专利名称：一种et1稳定表达细胞系的建立及其在药物筛选中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域和医药技术领域，具体涉及一种ETl稳定表达细胞系及其在药物筛选中的应用。
背景技术：
高血压(hypertensive disease)是一种以动脉血压持续升高为主要表现的慢性疾病，常引起心、脑、肾等重要器官的病变并出现相应的后果。目前，高血压已成为世界范围内引起心血管事件最重要的可改变因素之一，其危害日趋严重。我国现有高血压人群已逾2亿，其治疗率和控制率仍然不高。内皮素(Endothelin，ET)是日本学者Yanagisawa等从培养的猪主动脉内皮细胞中分离纯化出一种活性多肽，其不仅存在于血管内皮，也广泛存在于各种组织和细胞中，是调节心血管功能的重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。它是由21个氨基酸组成的多肽，分子量为2400D，ET-I另有两个同分异构体家族即ET-2，ET-3，对于心血管起主要作用的是ET-I。内皮素是迄今所知最强的缩血 管物质，其作用时间持久，是一种内源性长效血管收缩调节因子。内皮素还有强大的正性肌力作用，并且缩血管升血压效应还可反射性引起心率抑制，造成心肌供血不足，而且还可诱发心肌细胞糖超载，心律失常以及心肌能量代谢障碍。目前大量研究表碍严重心绞痛、AMI、心肌1/R损伤、经皮腔内成形术的机体ET合成和释放碍显增加，或血管对ET反应性亢进，都可能促进上述病理过程的发生发展。而应用ET抗体或ET阻断剂则可防治高血压等心脑血管疾病。
发明内容
本发明的目的是提供一种ETl稳定表达细胞系的制备方法。本发明提供的ETl稳定表达细胞系的制备方法，包括以下步骤I)将ETl基因的编码序列插入到真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；2)将步骤I得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达ETl的细胞系O上述真核表达载体具体可为pTagLite-Snap、pEGFP_N3等。为了便于对表达的ETl进行细胞定位，可在真核表达载体上加入能于宿主中表达并产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如SNAP、GFP、YFP等。上述宿主细胞可为Hela细胞、MDA_MB_231细胞、MCF-7细胞等。利用上述方法制备的ETl稳定表达细胞系也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种筛选预防和/或治疗高血压、缺血性心脏病的药物的细胞模型。实验证明，本发明的ETl稳定表达细胞株对ETl阻断剂和ETl抗体敏感，作用显著。本发明的ETl稳定表达细胞系为深入探索ETl在高血压中的作用提供实验技术平台，可用于筛选预防和/或治疗高血压的药物。
图I为重组表达载体pTagLite-Snap-ETl的构建流程2为各稳定表达ETl细胞系的ETl表达量实验结果图3为ETl稳定表达细胞系对ETl抑制剂的敏感性分析实验结果
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，实施例仅为解释性的，绝不意味着 以任何方式限制本发明的范围。本发明的ETl稳定表达细胞系的具体构建流程如图I所示。实施例I.重组真核表达载体pTagLite-Snap-ETl的构建下述实验过程中所用的DNA引物由上海生工生物技术有限公司合成。根据ETl蛋白编码框的cDNA序列，设计PCR引物如下正向引物5，-ACTGATATCATGGATTATTTGCTCATGATTTTCT-3，(下划线处为限制性内切酶的识别位点)；反向引物5' -AACGAGCTCCCAATGTGCTCGGTTGTGGGTCACA-3 '(下划线处为限制性内切酶的识别位点)。取人脐静脉内皮细胞HUVEC并提取总RNA，将其反转成cDNA，以该cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收，用限制性内切酶EcoR V和Xho I对纯化回收后的产物进行酶切，酶切产物再次进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收，得到ETl蛋白编码框的cDNA序列。同时，将真核表达载体pTagLite-Snap (购自Cisbio公司)也用EcoR V和Xho I进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收。用DNA连接酶连接上述扩增得到的ETl蛋白编码框的cDNA序列和真核表达载体pTagLite-Snap酶切后的产物,连接产物转化大肠杆菌(E. coli Top 10)感受态细胞,并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，挑取单克隆进行PCR检测。对PCR产物进行测序，以检测阳性克隆中插入序列的正确。测序结果表明，插入的636bp的ETl蛋白编码框的cDNA序列与 GenBank Accession Number NM 001955. 4 的自 5'端第 335 位-第 970 位的序列一致。将得到的重组表达载体命名为pTagLite-Snap-ETl。实施例2.ETl稳定表达细胞系的建立将上述步骤一得到的重组大肠杆菌利用Wizard Plus SV Minipreps (购自Promega)提取质粒，得到高纯度的重组表达载体pTagLite-Snap-ETl,将重组表达载体pTagLite-Snap-ETl 利用 Lipofectamine 2000 (购自 Invitrogen)转染 HeLa 细胞，继续培养转染后的HeLa细胞24小时以上。用G418 (浓度为I μ g/ml)对重组HeLa细胞进行筛选，经多次筛选后，得到ETl的稳定表达细胞系。将各株ETl稳定表达的Hela细胞株保存于液氮中。选取四个ETl稳定表达细胞株,利用抗ETl的抗体(购自AbCam公司)进行蛋白免疫印迹实验，结果如图2所示。其中，A-D分别表示不同的ET2的稳定表达细胞株的ETl表达量，Blank为转入真核表达载体pTagLite-Snap的空白对照细胞,anti-Tubulin表示参照。结果表明，各ETl的稳定表达细胞株均有不用程度的ETl表达。实施例3.ETl稳定表达细胞系对ETl抑制剂(Ambrisentan)的敏感性分析选用上述实施例2的ETl稳定表达细胞、转入真核表达载体pTagLite-Snap的细胞进行ETl抑制剂敏感性试验。将ETl稳定表达细胞、转入真核表达载体pTagLite-Snap的细胞培养于DMEM+10%胎牛血清的培养基里，将处于旺盛生长期的细胞(一般在传代后20小时左右)经膜蛋白酶消化重悬后，进行细胞计数，以每孔IO3到IO4个细胞的量接种于96孔板中进行扩增，且每孔细胞数目均匀。24小时后，分别加入ETl抑制剂(Ambrisentan)。抑制剂(Ambrisentan)的浓度分别为 10、20、30、40 和 50nM。而后按照 ET cell-based Assay Kit(购自Cisbio)说明书进行HTRF(均相时间分辨荧光)实验，在加入抑制剂后的细胞孔板中加入标记的一抗和二抗，孵育30min后在sunrise酶标仪(TECAN公司产品)上于665和620nm波长处读取吸光值，进行数据分析，具体结果如图3所示。
权利要求
1.一种ETl稳定表达细胞系的制备方法,包括以下步骤 1)将ETl的编码基因插入真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体； 2)将步骤I得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达ETl的细胞系。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体为pTagLite-Snap或PEGFP-N3。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为HeLa细胞、MDA-MB-231细胞或MCF-7细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法制备的ETl稳定表达细胞系。
5.根据权利要求4所述的ETl稳定表达细胞系，其特征在于，所述ETl稳定表达细胞系为SNAP-ETl稳定表达的HeLa细胞系。
6.权利要求4-5中任一项所述的ETl稳定表达细胞系在筛选预防和/或治疗针对此靶点的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种ET1稳定表达细胞系的建立及其在药物筛选中的应用。本发明提供了一种ET1稳定表达细胞系的制备方法，从而提供一种筛选预防和/或治疗高血压、缺血性心脏病的药物的细胞模型。
文档编号C12Q1/02GK102827870SQ20111016116
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者谭初兵, 付刚, 徐为人 申请人:天津药物研究院