0. 5iig/ml抗蓝藻多肽(1)，4,1 u g/ml抗蓝藻多肽(I), 5, 5 ii g/ml抗蓝藻多肽(I), 6,10 y g/ml抗蓝藻多肽⑴。图6.为本发明抗蓝藻多肽⑴对生长于液体培养基中栅藻的抑制试验结果。处理10日后，图中每一列从左至右共6个烧瓶，依次为1，对照，2，Iii g/ml抗蓝藻多肽(I), 3, 5 ii g/ml抗蓝藻多肽⑴，4,10 ii g/ml抗蓝藻多肽(I), 5,15 y g/ml抗蓝藻多肽
(I),6, 20 u g/ml抗蓝藻多肽⑴。图7.为本发明抗蓝藻多肽⑴对生长于液体培养基中铜绿微囊藻、栅藻的抑制试验结果。上图为铜绿微囊藻的结果，下图为栅藻的试验结果。图8.为本发明抗蓝藻多肽对生长于液体培养基中铜绿微囊藻、鱼腥藻、小球藻、栅藻的抑制试验结果。图中左侧烧瓶为对照，右侧烧瓶为35 U g/ml抗蓝藻多肽(I)。A，铜绿微囊藻，B，鱼腥藻，C，小球藻，D，栅藻。图9.为本发明抗蓝藻多肽对蓝藻污染的自然水体抑制试验结果。图中A,空白对照,B,抗蓝藻多肽(I) I V- g/ml, C,抗蓝藻多肽(I) 5 U g/ml, D,抗蓝藻多肽(I) 10 u g/ml, E,硫酸铜 0. 7 u g/mlo图10.为图9抑制试验的部分测试结果。A，水体中光密度变化，B，水体中叶绿素a变化，C，水体中pH变化，D，水体中优势
藻类种群变化。D-1,对照组,D-2,1 ii g/ml抗蓝藻多肽⑴处理组,D_3,0. 7 ii g/ml硫酸铜处理组。图11.为图9中抗蓝藻多肽对蓝藻污染的自然水体抑制试验的显微镜观察结果 (放大400倍)。分别为对照、抗蓝藻多肽(I) I U g/ml和硫酸铜0. 7 U g/ml处理水体中藻类(鱼腥藻)在A，第一日，B，第二日，C，第三日，D，第四日，E，第五日的变化。
具体实施例方式实施例I表达抗蓝藻多肽的质粒的构建和重组抗蓝藻多肽的制备材料杂交瘤细胞CGMCC No. 4783。步骤I.抗体模拟物的核苷酸序列及氨基酸序列的获得收集杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，采用常规方法对单克隆抗体进行测序获得抗原结合片段Fab重链和轻链序列后，根据抗原互补决定区的氨基酸序列设计得到抗体模拟物氨基酸序列，如SEQ ID NO. 3所示，编码该抗体模拟物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。步骤2.原始质粒为装载了大肠菌素Ia和Immunity蛋白基因的pSELECT_l质粒(购自Promega公司，上述基因由本实验室装载)，经双链寡聚核苷酸点突变技术(QuickChange Kit, Strategene公司)将编码抗蓝藻的抗体模拟物的基因(序列表中SEQ ID N0.2所述核苷酸序列)插入到大肠菌素Ia基因的1626位点后，得到重组质粒pCHCcyanoMAl (如图I所示)，重组质粒转染入E. coli B834(DE3)工程菌里表达制备多肽，获得序列表如SEQ ID NO. 7所述的抗蓝藻多肽，在后续的实施例中称为“抗蓝藻多肽(I) ”，其分子量约70，000。突变程序按Strategene QuickChange Site-Directed MutagenesisKit(catalog#200518)药箱手册进行I、准备点突变反应物5ul IOx buffer2ul (IOng)野生型大肠菌素Ia质粒Iul (125ng)设计的5’ -3’寡聚核苷酸引物Iul (125ng)设计的3’ -5’寡聚核苷酸引物Iul dNTP双蒸水50ulIul pfu(除质粒，引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)2、进行PCR扩增，扩增条件变性95°C，35秒，退火53°C，70秒，延伸68°C，17分共20个循环；3、加入Dpnl内切酶Iul消化母体DNA链后(37°C，I小时)，取Iul反应物与HMS174感受态细胞50ul冰孵30分钟，行热冲击42V，45秒，再置入冰中2分钟；4、加入NZY培基0. 5ml后220rpm，37°C摇菌I小时后，取50_100ul反应物铺板(LB培基加1%琼脂加50ug/ml氨苄青霉素，37 °C过夜)；5、18小时后挑菌,循Qiagene,Gibco等公司的各种商用提取质粒药箱提取质粒均可，测序确定突变成功；6、将质粒50ng与制备的E. coli B834(DE3)工程菌感受态细胞50ul冰孵30分，42°C，30秒热冲击，取50-100ul反应物加入SOC培基0. 5ml，220rpm，37°C摇菌I小时后铺板(LB培基加1%琼脂加50ug/ml氨苄青霉素)37°C孵育，12-16小时后挑取菌落； 7、大量增菌，8-16升LB培基，250rpm，37°C，6-8小时；离心沉淀菌体，4°C，6000g,20 分钟，取 4°C，50mM Borate, 2mM EDTA, pH 9. 0) 50_80ml 悬浮菌体，加入 0. 2M PMSF 250微升后行超声破碎(4°C，400W, 2分钟)，高速离心沉淀破碎菌体(4°C，75000g, I. 5小时)，取上清经硫酸链霉素沉淀DNA，装入分子量15，000的透析袋于4°C，50mMBorate, 2mM EDTA,pH 9. 0缓冲液10升透析过夜后，将上清上样于CM柱(Amersham Biosciences),经50mMBorate,0. 3M NaCl,2mM EDTA, pH 9. 0缓冲液，4°C )洗脱后即可得到重组抗蓝藻多肽(I)(请见图2)。下面列出为制备pCHCcyanoMAl质粒的抗体模拟物基因所设计的具体双链寡聚核苷酸序列pCHCcyanoMAl1、5， -3，gcg aat aag ttc tgg ggt att TCT TAT TGG ATG CAG TGG GTT AAG CAAtaa ataaaa tataag aca ggc3， -5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta TTG CTT AAC CCA CTG CAT CCA ATA AGA aat acccca gaa cttatt cgc2、5， -3’tat tgg atg cag tgg gtt aag caa AGA CCG GGG CAA GGG CTG GAG TGG ATT GGCtaa ata aaa tataag acaggc3， -5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta GCC MT CCA CTC CAG CCC TTG CCC CGG TCT ttgctt aaccca ctg cat cca ata3、5， -3’ggg caa ggg ctg gag tgg att ggc CAG CAG TAT YGG TCT ACG CCC CCG TGG ACGtaa ata aaa tataag acaggc3， -5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta CGT CCA CGG GGG CGT AGA CCA ATA CTG CTG gccaat ccactc cag ccc ttg ccc实施例2表达抗蓝藻多肽的对照质粒的构建和对照重组抗蓝藻多肽的制备
原始质粒为装载了大肠菌素Ia和Immunity蛋白基因的pSELECT_l质粒(购自Promega公司，上述基因由本实验室装载)，经双链寡聚核苷酸点突变技术(QuickChange Kit, Strategene公司)将编码抗蓝藻的抗体模拟物的基因(序列表中SEQ ID N0.4所述核苷酸序列)插入到大肠菌素Ia基因的1626位点后，得到重组质粒pCHCcyanoMA2(如图3所示)，重组质粒转染入E. coli B834(DE3)工程菌里表达制备多肽，获得序列表如SEQ ID NO. 9所述的抗蓝藻多肽，在后续的实施例中称为“抗蓝藻多肽(2)”，其分子量约70，000。制备PCHCcyanoMA2质粒的模拟物基因的双链寡聚核苷酸序列按实施例I的方法设计。其制备方法同实施例2。实施例3抗蓝藻多肽对铜绿微囊藻的抑制试验结果试验(I)
步骤I.准备试验藻蓝藻为购自中国科学院水生生物研究所的FACHB-978铜绿微囊藻(Microcustis aeruginosa)。试验藻的培养方法将藻种接种到装有250ml BGll培养基的500ml容积锥形瓶中，置于光照培养箱中。接种初始藻细胞密度为5 X IO4个/mL，锥形瓶用透气膜封盖，以防污染。培养温度为25°C，光照强度为(2500±10% )Lux ;光暗比为12h/12h。为减少因光照不均匀可能造成的影响，每隔2 3h摇动并更换各实验组锥型瓶的位置I次。自接种的第5天起，每隔24h取样、测定I次。待藻细胞数密度达到IO6个/mL数量级左右时，即可开始下一步试验。步骤2.在五个试管A、B、C、D、E中分别加入制备好的蓝藻液lml，然后加入抑制剂A空白对照液，B氨苄青霉素50 u g/ml，C广谱信息菌素(申请号为200910092128. 4中公开的Ph-AMl) 50 V- g/ml, D抗蓝藻多肽(I) 50 u g/ml, E抗蓝藻多肽(2) 50 u g/ml后,五个试管置于孵箱中低速振荡培养12小时后，都加入吖啶橙(按50nM加入)和碘化丙啶(按600nM加入)孵化30分钟，吸取数微升置于载玻片上，荧光显微镜(Nikon90i，DM505和DM565滤光镜片)观察活蓝藻染色情况。结果如图4所示。结果显示只有抗蓝藻多肽(I)杀伤了培养的铜绿微囊藻。而抗蓝藻多肽(2)、氨苄青霉素、Ph-NM对所培养的铜绿微囊藻均无作用。试验(2)步骤I同试验(I)步骤I。步骤2.直接在6个接种了试验藻的500ml的锥形瓶中按浓度梯度加入抗蓝藻多肽。铜绿微囊藻加入抗蓝藻多肽的剂量为0、0. l、0.5、l、5、10ug/ml，每日观察对蓝藻的生长抑制情况。结果如图5所示。由于各处理组所用的抗蓝藻多肽(I)浓度不一样，锥形瓶中铜绿微囊藻液由绿色变成浅黄色之时间快慢与多肽的浓度成正比，然在72小时内，肉眼可观察到各处理组均可有效杀灭所试之铜绿微囊藻。上述结果证明，抗蓝藻多肽⑴具有靶向杀伤蓝藻的效力，而抗蓝藻多肽2几乎无效。试验(3)材料购自中科院水生生物研究所的FACHB-417斜生栅藻(Scenedesmusobliqnus)采用试验(I)中步骤I的方法培养试验藻。步骤2.直接在6个接种了试验藻的500ml的锥形瓶中按浓度梯度加入抗蓝藻多肽(I)，剂量分别为:0、l、5、10、15、20ug/ml。每日观察对栅藻的生长抑制情况。结果如图6所示。虽然加入的抗蓝藻多肽(I)剂量相对铜绿微囊藻处理组大了 10倍，肉眼在试验期间(190小时)未观察到抗蓝藻多肽⑴表现出任何对所试栅藻的杀伤作用。结果如图6所示。虽然加入的抗蓝藻多肽(I)剂量相对铜绿微囊藻处理组大了 10倍，肉眼在试验期间(190小时)未观察到抗蓝藻多肽⑴表现出任何对所试栅藻的杀伤作
用。 试验(4)以上试验(I) (3)每瓶取0. ImL培养液，置于血球计数板中，在显微镜下观察、计数。图7所示的藻细胞计数显示与对照相比较，I U g/ml抗蓝藻多肽(I)在72小时内即可杀灭所试之铜绿微囊藻。而I U g/ml抗蓝藻多肽(I)对所试之栅藻几乎无任何作用。实施例4.抗蓝藻多肽对抗铜绿微囊藻、鱼腥藻、小球藻、栅藻的液体培养基试验所试藻类为购自中科院水生所的铜绿微囊藻、鱼腥藻、小球藻和栅藻。藻类培养和加入处理剂之方法同实施例3的试验(I)的步骤I。取藻细胞数密度达到IO6个/mL数量级的培养藻液40ml分装于300ml锥形瓶中，各加入A :加入等量的空白对照液，B :加入抗蓝藻多肽(I) 35 y g/ml，继续培养4日，观察其生长情况。结果如图8所示。24小时后，铜绿微囊藻和鱼腥藻藻液颜色开始变浅，至第4日藻液已变清亮。而小球藻和栅藻藻液颜色和浊度均无变化。该结果显示抗蓝藻多肽I抑制了所试铜绿微囊藻、鱼腥藻的生长，却不能抑制小球藻、栅藻的生长。上述结果证明，抗蓝藻多肽(I)具有靶向杀伤蓝藻的效力。实施例5抗蓝藻多肽对自然水体中蓝藻的杀灭试验自然水体采自被蓝藻严重污染的苏州阳澄湖沼虾养殖池，25-35升分装于60x40x30厘米塑料养殖盆中，每隔20分钟气泵送气10分钟；加热器自动调温至27°C，光照强度为(2500 ± 10 %) Iux ;光暗比为12h/12h，每日采样检测养殖水体pH、650nm光吸收值、叶绿素a吸收值(请见图9)。将采样液置于可见分光光度计中测定650nm光吸收值(请见图10)。利用热乙醇-反复冻融-分光光度法测定叶绿素a含量(请见图10)。用分光光度计于665、700nm下测其吸光度，计算叶绿素a的浓度。其公式为[Chla] = [12. 12(D66
4-D750)-l. 58(D647-D750)-0. 08(D630-D750)]VE/VS d。对照组水体中的pH、650nm光吸收值、叶绿素a吸收值在试验期间一直居高不下，而抗蓝藻多肽(I)组和硫酸铜组水体的pH、650nm光吸收值、叶绿素a吸收值自第二日起即显著下降。每日采样30ml水样用福尔马林固定后，离心浓缩10倍，取0. ImL置于血球计数板中，在显微镜下观察、计数(请见图11)。镜检中可见在第一日，对照组、抗蓝藻多肽(I)组和硫酸铜组水体中可见大量生长茂盛的鱼腥藻；而自第二日起，抗蓝藻多肽(I)组和硫酸铜组水体中的鱼腥藻大量减少、碎裂；至第五日抗蓝藻多肽(I)组和硫酸铜组水体中已找不到鱼腥藻，而对照组水体中仍见大量鱼腥藻生长。显微镜检观察藻类形态变化，同时对各种藻类计数以确定养殖水体中浮游植物优势种群的动态变化(请见图10)。在对照组水体中，鱼腥藻和铜绿微囊藻始终为优势藻种；在抗蓝藻多肽(I)组水体中，鱼腥藻和铜绿微囊藻逐渐减少，小球藻变成为优势藻种；在硫酸铜组水体中，鱼腥藻和铜绿微囊藻逐渐减少，而另一种蓝藻，颤藻变成为优势藻种。表I抗蓝藻多肽处理之浮游植物细胞计数及形态变化(个/升)
权利要求
1.杂交瘤细胞，其保藏号为=CGMCCNo. 4783。
2.权利要求I所述的杂交瘤分泌的单克隆抗体。
3.具有蓝藻识别结合能力的模拟抗体多肽，是权利要求2所述的单克隆抗体的抗原结合片段，或根据所述抗原结合片段上的功能区域设计然后人工表达分离而得的小分子多肽。
4.根据权利要求3所述的模拟抗体多肽，其氨基酸序列如SEQID NO. 3所示。
5.编码权利要求3或4的模拟抗体多肽的基因。
6.根据权利要求5所述的基因，核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
7.抗蓝藻重组抗体多肽，由权利要求3或4所述的具有蓝藻识别结合能力的模拟抗体 多肽可操作地线性连接在大肠菌素多肽的羧基端构成，所述大肠菌素选自大肠菌素El，Ia，Ib，A，B 或 N。
8.根据权利要求7所述的抗蓝藻重组抗体多肽，其氨基酸序列如SEQID NO. 7所示。
9.编码抗蓝藻重组抗体多肽的基因。
10.根据权利要求9所述的编码抗蓝藻重组抗体多肽的基因，核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示。
11.含有编码抗蓝藻重组抗体多肽的基因的重组表达载体。
12.权利要求7或8所述的抗蓝藻重组多肽的制备方法，其步骤如下将编码抗蓝藻重组抗体多肽的基因导入到大肠杆菌表达系统中，培养转化的大肠杆菌，然后分离大肠杆菌表达的多肽。
13.权利要求7或8所述的抗蓝藻重组抗体多肽在治理水体过度营养化中的应用。
全文摘要
本发明“抗蓝藻重组抗体多肽及其基因与制备方法”，属于环保生物技术。抗蓝藻重组抗体多肽，由抗蓝藻的抗体模拟物多肽可操作地线性连接在大肠菌素多肽的羧基端构成，所述抗蓝藻的抗体模拟物多肽是基于CGMCC No.4783杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体的抗原结合片段设计的具有蓝藻识别结合能力的多肽。本发明的新型抗蓝藻多肽相较于现用治理水污染药物的优点在于，其直接在蓝藻细胞膜上形成离子通道来杀伤蓝藻，因此杀伤效率强于现用治理水污染药物数十倍；由于该多肽对蓝藻(原核细胞)是靶向性杀伤，不会杀伤其他有益的真核细胞藻类；该多肽本身又可被蛋白酶、胃酸等降解；因此它具有现用治理水污染药物(如硫酸铜等)无法比拟的生态和环境安全性。
文档编号C12R1/91GK102747041SQ20111015522
公开日2012年10月24日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年4月21日
发明者丘小庆 申请人:畿晋庆三联(北京)生物技术有限公司