专利名称：有机溶剂增强高gc含量dna片段扩增效率的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域的聚合酶链式反应(PCR)扩增，尤其是一种应用有机溶剂为优化剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法。
背景技术：
PCR技术是在核酸研究的基础上发展起来的，自1930年正式提出DNA和RNA两种核酸的概念后，人们对核酸的化学组成、结构及其功能进行了更为深入的研究，1953年 Watson和Crisk根据X —射线衍射图形及各种化学分析数据提出的DNA双螺旋结构及其半保留复制模型，是生物科学史上的一个飞跃，使得对基因在体外克隆、表达、调控等方面取得了长足的进展，并由此拉开基因工程的序幕。随着大量科学家的不断研究，在1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mul 1 is等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应 (PCR)。但是聚合酶链式反应(PCR)发展到今天已经有20多年的时间了，随着技术不断的发展、进步，PCR已经成为分子生物学研究中不可缺少的一项实验技术，并广泛应用于遗传学、微生物学、乃至整个生命科学领域的研究中。但是自PCR建立以来，在实际应用中也表现出了它所具有的不足，尤其是针对GC含量很高的序列更是不容易得到理想的结果，甚至有时候基本上扩增不出靶基因。因为G、C之间形成三对氢键，解链所需能量较高，模板较难打开，而高GC含量模板扩增中所面临的主要困难还是模板中容易形成稳定的二级结构， 妨碍了 DNA聚合酶在模板上的推进，以及模板上可能存在多个非特异性的引物局部复性位点，导致非特异性扩增。针对此方面的研究有很多，过去曾研发一些有效的手段来优化PCR效率。为解决此问题，人们采取了各种措施如增加变性及退火温度，调节Mg2+浓度，用NaOH进行DNA模板变性，用碱基类似物7-deaza-dGTP和dITP替代dGTP以降低被取代DNA的解链温度Tm，采用Touch-down方法进行扩增；也有人在PCR反应体系中加入各种促进剂，如甲酰胺、砜类 (DMSO)、甘油、BSA、非离子去污剂及氯化四甲基铵等，以增加PCR的特异性和产量。上述措施对有些GC含量高的DNA模板的PCR扩增有效，但有时无效，其原因前尚不清楚。因此找到切之有效的手段来优化PCR效率显得十分的重要，对这一问题的研究就很有意义，也对以后的研究工作也有一定的帮助作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中高GC含量DNA片段扩增的常见问题而提供一种有机溶剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法，该方法通过在PCR反应体系中添加有机溶剂达到对DNA片段的有效扩增，对高GC含量DNA片段扩增的效果明显。本发明采取的技术方案是一种有机溶剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法，包括(1).待扩增DNA的提取、( . PCR体系的配置及优化、C3). PCR条件的设定与运行、(4). PCR产物电泳检测，其特征在于PCR体系的优化是在PCR反应体系中添加有机溶剂，PCR产物的电泳检测采用
琼脂糖凝胶，跑胶后用EB液染色，然后用紫外分光透射仪观察扩增片段在凝胶中的位置， 并与相应的分子量标准做对照，所述有机溶剂为1，2_丙二醇，其添加量为15yL PCR反应液加入1.5yL的乙二醇。而且，所述有机溶剂为纯度为分析纯及以上级别的试剂。本发明的优点和积极效果是(1).本发明应用于高GC含量DNA片段扩增的有机溶剂乙二醇，比已有提高高GC 含量DNA片段的PCR添加剂具有更优的效果，对高GC模板的扩增效果明显，副作用少。这一发现对于高GC含量片段的扩增是一个新的突破，为满足不同实验内容的高GC扩增提供了有效的方法和借鉴。(2).本发明中所涉及的应用有机溶剂增强高GC含量DNA片段的扩增方法，与已有的方法相比，该方法所用的PCR促进剂为普通化学试剂，价格便宜，可获得性强；促进剂易于长期室温保存，使用方便。(3).本发明对富含GC碱基DNA片段的扩增效果明显，使得针对高GC含量序列的扩增更具有效率和目的性，对分子生物学技术试验的发展将具有重大理论意义和应用价值。
图1为本发明扩增GC% =68.8、长度为780bp的DNA片段的结果；
图2为本发明扩增GC% =69.6、长度为771bp的DNA片段的结果；
图3为本发明扩增GC% =62.1、长度为739bp的DNA片段的结果；
图4为本发明扩增GC% =71.1、长度为796bp的DNA片段的结果；
图5为本发明扩增GC% =71.2、长度为的DNA片段的结果；
图6为本发明扩增GC% =71.6、长度为728bp的DNA片段的结果；
图7为本发明扩增GC% =73.3、产度为806bp的DNA片段的结果；
图8为本发明扩增GC% =78.1、长度为的DNA片段的结果；
图9为本发明扩增GC% =76.9、长度为729bp的DNA片段的结果；
图10为本发明扩增GC% ==76. 3、长度为754bp的DNA片段的结果
图11为本发明扩增GC% ==75. 9、长度为714bp的DNA片段的结果。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明所涉及的PCR技术的优化方法是通过向PCR体系中添加有机溶剂来实现的，其具体操作方法如下1.待扩增人类基因组DNA的提取2. PCR体系的配置及优化PCR体系根据现有的技术，由待扩增DNA片断的不同而各不相同。具体表现在 dNTP、模板、Mg2+、引物的添加量根据不同的模板和不同的扩增片段长度来选择；PCR反应体系中的H2O为双蒸水及以上级别水，体系中水的添加量应根据有机溶剂添加的体积进行调整，即应扣除相应添加的有机溶剂的体积。在上述PCR反应体系中加入一定体积的所选用的某一种有机溶剂。为适合PCR反应的特殊需要，所有有机溶剂均需用一定的方法灭DNA酶和RNA酶。灭酶的方法有多种，本发明采用的方法是真空滤膜过滤灭酶法。对于直接购买的已经灭DNA酶和RNA酶的产品，无需再做灭酶处理。3. PCR条件的设定与运行PCR反应条件中的预变性、变性及退火各阶段的温度和对应时间应根据不同模板和引物融解温度来选择；其中的延伸温度根据所用聚合酶的合适温度来选择；延伸时间根据所扩增片段的长度来选择；循环次数根据个人试验目的和需要进行选择。4. PCR产物的检测一般用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测，琼脂糖凝胶的浓度及PCR产物的上样体积需根据具体情况而定。本发明所采用的琼脂糖凝胶电泳技术依照已有方法概括如下(1).琼脂糖凝胶的具体浓度大小应根据扩增DNA片段的大小来确定。(2).吸取一定体积的PCR产物上电泳槽点样，同时点上合适分子量标记作为参照。(3).加上3-4V/cm的电压进行电泳。(4).待指示剂到合适位置时，取出胶板于凝胶成象系统下观察并照相记录。本发明采用的有机溶剂为下述之一，或者两种以上的混合物，包括系列酯类，如乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸丁酯等；系列醇类，如丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇，仲丁醇，叔丁醇，正己醇等；系列酮类，如2-丁酮。而且所有的有机溶剂纯度为分析纯及以上级别的试剂。本发明中PCR体系的优化是指直接在体系中加入一定体积的一种或几种上述有机溶剂，所用有机溶剂无需任何方式的稀释。本发明所称的PCR扩增包括常规PCR、低拷贝数PCR扩增、长片段PCR、复杂模板 PCR、高GC含量的PCR、反复扩增的PCR以及含有较多重复序列的PCR扩增。具体示例一种有机溶剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法，其步骤是1.待扩增人类基因组DNA的提取2. PCR反应体系的配置按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中。10XPCR缓冲液2. 5μ LdNTP 底物(2. 5mM)3μ L引物 1(4. 0 μ Μ)2μ L引物 2 (4.0 μ Μ)2μ L模板(0. 1 μ g/ μ L)2μ LMg2+(25mM)1. 5 μ LTaq 酶(5U/pL)0. 5μ L有机溶剂1. 5 μ L 其中，模板为GenomicDNA，从人类血液中提取；Taq酶及有机溶剂来自北京三博远志生物工程公司。采用的方法是真空滤膜过滤灭酶法。对于直接购买的已经灭DNA酶和 RNA酶的产品，无需再做灭酶处理。
3. PCR体系的优化与运行在多种有机溶剂对低GC含量DNA的作用下，选择扩增效果显著试剂，运用选择出的有机溶剂对高GC难扩增的DNA片段进行实验。通过本实验，发现1，2-丙二醇和乙二醇对高GC难扩增的DNA片段扩增有显著作用。对不同GC含量的DNA片段，每个片段都配置4管，且从0 3编号。每个片段的0 3管，分别添加不用的试剂，添加试剂分别为0号管本身扩增，无添加任何试剂；1 号管添加 Betaine ；2号管添加1，2-丙二醇；3号管添加乙二醇。3.按以下条件在PCR仪上设定循环条件进行PCR热循环。
权利要求
1.一种有机溶剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法，包括(1).待扩增DNA的提取、( . PCR体系的配置及优化、C3). PCR条件的设定与运行、(4). PCR产物电泳检测，其特征在于PCR体系的优化是在PCR反应体系中添加有机溶剂，PCR产物的电泳检测采用琼脂糖凝胶，跑胶后用EB液染色，然后用紫外分光透射仪观察扩增片段在凝胶中的位置， 并与相应的分子量标准做对照，所述有机溶剂为乙二醇，其添加量为15 μ L PCR反应液加入 1. 5μ L的乙二醇。
2.根据权利要求1所述的有机溶剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法，其特征在于所述有机溶剂为纯度为分析纯及以上级别的试剂。
全文摘要
本发明涉及一种有机溶剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法，包括(1)待扩增DNA的提取、(2)PCR体系的配置及优化、(3)PCR条件的设定与运行、(4)PCR产物电泳检测，其中PCR体系的优化是在PCR反应体系中添加有机溶剂，PCR产物电泳检测采用1％琼脂糖凝胶，跑胶后用EB液染色，然后用紫外分光透射仪观察扩增片段在凝胶中的位置，并与相应的分子量标准做对照。本发明使用的优化剂为普通化学试剂，价格便宜，可获得性强；优化剂易于长期室温保存，使用方便。本发明对富含GC碱基DNA片段的扩增效果明显，使得针对高GC含量序列的扩增更具有效率和目的性。这对分子生物学技术试验的发展将具有重大理论意义和应用价值。
文档编号C12N15/10GK102226176SQ20111016053
公开日2011年10月26日 申请日期2008年9月10日 优先权日2008年9月10日
发明者刘芳, 孟良玉, 张治洲, 杨霞 申请人:天津科技大学