专利名称：一种蝉棒束孢菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体来就涉及一种蝉棒束孢菌株，同时涉及该蝉棒束孢菌株在用于接种家蚕培养蝉花方面的用途。
背景技术：
蝉花是真菌寄生山蝉若虫致死的虫和菌的复合体，因其头部长出的孢梗束形似花蕾故名蝉花。蝉花是一个古老名贵而极具开发价值的虫生真菌。蝉花是清热、解毒、驱风、 镇痛和明目的名贵草药；主治小儿惊风、夜啼等。临床试验表明，蝉花有改善肾功能和减缓肾衰竭并发症的作用；蝉花能明显提高小鼠在常压缺氧和高温下的存活时间，表明其具有抗应激和抗疲劳作用，有较好的镇静催眠作用。蝉花一般生长在针阔叶混交林带，森林覆盖率为65. 13 %，大多分布在海拔700 950 m，坡度为30 40°的向阳坡上，呈明显的垂直分布状态。据《证类本草》载“蝉花，所在皆有，七月采。生苦竹林者良，花出土上”。其主要产地是在江浙、川、云、贵和福、广一带，但产量远远不能满足人们对蝉花用作药品和保健食品的需求。在自然基物上培养的蝉花只有子座而无虫体，外观上与虫菌复合的野生蝉花有较大区别，因此不宜作为药材上市，只能作为有关药品或保健品的加工原料。近年研究蝉棒束孢Osaria cicai/ae)发酵菌丝体含有多种活性物质，如、甘露醇、生物碱、麦角留醇、蛋白质、氨基酸、多糖、腺苷、维生素E、维生素A，不饱和脂肪酸，以及多种微量元素。并测定大多数活性成分高于天然蝉花含量。蝉棒束孢因其与冬虫夏草 {Cordyceps sinensis Sacc)含有相近的化学成分，所以常作为冬虫夏草的代用品。家蚕和蚕蛹是传统的优质滋补品，化学成分十分丰富，家蚕的传统利用主要是白僵蚕的利用；以及蛋白质，脂肪酸开发成各种食品及保健品。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种能获得与自然山林采集的蝉花一样的感染体的蝉棒束孢菌株。本发明的另一目的在于提供该蝉棒束孢菌株在用于接种家蚕培养蝉花方面的用途。一种Isaria cicadae (蝉棒束孢)青城山-16，其真菌学特征是
培养性状在查氏培养基上25 士 1 °C培养14天，菌落直径70mm，毡状平展，具有豆汁黄粉层，背面无色。在萨氏培养基上25士 1°C培养14天，菌落直径70mm，豆汁黄同心圆粉状轮层，具浅茶色露珠，背面无色。个体产孢结构分生孢子梗生长于气生菌丝上，由单生或对生有时5-8个瓶梗组成的轮生体。瓶状小梗具有基部膨大的较小瓶梗和基部不膨大的较大瓶梗两种，其上均有细长的管状端部。小瓶梗9. 6-19. 2MmX2. 7-3Mm;大瓶梗27- 33MmX3_3. 6Mm。分生孢子壁光滑，透明，大小两型，小孢子长卵圆形至柱状，6-7. SMfflX2. 4-3. 6Mm ；大孢子圆锥状，长柱状，8. 4-10. 2ΜπιΧ3. 6- 4. 2Mm，顶端往往为长柱状双细胞，偶尔具有两个分隔的三细胞，22-25. 8MmX3-3. 6Mm。菌丝宽 1· 5- 2. OMm。该菌种已于2010年7月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址中国武汉武汉大学),保藏号CCTCC NO :M2010187，名称为..Isaria cicadae青城山-16。(一)Isaria cicadae (蝉棒束孢)青城山-16的分离步骤
(1)2003年7月从青城山竹林中采到蝉若虫罹真菌病死亡的新鲜标本；
(2)立即从其标本的孢梗束膨大如花的顶部，用酒精火焰烧烁灭菌过的接种针，轻轻挑取少量孢子粉置于灭菌的沙氏培养基斜面上，于自然温度下培养，3至5天后白色菌落长满斜面。(3)用透明胶纸粘菌制作棉兰染色载玻片，显微镜检，筛选出分生孢子梗生长于气生菌丝上，由单生或对生有时5-8个瓶梗组成的轮生体。瓶状小梗具有基部膨大的较小瓶梗和基部不膨大的较大瓶梗两种，其上均有细长的管状端部。小瓶梗 9. 6-19. 2MmX2. 7-3Mm ；大瓶梗27- 33MmX3_3. 6Mm。分生孢子壁光滑，透明，大小两型， 小孢子长卵圆形至柱状，6-7. 8MmX2. 4-3. 6Mm ；大孢子圆锥状，长柱状，8. 4-10. 2MmX3. 6-4. 2Mm，顶端往往为长柱状双细胞，偶尔具有两个分隔的三细胞，22-25. 8MmX 3-3. 6Mm。 菌丝宽1.5- 2. OMfli。将分离获得的本发明菌株，与Samson (1974)描述的(蝉拟青霉 Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson)艮口[Il单棒束抱/saria cicadae.对比得知，分离菌株青城山-16除具有较长的披针状瓶梗和偶见三细胞分生孢子外，主要个体特征与其瓶状小梗4. 2-6. 5 μ mX 2. 5-3. 5 μ m ；分生孢子3. 5-8. OymXl. 5-3. 5 μ m的描述极其相似，因此鉴定为蝉棒束孢(haria cicadae), I命名为Isaria cicat/ae青城山-16。
(二)培赛Isaria cicadae (蝉棒束孢)青城山-16的培养基
用查氏(Capek)、改良查氏(Capek + 0. 05 %蛋白冻)、萨氏(Sabourd)或马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基培养孢子粉。(三)菌种的保种和传代一般用萨氏(Sabourd)培养基斜面，每年移接传代一次。菌种斜面保存于4°C的保鲜室。一种用Isaria cicadae (蝉棒束孢)青城山-16培养蝉花的方法，包括以下步骤
(1)将/sariacicadae)青城山-16 用查氏(Capek)、改良查氏(Capek + 0. 05%蛋白冻)、萨氏(Sabourd)或马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基培养孢子粉；
(2)采用0.05%吐温80水将蝉棒束孢孢子从培养皿或试管斜面洗下并稀释成IXlO6至 IXlO8分生孢子/ml浓度的孢子悬液；
(3)将老熟幼虫或幼蛹轻轻地放入上述孢子悬液中2至3秒钟后捞起，置入灭菌的具吸水纸的培养皿内，常温或下保湿(RH值80%以上)培养2至3周获得蝉花。本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知选用家蚕作为感染对象获得蝉花，是因为家蚕感染白僵菌所得僵蚕本身是一位传统中药，其安全性无可非议。选用家蚕老熟幼虫或幼蛹作感染体，这样的虫态已经不吃桑叶，而且对环境的微生物有了抗性即不容易感染杂菌，因而会获得纯净的蝉花。本发明利用/saria cicadae着城山-16菌株培养的新鲜孢子粉感染虫能力较强特点，将其接种感染高龄家蚕幼虫或幼蛹后，经保湿、保温培养2至3周获得蝉花。
具体实施例方式
实施例1
本发明的蝉棒束孢菌Usaria cicadae)青城山-16的分离步骤
(1)2003年7月从青城山竹林中采到蝉若虫罹真菌病死亡的新鲜标本；
(2)立即从其标本的孢梗束膨大如花的顶部，用酒精火焰烧烁灭菌过的接种针，轻轻挑取少量孢子粉置于灭菌的沙氏培养基斜面上，于自然温度下培养，3至5天后白色菌落长满斜面。(3)用透明胶纸粘菌制作棉兰染色载玻片，显微镜检。筛选出菌的产孢结构与蝉棒 Isaria cicadae^) fttB^ Isaria cicstfei —16。通过以下例子来进一步说明Isaria cicadae青城山-16的用途。实施例2:
一种用蝉棒束孢菌ijsaria cicadae)青城山-16培养蝉花的方法，包括以下步骤
(1)将/sariacicadae)青城山-16 用查氏(Capek)、改良查氏(Capek + 0. 05%蛋白冻)、萨氏(Sabourd)或马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基在下培养孢子粉；
(2)培养1周后，采用0.05%吐温80水将蝉棒束孢孢子从培养皿或试管斜面洗下并稀释成IXlO6至IXlO8分生孢子/ml浓度的孢子悬液；
(3)将5龄家蚕轻轻地放入上述孢子悬液中2秒钟后捞起，置入灭菌的具吸水纸的培养皿内，常温下保湿(RH值80%以上)培养3周获得蝉花。实施例3:
一种用蝉棒束孢菌ijsaria cicadae)青城山-16培养蝉花的方法，包括以下步骤 (1) (2)步同实施例2 ；
(3)将5龄家蚕轻轻地放入上述孢子悬液中3秒钟后捞起，置入灭菌的具吸水纸的培养皿内，下保湿(RH值80%以上)培养3周获得蝉花。实施例4
一种用蝉棒束孢菌ijsaria cicadae)青城山-16培养蝉花的方法，包括以下步骤 (1) (2)步同实施例2 ；
(3)将已经开始吐丝并结成薄薄透明的蚕茧，剪开包裹蚕的薄膜取出尚未脱皮的蚕轻轻地放入上述孢子悬液中2秒钟后捞起，置入灭菌的具吸水纸的培养皿内，下保湿 (RH值80%以上)培养2周获得蝉花。实施例5:
一种用蝉棒束孢菌ijsaria cicadae)青城山-16培养蝉花的方法，包括以下步骤 (1) (2)步同实施例2 ；
(3)将已经结茧的幼蛹剪开包裹蚕的薄膜取出新化的蛹轻轻地放入上述孢子悬液中3 秒钟后捞起，置入灭菌的具吸水纸的培养皿内，常温下保湿(RH值80%以上)培养2周获得蝉花。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种蝉棒束孢菌(Jsaria cicadae)青城山_16，其特征在于所述菌种的保藏号为 CCTCC NO :M2010187o
2.如权利要求1所述的蝉棒束孢青城山-16在用于接种家蚕培养蝉花方面的用途。
全文摘要
本发明公开了一种蝉棒束孢菌(Isariacicadae)青城山-16及其用途，所述菌种的保藏号为CCTCCNOM2010187。其真菌学特征是在查氏培养基上25±1℃培养14天，菌落直径70mm，毡状平展，具有豆汁黄粉层，背面无色。在萨氏培养基上25±1℃培养14天，菌落直径70mm，豆汁黄同心圆粉状轮层，具浅茶色露珠。背面无色。本发明能获得与自然山林采集的蝉花一样的感染体。
文档编号C12N1/14GK102250777SQ20111016591
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者刘爱英, 罗力, 胡海燕, 赵杰宏, 邹晓 申请人:贵州大学