专利名称：前列腺癌特异性基因-病毒药物的制作方法
技术领域：
本发明属于癌症的革巴向基因-病毒治疗(Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy,CTGVT)领域，具体涉及前列腺癌特异性的靶向基因-病毒治疗(Cancer TargetingGene-Viro-Therapy Specific for Prostate Cancer,CTGVT-PC),更具体的，是关于一种前列腺癌特异性基因-病毒药物。
背景技术：
1999-2001年，刘新垣创建了一种癌症治疗策略，叫癌症的靶向基因-病毒治疗(Cancer Targeting Gene-Viro-Thearpy, CTGVT),它是将抗癌基因插入到溶瘤病毒(oncolytic virus, 0V)而成，故 CTGVT 策略即 OV-(gene)策略或 Gene Armed OncolyticVirus Therapy (GAOVT)策略，后者也是OV-(gene)，CTGVT (GAOVT)把基因治疗和溶瘤病毒治疗各自的优势结合起来了，因为溶瘤病毒本身就有抗癌作用，又可能特异性地在癌细胞 中复制数百倍，插入其中的抗癌基因也可随之复制数百倍，故其抗癌效果大大地增加，既比相应单独基因治疗好很多，也比相应单独溶瘤病毒治疗好很多，故现在成为国际热点课题。基因治疗，虽然2009年被Science评为全球十大科学成果之一，但那都是对单基因缺乏的遗传病所获得的成果，对癌症这样复杂又是多基因突变的疾病，基因治疗的抗癌效果，远不如CTGVT(GAOVT)的抗癌效果，基因治疗为Ad-(gene)，其中所用的载体Ad无癌症靶向性，在癌细胞中无复制能力(即非复制型Ad)，故其抗癌效果，远远不如CTGVT。如图I所示，腺病毒有早期基因有El、E2、E3、E4及晚期基因LI、L2、L3、L4、L5。其中El又可分为E1A、E1B，最重要的是E1A，其次是E1B。ElA的天然启动子被前列腺癌特异性的启动子替换，则此腺病毒只能在前列腺癌细胞中感染复制。溶瘤病毒(Oncolytic Virus，0V)，是指在肿瘤中特异表达和感染复制的病毒，有癌细胞靶向性，还能复制，但非前列腺癌特异性。任何病毒(Adenovirus (腺病毒)，SimplexHerpes Virus(HSV-I)(疱疹病毒)，Pox Virus (痘苗病毒))经改造后均可构成为0V。溶瘤病毒携带gene则变成0V-gene,但Ad-gene即基因治疗(其中Ad无祀向性,无复制倍增能力)。
发明内容
在CTGVTJP ov-(gene)的构建与应用中，OV(Oncolytic Virus)主要决定其靶向性，可用各式各样的方法加以构建，使它产生不同靶向性，本申请只涉及特异性靶向前列腺癌领域，目的是提供一种前列腺癌特异性基因-病毒药物，CTGVT-PC及其应用。Gene主要决定杀伤性，光OV的杀伤作用有限，故需加杀伤基因以增强其抗癌作用，构成OV-(gene)，即CTGVT (GAOVT)，才能构成很强的抗癌药物，对CTGVT还需要更多改进，如将两个CTGVT合用，其抗癌作用更强，常可把移植性肿瘤基因基本上消灭光。此外，如专门靶向癌症干细胞，则有根除癌症和彻底消灭癌症的可能性。本发明具体采用如下技术方案
本发明是用前列腺癌特异性启动子DD3替换ElA本身的天然启动子，则此腺病毒变成了对前列腺癌特异性溶瘤腺病毒，可简写为(PC) ^OncoAd,即一种靶向前列腺癌的OV载体，这是本专利的根本要求，此外，在ElB中可缺失55KD，则为Ε1Β(Λ55)，Δ为缺失之意，称ZD55，也可写成D55 ;Ε1Β有两个基因，即19KD与55KD基因，如这两个基因双缺失则为ΛΕ1Β。Ad· ElB的天然启动子也可用HIF (低氧诱导因子)取代，构成Ad .HIF ·Ε1Β，总的要求是构成Ad · DD3 · ElA · μ ElB ( ^ ElB,表示可对ElB进行的任意改造)。至于基因方面，对前列腺癌来说，或者加入前列腺癌特异性抑癌基因，如ΡΤΕΝ，构成Ad · DD3 · ElA · D55-(PTEN)，如抗癌能力还不够强，还可在同样载体上加用抗癌作用很强但无专一性的抗癌基因如TRAIL，构成Ad · DD3 · ElA · D55-(TRAIL)与上述带PTEN的CTGVT-PC合用，则可取得更好的抗癌效果。除TRAIL外，也可用IL_24、MnSOD、Smac、GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase 3、Bax等等，使用两个基因时，其中必有一个为前列腺特异性的抗癌基因，两个基因可用如下方法构建:A.使用两个重组子，分别各带一个抗癌基因；B. —个重组子中分别用两个基因表达框表达；C.两个基因用连接子连接起来。·如用F · 2A或IETD四个氨基酸。在本发明的第一个方面，提供一种前列腺癌特异性靶向的基因-病毒药物，将抗癌基因插入到溶瘤病毒而制成，所述溶瘤病毒为溶瘤腺病毒，早期基因El分为E1A、ElB,ElA的启动子被前列腺癌特异性启动子取代。根据本发明，所述前列腺癌特异性启动子为前列腺癌特异性启动子DD3及其它前列腺特异的启动子。根据本发明，首先是前列腺癌特异的抗癌基因，如PTEN，也可增加其它抗癌效果很好的抗癌基因，如 TRAIL、IL-24、MnS0D、CD、Smac、GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase 3、或 Bax0如果是两个抗癌基因，相互之间可用不同方式联合使用，所述方式为A、用两个重组子；B、在一个重组子中带有两个基因的表达框；或C、两个基因用联接子连接起来加到一个载体中，连接子可为F · 2A或IETD四个氨基酸。根据本发明，所述ElB可进行如下改造(I)、所述ElB的天然启动子被HIF取代；(2)、删除 ElB 中的 55KD ;(3)、删除ElB中的两个基因19KD和55KD。本发明为前列腺癌特异性基因-病毒治疗的药物，具有很高靶向抗前列腺癌的治疗作用，对正常细胞基本无影响。
图I为腺病毒基因组图。图2A显示了 DD3启动子在各种正常细胞与各种癌细胞中的启动能力，图2B显示了 WPRE对Luciferase基因及DD3启动能力的增强作用。图3A 显示了 CTGVT-PC，Ad · DD3 · D55-(PTEN)的构建原理，图 3B 显示了Ad · DD3 · D55-(PTEN)的具体构建过程。图4 显示了 Ad · DD3 · ElA · D55-(PTEN)简称 Ad · DD3 · D55-(PTEN)的体外(invitro)抗癌能力。图5显示了 Ad *DD3 *D55-(PTEN)的体内(in vivo)抗癌能力，其中图5A显示了各种物质的抗癌作用，图5B显示了癌组织中PTEN的含量。
具体实施方案CTGVT-PC是前列腺癌特异性的溶瘤腺病毒(PC)-OncoAd携带前列腺癌特异性的抗癌基因(PC)-gene,即(PC) · OncoAd-(PC)-gene。(PC) · OncoAd的构建，是将Ad · ElA的天然启动子换成前列腺癌特异性启动子DD3 (differential display code 3),即 Ad · DD3 · ElA,至于 Ad 的 ElB,任何改造均可(即 ⑵ElB)，⑵ElB需靶向癌症细胞，但无特异性，Ad · ElA · ElB ( Λ 55)，简称ZD55或D55即如此。Ad*DD3 ·Ε1Α· 55所携带的基因为前列腺癌特异性抗癌基因(如ΡΤΕΝ)等，其总的结果为Ad · DD3 · ElA · D55-(PTEN)等，括号中的基因代表此gene的表达框。如抗癌还不理想，可选用抗癌作用较强的普通抗癌基因，如TRAIL，则构成Ad · DD3 · ElA · D55-(TRAIL),与上述带PTEN的CTGVT-PC共用，这种合用也叫CTGVT-PC。此外，除TRAIL外，还可用其他基因，如MnS0D、IL-24等。此外，两基因也可用联接子(Linker)连成(TRAIL-Linker-PTEN)作为一个基因加入(PC) · OncoAd 中，则成为 Ad · DD3 · ElA …ElB (TRAIL-Linker-PTEN)。以下结合具体实施例，对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、CTGVT-PC的构建实施例实施例I :DD3在各种正常细胞与癌细胞中的启动能力DD3 (differential display code, 3)定位于第 9 号染色体上(9q21_22),全长约25kb，包含4个外显子和3个内含子。DD3特异性地高表达于人类前列腺癌细胞和转移坏死灶中，在正常前列腺、良性前列腺增生细胞中不表达或低表达。DD3启动子为215bp，它也只能在前列腺癌细胞才能发挥启动下游基因(此处为ElA)的表达。本实施例以含有荧光酶(Luciferase)的pGL_3质粒为对象，考察了 DD3启动子在各种正常细胞中以及前列腺癌细胞中的启动能力，具体如下将DD3克隆至pGL-3质粒的荧光酶前面，构成pGL_3 · DD3_Luc if erase (简称pGL-3 · DD3)，同时以不加DD3的pGL_3质粒(pGL_3 · basic)为对照，根据表达荧光的强度来检测DD3的启动能力，结果如图2A所示。WPRE(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatoryelement)能够延长基因(如荧光酶)的表达时间，故能增强DD3的启动子能力，因此，我们还在荧光酶之后加了一个WPRE，以考察其对于荧光酶基因及DD3启动能力的增强作用，结果如图2B所示。实施例2 pAd · DD3 · D55_ (PTEN)的构建2. I、Ad5 (ffT):如图3A所示，Ad5 (ffT)为野牛型腺病毒5 (Wild Type)腺病毒(Adenovirus, Ad,现在所用Ad大都为5型，但5字不特别标出)，其中ElA正常，ElB正常；
2. 2、Ad · DD3 · D55 :即 Ad · DD3 · ElA · ElB ( Λ 55)。过去我们曾构建Ad · ElA · ElB ( Λ 55)，即ZD55，为一种溶瘤病毒，其中ElA无任何改变，ElB中55KD的基因被删去(deletion)，称为D55，Z为研究者的姓Zou。ZD55为本组的专利，专利号是ZL 021 57662. 9及2005 I 0026151. 5，其构建故不必重复，它有抗癌作用，但非特异性对前列腺癌。为构建在前列腺癌中特异的溶瘤病毒，必须对ElA进行改造，将ElA的天然启动子换成前列腺癌特异性的启动子(DD3)，因控制ElA最重要(ElB次之)，DD3在多数前列腺癌中都升高，故对前列腺癌有特异性启动子作用，可以作为临床前列腺癌的诊断指标，因此Ad · DD3 · D55 一定会专门靶向前列腺癌，而非正常细胞或别的癌细胞中(其中DD3蛋白很低或没有，故Ad · DD3 · ElA · D55在其中不起作用)。此夕卜，我们还在ElA 之后还加了一 个 WPRE(woodchuck hepatitis viruspost-transcriptional regulatory element),它能延长 ElA 的表达时间，故也增强 DD3 的启动子活动力(图3A)。 2. 3、Ad *DD3 * D55~(ΡΤΕΝ) PTEN 是 phosphatase and tennin homology deletedon chromosome 10，这是它名称的来由，在前列腺癌中缺失，此癌的晚期PTEN的缺乏更为严重，故对前列腺癌的治疗基因有重要的用途，因此Ad · DD3 · D55-(PTEN)是一个极好的CTGVT-PC。其构建很简单，利用(PTEN)两端都带有的Bgl II酶切位点，插入到D55的Bgl II的位点中即可，如图3B所示，具体构建过程如下a、用 PCR 使 DD3 变成 Xhol-DD3_Sal I，引物如下正向AGCTCTCGAGTTGTCAACATAGTGTGACGGGAAG;反向AGCTCTCGACTCCACACAAATCTCCCCTCGTT；将Xhol-DD3_Sal I 插入质粒 pAd · ElA · ElB ( Λ 55)中，Sal I 和 Xhol 粘性末端相同，固定插入方向，插入后酶切位点消失，得到PAd · DD3 · ElA · D55。b、在质粒 pAd · DD3 · ElA · D55 中用 PCR 法产生 Spe I，得到pAd · DD3 · ElA · D55 · (Spe I)引物Setl:正向GCTGTCAAACATGAGAATTCTTGAAGAC;反向ACAGGTTTACACACTAGTCTTATGGCCTGGG;引物Set2:正向CCCAGGCCATAAGACTAGTGTGTAAACCTGT；反向GCCAGAAAATCCAGCAGGTACCC；C、用 PCR 使 WPRE 变成 Spe Ι-ffPRE-Spe I，引物如下正向CTAGACTAGTCTAGCCCTCGACAATCAACCTCTG;反向CTAGACTAGTACTCTAGTCGAGCCCGTACCGA;将Spe I-WPRE-Spe I 插入到质粒 pAd · DD3 · ElA · D55 · (Spe I)中，得至IjpAd · DD3 · ElA · D55 · WPRE ；d、利用(PTEN)两端所带的Bgl II酶切位点，将其插入到D55的Bgl II的位点中，得到 pAd · DD3 · ElA · D55 · WPRE- (PTEN)；
e、将获得的 pAd *DD3 ·Ε1Α *D55 · WPRE- (ΡΤΕΝ)与 Ad 的框架大质粒 pBHGEB 重组，以表达 Ad · DD3 · ElA · D55 · WPRE- (PTEN)。 二、CTGVT-PC的应用实施例实施例3 Ad · DD3 · ElA · D55-(PTEN)的体外(in vitro)抗癌效果将癌细胞及正常细胞接种于24孔板(细胞数为5-10X IO3)，当细胞生长至接近饱和时(如80%饱和)(饱和指细胞长满了全孔)。对不同细胞包括正常细胞BEAS-2B，前列腺癌细胞CL1、22RV1、DU145及其它癌细胞Bcap_37(乳腺癌)、SGC-7901 (肝癌)、SW620 (肠癌)、BEL-7404 (肝癌)，分别用下列不 同剂量病毒(MOI)处理Ad · PTEN、Ad · DD3及 Ad · DD3 · D55-(PTEN)感染。七天后，用2%结晶紫(溶于20%甲醇)染色15分钟，显色后，观察不同细胞的病变情况，活细胞能染色，死细胞不能染色，全部死光了，没有颜色。结果如图4所示。由图4的结果可见，所有药物对正常细胞组BEAS-2B均无杀伤作用，对Bcap-37 (乳腺癌)、SGC-7901 (肝癌)、SW620 (肠癌)、BEL-7404 (肝癌)等的杀伤作用也均不很大(图下排)，而对不同前列腺癌均有不同程度的较强杀伤作用(图4上排)，且 Ad · DD3 · D55-(PTEN) > Ad · DD3 · D55 > Ad · PTEN。实施例4 Ad · DD3 · ElA · D55-(PTEN)的体内(in vivo)抗癌效果选用4周龄的雌裸鼠(nude mice)，购自上海实验动物中心，所有的实验操作符合美国国家卫生研究院关于实验动物保护和使用的指导原则，使用6 X IO3在150 μ I DMEM培养中，皮下接种于每个小鼠的背侧，等候肿瘤生长到80-150mm3，将小鼠随机分成4组，对照组(打生理盐水，PBS)及不同药物组为Ad-(PTEN)、Ad · DD3 · ElA · D55 (即Ad · DD3 · D55组)、Ad · DD3 · ElA · D55-(PTEN)(即 Ad · DD3 · D55-(PTEN)组)，每天肿瘤内注射治疗一次，每次O. 5X 108pfu连续4次，总共剂量各组均为2X 109pfu，然后每周用caliper尺测量肿瘤的长与宽，肿瘤的大小(volume，V)按下面公式计算，V = 1/2长X宽2。结果如图5所示，其中图5A为各种物质的抗癌作用，横坐标为时间，纵坐标为肿瘤体积的大小。瘤体积越小，抗癌作用越强，其抗癌强弱次序Ad · DD3 · D55-(PTEN)> Ad · DD3 · D55 > Ad-(PTEN) > > PBS ;图5B为癌组织中PTEN的含量，结果显示，使用Ad · DD3 · D55-(PTEN)者的 PTEN 含量>> 使用 Ad-(PTEN)者的 PTEN 含量。
权利要求
1.ー种前列腺癌特异性基因-病毒药物，即CTGVT-PC (Prostate Cancer)，其特征在于，所述药物是将前列腺癌特异的抗癌基因插入到前列腺癌特异性的溶瘤病毒中而制成。
2.如权利要求I所述的前列腺癌特异性靶向基因-病毒药物，其特征在于，所述前列腺癌特异性启动子可为前列腺癌特异性启动子DD3，或其它类似启动子。
3.如权利要求I所述的前列腺癌特异性靶向基因-病毒药物，其特征在于，所述抗癌基因为前列腺癌特异的PTEN。
4.如权利要求3所述的前列腺癌特异性靶向基因-病毒药物，如抗癌能力还不够强，可在同一载体中加上其它如下抗癌基因与之共用如 TRAIL、IL-24、MnSOD, CD、Smac, GM-CSF, IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase3、或 Baxo
5.如权利要求4所述的前列腺癌特异性基因-病毒药物，如用两个抗癌基因时，可用不同方式联合使用，其方式为 A、用两个重组子； B、在一个重组子中带有两个基因的表达框；或C、两个基因用联接子连接起来加到ー个载体中，连接子可为F*2A或IETD四个氨基酸。
6.如权利要求I所述的前列腺癌特异性基因-病毒药物，其特征在干，ElB也可作如下改造 (1)、所述ElB的天然启动子被HIF取代； (2)、删除ElB中的55KD； (3)、同时删除ElB中的两个基因19KD和55KD(AElB) o
全文摘要
本发明公开了一种前列腺癌特异性的靶向基因-病毒药物。使用腺病毒，其早期基因E1A的天然启动子被前列腺癌特异性启动子DD3取代，构成一种溶瘤腺病毒，后者携带前列腺癌特异的抗癌基因PTEN，如其抗癌作用还不够强，不足以基本全部消灭癌症，则可在同一载体上加上下述基因与之共用，如TRAIL、IL-24、MnSOD、CD、Smac、GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase 3及Bax，或采用将两个基因用各种方案连接起来使用。本发明为前列腺癌特异性基因-病毒治疗的药物，具有很高靶向抗前列腺癌的治疗作用，对正常细胞基本无影响。
文档编号C12N15/861GK102813939SQ20111015538
公开日2012年12月12日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年6月10日
发明者刘新垣, 丁苗, 范钧锴 申请人:中国科学院上海生命科学研究院