专利名称：一种加压素v2受体稳定表达细胞系的建立及其在药物筛选中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域和医药技术领域，具体涉及一种加压素V2受体稳定表达细胞系及其在药物筛选中的应用。
背景技术：
充血性心力衰竭(congestive heart failure, CHF)是指心肌收缩力减弱而引起循环充血的疾病，表现为在心脏受到损害或超负荷工作的状态下，心脏不能有效地输出从体液循环回流的血液，导致心脏容量增加；同时肾脏功能发生障碍，水和纳的排泄减弱，导致水肿和低钠血症，为CHF病人病情恶化的原因之一，严重影响病人的预后，使病人的死亡率增加60%。目前临床上对CHF还没有很好的治疗药物，现有药物可通过增加心血收缩力等来缓解重状，延长生命。研究发现，体内加压素的过量分泌是CHF病人并发低钠血症的病理之一，从而降低加压素的浓度或拮抗它对肾脏的作用成为治疗充血性心力衰竭和低钠血症的研究方向。加压素又称为抗利尿激素(antidiuretic hormone, ADH),是脑垂体分泌的一种环肽类激素，在人体调节游离水的重吸收、体液的等渗浓度、血液容积、血压、细胞收缩、细胞增殖和肾上腺皮质激素的分泌等方面扮演重要角色，它的这些生理作都是通过与加压素受体结合而产生的。加压素受体属于G蛋白偶联受体超家族(G-protein coupled protein,GPCR)，根据受体偶联的第二信使的不同可分为3种亚型V1 (或Via)、V2和V3 (或Vlb)。其中V2受体偶联于腺苷酸环化酶信号传导路径，以细跑内的cAMP作为第二信使。V2受体主要分布在肾脏的肾集合小管，调节游离水的重吸收。在人体内，加压素通过与V2受体结合，经过Gs蛋白，激活腺苷酸环化酶，提高细胞内作为第二信使的cAMP水平，激活蛋白激酶A,再激活水通道AQP-2，导致游离水通透性增高，水的重吸收增加而产生抗利尿作用。V2受体拮抗剂能特异性拮抗AVP与V2受体的结合，拮抗AVP的抗利尿作用，从而起到利水作用，治疗CHF的低钠血症及相关疾病。
发明内容
本发明的目的是提供一种加压素V2受体稳定表达细胞系的制备方法。本发明提供的加压素V2受体稳定表达细胞系的制备方法，包括以下步骤I)将加压素V2受体基因的编码序列插入到真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；2)将步骤I得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达加压素V2受体的细胞系。上述真核表达载体具体可为pTagLite-Snap、pEGFP_N3等。为了便于对表达的加压素V2受体进行细胞定位，可在真核表达载体上加入能于宿主中表达并产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如SNAP、GFP、YFP等。
上述宿主细胞可为Hela细胞、MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞等。利用上述方法制备的加压素V2受体稳定表达细胞系也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种筛选预防和/或治疗缺血性脑卒中、心肌梗死等药物的细胞模型。实验证明，本发明的加压素V2受体稳定表达细胞株对加压素V2受体阻断剂和加压素V2受体抗体敏感，作用显著。本发明的加压素V2受体稳定表达细胞系为深入探索加压素V2受体在血栓形成的作用提供实验技术平台，可用于筛选预防和/或治疗缺血性脑卒中、心肌梗死等药物。
图I为重组表达载体pTagLite-Snap_AVPR2的构建流程2为各稳定表达加压素V2受体细胞系的加压素V2受体表达量实验结果图3为加压素V2受体稳定表达细胞系对加压素V2受体抑制剂的敏感性分析实验结果
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，实施例仅为解释性的，绝不意味着以任何方式限制本发明的范围。本发明的加压素V2受体稳定表达细胞系的具体构建流程如图I所示。实施例I.重组真核表达载体pTagLite-Snap_AVPR2的构建下述实验过程中所用的DNA引物由上海生工生物技术有限公司合成。根据加压素V2受体蛋白编码框的cDNA序列，设计PCR引物如下正向引物5’ACTGATATCATGCTCATGGCGTCCACCACTTCCG-3’(下划线处为限制性内切酶的识别位点);反向引物5' -AACGAGCTCCGATGAAGTGTCCTTGGCCAGGGAG-3 '(下划线处为限制性内切酶的识别位点)。取人脐静脉内皮细胞HUVEC并提取总RNA，将其反转成cDNA，以该cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收，用限制性内切酶EcoRV和Xho I对纯化回收后的产物进行酶切，酶切产物再次进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收，得到加压素V2受体蛋白编码框的cDNA序列。同时，将真核表达载体pTagLite-Snap (购自Cisbio公司)也用EcoRV和Xho I进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收。用DNA连接酶连接上述扩增得到的加压素V2受体蛋白编码框的cDNA序列和真核表达载体pTagLite-Snap酶切后的产物,连接产物转化大肠杆菌(E. coliTop 10)感受态细胞，并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，挑取单克隆进行PCR检测。对PCR产物进行测序，以检测阳性克隆中插入序列的正确。测序结果表明，插入的1113bp的加压素V2受:体蛋白编码框的cDNA序列与GenBankAccession Number NM 000054. 4的自5'端第72位-第1184位的序列一致。将得到的重组表达载体命名为pTagLite-Snap-AVPR2受体。
实施例2·加压素V2受体稳定表达细胞系的建立将上述步骤一得到的重组大肠杆菌利用Wizard Plus SVMinipreps (购自Promega)提取质粒,得到高纯度的重组表达载体pTagLite-Snap-加压素V2受体,将重组表达载体 pTagLite-Snap-加压素 V2 受体利用 Lipofectamine 2000 (购自 Invitrogen)转染HeLa细胞，继续培养转染后的HeLa细胞24小时以上。用G418(浓度为I μ g/ml)对重组HeLa细胞进行筛选，经多次筛选后，得到加压素V2受体的稳定表达细胞系。将各株加压素V2受体稳定表达的Hela细胞株保存于液氮中。选取四个加压素V2受体稳定表达细胞株，利用抗加压素V2受体的抗体(购自AbCam公司)进行蛋白免疫印迹实验，结果如图2所示。其中，A-D分别表示不同的ET2的稳定表达细胞株的加压素V2受体表达量，Blank为转入真核表达载体pTagLite-Snap的空白对照细胞，anti-Tubulin表示参照。结果表明，各加压素V2受体的稳定表达细胞株均有不用程度的加压素V2受体表达。 实施例3.加压素V2受体稳定表达细胞系对加压素V2受体抑制剂(Conivaptan)的敏感性分析选用上述实施例2的加压素V2受体稳定表达细胞、转入真核表达载体pTagLite-Snap的细胞进行加压素V2受体抑制剂敏感性试验。将加压素V2受体稳定表达细胞、转入真核表达载体pTagLite-Snap的细胞培养于DMEM+10%胎牛血清的培养基里，将处于旺盛生长期的细胞(一般在传代后20小时左右)经膜蛋白酶消化重悬后，进行细胞计数，以每孔IO3到IO4个细胞的量接种于96孔板中进行扩增，且每孔细胞数目均匀。24小时后，分别加入加压素V2受体抑制剂(Conivaptan)。抑制剂(Conivaptan)的浓度分别为 10、20、30、40 和 50nM。而后按照 ET cell-based Assay Kit(购自 Cisbio)说明书进行HTRF(均相时间分辨荧光)实验，在加入抑制剂后的细胞孔板中加入标记的一抗和二抗，孵育30min后在sunrise酶标仪(TECAN公司产品)上于665和620nm波长处读取吸光值，进行数据分析，具体结果如图3所示。
权利要求
1.一种加压素V2稳定表达细胞系的制备方法，包括以下步骤 1)将加压素V2的编码基因插入真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体； 2)将步骤I得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达加压素V2的细胞系O
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体为pTagLite-Snap或PEGFP-N3。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为HeLa细胞、MDA-MB-231细胞或MCF-7细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法制备的加压素V2稳定表达细胞系。
5.根据权利要求4所述的加压素V2稳定表达细胞系，其特征在于，所述加压素V2稳定表达细胞系为SNAP-加压素V2稳定表达的HeLa细胞系。
6.权利要求4-5中任一项所述的加压素V2稳定表达细胞系在筛选预防和/或治疗针对此靶点药物中的应用。
全文摘要
本发明提供的加压素V2受体稳定表达细胞系的制备方法，从而提供一种筛选预防和/或治疗高血压、缺血性心脏病的药物的细胞模型。本发明提供的加压素V2受体稳定表达细胞系的制备方法，包括以下步骤1)将加压素V2受体基因的编码序列插入到真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；2)将步骤1得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达加压素V2受体的细胞系。
文档编号C12Q1/02GK102827868SQ20111016085
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者谭初兵, 徐为人, 付刚 申请人:天津药物研究院