专利名称：提高水稻钾离子外排逆向转运的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的应用，具体是一种利用KEAl基因及其编码蛋白的提高水稻钾离子外排逆向转运的方法。
背景技术：
水稻是我国最主要的粮食作物之一，我国有60%以上人口以稻米为主食，是世界上最大的稻米生产国和消费国。我国水稻年播种面积3000万公顷，占世界的20% ；产量 1. 85亿吨，占世界的近1/3，单位面积产量6. 35吨/公顷。比全球平均产量3. 85吨/公顷高65%。水稻在我国谷物产量中始终保持在总量的40%左右，占据了近半壁江山。光合作用是作物产量的基础，叶绿体作为光合作用的场所，其发育调控机理的研究一直是植物生理和分子生物学研究的热点。土壤盐碱化是导致全球各类粮食作物减产的主要原因，盐胁迫会使光合作用效率降低，导致减产。水稻作为重要的粮食作物之一，对其离子运输以及耐盐机制的研究为在实际育种中培育出新耐盐品种，缓解粮食紧缺问题奠定基础。因此，研究选育新型水稻抗逆株系并对其调控机理进行深入研究，是进一步发掘水稻优质品种的必要前提和基础。钾是植物生长发育所必需的矿物质元素，农作物在缺乏钾元素的土壤里不能正常生长发育。提高农作物对钾元素的吸收利用效率是解决钾肥资源短缺问题的重要途径之一。对于钾离子转运蛋白的研究，有助于更清楚地理解离子转运的复杂调控网络，对于促进作物营养循环利用也具有重要的意义。适当高的K+/Na+比对于维持叶绿体正常的光合磷酸化是十分必要的，当钠离子大量进入细胞内时，就必须用有效的方法来降低胞质中钠离子， 维持胞质内离子平衡，保证叶绿体的正常生理功能。植物细胞可以通过增加钾离子的吸收， 进而提高胞质中的K+/Na+比，缓解盐胁迫的伤害。现有的转基因工程技术是建立在对植物正常发育过程分子调控机制充分研究和认识的基础上加以应用的，因此，深入研究水稻对于叶绿体钾离子转运机理及调控网络并加以应用是在生产上研发新型抗盐优质株系的基础。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种提高水稻钾离子外排逆向转运的方法，利用KEAl基因及其蛋白参与叶绿体钾离子外排逆向转运的特点，及其利用转基因技术控制水稻钾离子运输上的特性，通过突变或抑制该蛋白的表达产生新的水稻抗逆株系， 在农业生产上具有十分重要的应用。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种水稻钾离子外排逆向转运蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1中第1-3465位所示。本发明涉及一种具有钾离子外排逆向转运蛋白活性的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
本发明涉及上述转运蛋白的宿主细胞，该宿主细胞为真核细胞，具体来自水稻。本发明涉及一种在水稻中参与叶绿体钾离子外排逆向转运的基因KEA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1中第1-3465位所示。本发明涉及一种基于水稻的KEAl突变体的制种方法，通过利用6tlCo γ射线对粳稻 9522品系进行处理，对诱变的F2代中一中脉变白突变体三代回交，获得隐性单基因调控的稳定遗传的KEAl突变体。所述的利用6tlCo γ射线对粳稻9522品系进行处理具体操作步骤是指利用6°Co γ 射线为诱变源，以280Gy处理剂量，处理粳稻9522种子。所述的F2代是指经60Co γ射线诱变后的粳稻9522种子经浸种、催芽后播种，在 30日龄时，单本移栽入大田，在种子成熟后，每个突变体1代植株，即为Fl代，采收3株稻穗；然后对每个Fl代株系种子分别播种，并在30日龄时移栽入大田，每个株系单本移栽24 株；最后在移栽后，从营养生长一直到生殖生长的全过程中，每个星期在田间观察一次从中筛选出与野生型相比出现表型变化的2代株系，即为F2代，进行编号，记录下表型及分离比。本发明涉及上述制种方法得到的KEAl突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
本发明中涉及到的水稻突变体keal叶片中脉近轴面特异性变白，叶绿体数目减少，排列不规则；盐胁迫条件下，植株中K、Na元素含量明显低于野生型，K/Na比明显高于野生型。本发明keal突变材料是由长江中下游地区推广的常规粳稻9522经过、射线诱变而来，为隐性单基因的突变，在KEAl基因的第十一个外显子发生四个碱基的缺失 (2284 2287bp)，导致基因序列的变化，产生一个如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列，从而导致KEAl蛋白提前终止(802aa)，产生一个如SEQ ID NO. 7所示的氨基酸序列。本发明中涉及到基因KEA1，其启动子可以启动KEAl基因在植株的整个维管束组织中表达；KEAl基因在根、茎、叶、叶鞘、花中均有表达；该基因的敲除可以得到该基因突变的表型；该基因的互补及过表达均可以恢复突变体keal的表型。说明该基因功能确实是影响到水稻的叶片中脉变白，这种影响可能是通过调节叶绿体钾离子外排逆向转运来实现。本发明在发掘和利用钾离子外排逆向转运方面具有明显的作用，可以产生新的水稻杂交抗逆系，用来选育新抗逆品种，在农业生产上具有十分重要的应用。
图Ikeal突变体植株的形态学观察示意图。图2keal突变体和野生型9522离子浓度测定示意图。图3keal座位定位示意图。图4互补和过表达突变体得到野生型表型示意图。图5KEA1启动子的表达模式示意图。图6KEA1的亚细胞定位示意图。图7RNAi得到突变体表型示意图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 实施例1 :keal突变体植株的获得和形态学的观察该突变体是本实验室用6tlCo γ射线诱变粳稻9522种子，处理剂量为280Gy。对诱变的F2代中一叶片中脉近轴面特异性变白突变体三代回交，获得隐性单基因调控的稳定遗传的突变体keal。所有植物材料种植于上海市农业科学院试验基地。对keal突变体植株的形态学观察。如图1，野生型和突变型keal的表型对比显示野生型9522叶色正常(左)(A，B，C)，而keal突变型叶片中脉近轴面特异性变白(右) (A，B，C)；野生型叶片中脉近轴面叶绿体数目很多，排列规则(上)(D)，突变型keal叶片中脉近轴面叶绿体数目减少，排列不规则(下)(D)；野生型叶绿体中类囊体数目很多，排列规则(左)(E)，突变体中类囊体数目略有减少(右)(E)。实施例2 :keal突变体和野生型9522离子浓度测定(1)样品的处理。选取野生型和突变体营养生长旺盛时期(60d)的根、茎、叶、叶鞘和生殖生长时期的花(图2A)，以及正常生长和盐处理(分别用NaCl 300mM和KCl 300mM 处理3d)条件下28d小苗的地上部分和根(图2B)，先在5mM的CaCl2溶液快速洗2次纯水中快速洗两次，在双蒸水中快速洗一次，在超纯水中快速洗三次，然后用吸水纸把苗上的水分吸干，装入牛皮纸袋里，放到90°C烘箱，烘至恒重。(2)水稻钾、钠离子浓度的测定。材料烘好后，用电子天平称重，然后放到50ml 离心管里，加入0. IM的醋酸溶液，90°C水浴3h，水浴时颠倒混勻5-6次。将提取液倒入 2ml离心管，12，OOOrpm离心5 lOmin，取上清，用双蒸水稀释到合适的浓度，用Thermo Elemental Sokaar AA型原子吸收分光光度计测定K+、Na+含量。每个样品重复测定两次。 取两次的平均值，计算每毫克干重的K+、Na+含量(图2)。实施例3 =KEAl基因的定位和克隆(1)定位群体。将keal与籼稻品系广陆矮4号杂交，自交获得F2代，选择其中为叶片中脉近轴面特异性变白植株为定位群体。(2)水稻DNA提取。采用改进的CTAB法。简单步骤如下取叶片0. 1_0. 2克(约半片)放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2ml离心管，加入700ul 100°C 预热的1. 5xCTAB溶液于离心管中，小心混勻后放入56°C水浴，20分钟后取出离心管，加入等体积氯仿/异戊醇，猛烈混勻，离心(13000rpm) 10分钟，取上清于新管中，加入900ul无水乙醇混勻后_20°C放半小时以上。将析出的DNA离心，HOOOrpm(10分钟)。去掉上清，将沉淀用lml70%乙醇清洗一次，离心干燥，溶于200ul 1/10TE或水中，4°C冰箱保存。(3) InDel分子标记分析。本实验室设计了 132对多态性标记，SSR引物根据已发表的序列合成(http //www, gramene. org/microsat/ssr. html),其他 InDel 分子标记设计是根据比较粳稻日本晴和籼稻9311两品系的已公布的核苷酸序列，对差异的部分设计引物，验证2个亲本粳稻9522和籼稻广陆矮之间的多态性，PCR扩增程序为10ul体系中，Iul 模板，Iul lOpmol/ulPrimerl, Iul 10pmol/ul Primer2, Iul IOXBuffer (Mg2+), Iul 2mM dNTP，0. Iul Taq，3. 9ul水。通过6%的PAGE胶电泳，银染方法检测。
(4)群体分离分析(bulked segregant analysis)初定位方法。应用这些多态性标记进行PCR扩增分析，在250个定位群体中发现突变基因与4 号染色体上的MarkerRM5503和RM2578表现连锁，进一步扩大定位群体(700个)和设计另外的多态性标记定位发现该基因处于距离为122kb的CH413和CH415两个Marker之间；最终将定位群体再扩大2467个隐性单体时，发现该基因处于距离46kb的SNlO和SNll两个 Marker之间(图3A)。在这46kb范围内，有7个候选基因，其中包括3个预测叶绿体定位基因。通过对这3个候选基因测序分析表明，突变体在0s04g58620基因的编码区有一个4 碱基的缺失(图3B)，该基因编码一个钾离子外排逆向转运蛋白KEAl，该缺失突变导致该蛋白表达提前终止。用分子标记对定位群体中的叶片中脉近轴面特异性变白单株进行基因型分析，利用MapDraw V2. 1构建目标基因区域的分子标记的连锁图谱(图3)。所用标记的序列如表 1 表1 InDel分子标记及其核酸序列
权利要求
1.一种调节水稻钾离子外排逆向转运蛋白，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 中第1-3465位所示。
2.一种根据权利要求1所述的调节水稻钾离子外排逆向转运蛋白，其特征是，该宿主细胞为真核细胞，具体来自水稻。
3.一种具有钾离子外排逆向转运蛋白活性的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDN0. 2 所示。
4.一种根据权利要求1所述蛋白的突变方法，其特征在于，通过利用Y射线对粳稻 9522品系进行处理，种植后在F2代挑选叶脉变白的突变体，获得水稻钾离子外排逆向转运蛋白。
5.根据权利要求4所述的突变方法，其特征是，通过突变获得钾离子外排逆向转运的突变体。
6.一种基于水稻的keal突变体的制种方法，其特征在于，通过利用6tlCo γ射线对粳稻 9522品系进行处理，对诱变的F2代中一中脉变白突变体三代回交，获得隐性单基因调控的稳定遗传的keal突变体。
7.根据权利要求6所述突变体的制种方法，其特征是，所述的利用6tlCoγ射线对粳稻 9522品系进行处理是指利用6tlCo γ射线为诱变源，以280Gy处理剂量，处理粳稻9522种子。
8.一种根据权利要求1所述水稻钾离子外排逆向转运蛋白的应用，其特征在于，用于制备水稻抗逆株系。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征是，利用RNAi技术抑制水稻中KEAl基因的表达，从而控制水稻钾离子运输上的特性，通过抑制该蛋白的表达得以产生水稻抗逆株系。
10.一种根据权利要求8或9所述的应用水稻抗逆株系的农杆菌EHA105，其特征在于， 为根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens，其保藏号为CGMCC No. 4821，保藏日期为 2011年4月29日。
11.一种根据权利要求6所述水稻的keal突变体的应用，其特征在于，用于将突变体恢复到野生型表型。
12.—种消除权利要求11所述水稻的keal突变体的应用，其特征在于，通过将SEQ ID NO. 4所示的基因组序列片段通过BamHI和SalI插入到用于转化水稻的双元载体 PCAMBIA1301载体中；并将载体通过电击导入农杆菌EHA105，使用遗传转化手段转化突变体keal和野生型9522成熟胚愈伤得以实现。
13.一种根据权利要求11或12所述的应用得到的野生型农杆菌EHA105，其特征在于， 为根癌土壤杆菌4grobacterium tumefaci ens,其保藏号为CGMCC No. 4820，保藏日期为 2011年4月29日。
14.一种根据上述任一权利要求所述蛋白的应用，其特征在于，用于将KEAl蛋白定位在叶绿体上。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征是，所述的叶绿体来自烟草叶片。
16.根据权利要求14或15所述的应用，其特征是，通过引物扩增SEQID NO. 5作为蛋白叶绿体定位信号肽，将该片段通过Afllll/Ncol和BglII插入到改造过带有eGFP标签的双元载体PCAMBIA1301载体中构建得到pl301 SigKEAl eGFP载体，通过电击导入农杆菌GV3101，使用农杆菌注射瞬时转化手段转化烟草叶片得以实现。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征是，所述的引物序列为 Sig-IF 5' ccacatgtggATGGATTTGTCTAGGTTTACTGCC 3‘， Sig-3R 5' gaagatctCTCGGTATTATCGACTACTGAGCC 3‘。
18.一种根据权利要求14至17中任一所述的应用得到的农杆菌GV3101，其特征在于， 为根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens，其保藏号为CGMCC No. 4823，保藏日期为 2011年4月29日。
全文摘要
一种生物工程技术领域的提高水稻钾离子外排逆向转运的方法，通过突变控制水稻钾离子外排的KEA1基因及其编码蛋白获得水稻钾离子外排逆向转运蛋白的功能变异株，同时利用γ射线对粳稻9522品系进行处理，种植后在F2代挑选叶脉变白的突变体，获得水稻钾离子外排逆向转运蛋白的功能变异株。本发明利用其参与叶绿体钾离子外排逆向转运及其在利用转基因技术控制水稻钾离子运输上的特性，通过抑制该蛋白的表达产生新的水稻抗逆株系，在农业生产上具有十分重要的应用。
文档编号C12N15/29GK102250228SQ20111016117
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月15日 优先权日2011年6月15日
发明者张大兵, 时楠, 梁婉琪, 米华玲, 袁政 申请人:上海交通大学