专利名称：一种碳钢腐蚀细菌的定量检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种浸海碳钢腐蚀细菌-海洋玫瑰杆菌族 (Roseobacter clade)细菌定量检测方法。
背景技术：
微生物腐蚀是一个非常严重的环境和工程问题。在美国，腐蚀直接造成的经济损失每年高达近3千亿美元，英国、日本、澳大利亚、德国、科威特、芬兰、瑞典和印度等国的统计数据也表明，腐蚀损失约占国家生产总值(GDP)的 5%，依此推算我国每年腐蚀所造成的经济损失已超过6千亿元。近年来，我国海洋石油平台、海港码头和跨海大桥等重大海洋工程设施建设呈现急剧上升趋势，海洋腐蚀的危害和损失日益加剧，腐蚀微生物检测和防护技术已成为海洋设施安全和长期有效使用的关键。前期研究发现，海洋玫瑰杆菌族细菌是海洋中的一类重要菌群，在浸海物体表面及海水悬浮颗粒物中构成了关键初级附着菌，即所谓的“附着拓殖种”(Dang and Lovell, 2000, 2002a, 2002b ；黄进强等，2008)。并且大部分海洋玫瑰杆菌族细菌在浸海固体表面易产生生物膜(Biofilm)，对附着微生物群落的形成、发育和功能熟化及海洋污损和金属腐蚀生物群落的发生起到至关重要作用(Lau, et al. ,2003 ；Roa et al. ,2007 ；Dang et al.， 2008)。同时，一些海洋玫瑰杆菌族细菌还可以在一定环境条件下产生次级代谢产物(包括一些抗菌药物等)(Slightom and Buchan，2009)。因此，海洋玫瑰杆菌族细菌不但可诱发海洋环境中金属腐蚀的发生，同时其中的一些产抗菌素菌种还可以作为抑制生物污损和金属腐蚀的海洋益生菌而被开发利用，从而用以生产抗污损和抗腐蚀的生物制剂。因此，浸海金属表面海洋玫瑰杆菌族细菌的附着动态和数量检测构成了海洋生物污损和金属腐蚀防护的一个关键。以前对海水中碳钢腐蚀微生物的检测方法大多依赖微生物的培养，费时耗力，且因为很多种类的海洋微生物目前尚无法培养，培养法很难达到检测准确性的要求。党宏月和黄进强等人(Dangand Lovell, 2000, 2002a, 2002b ；Dang et al.，2008 ； 黄进强等，2008)曾通过细菌16S rRNA基因克隆文库定性研究方法和DNA分子探针荧光原位杂交(FISH)定量研究技术，对该类细菌在非金属浸海材料上进行了种类、分布、动态变化等定性和定量研究。FISH细菌定量法在腐蚀微生物检测应用中存在实验步骤繁琐、操作复杂、所用仪器(激光共聚焦显微镜)昂贵并需专业技术人员操作、定量结果误差大等种种弊端，不适合常规金属腐蚀微生物检测和监测这一应用目标。并且，以前的文献报道大多没有涉及与碳钢腐蚀相关的研究。针对海水碳钢腐蚀微生物群落中海洋玫瑰杆菌族细菌的定量检测方法目前尚未见科技文献或专利报道。为了实现该目的，本发明针对浸海碳钢腐蚀微生物关键菌群_海洋玫瑰杆菌族细菌，设计一种不依赖微生物培养的以现代分子生物技术为手段的海洋玫瑰杆菌族细菌定量检测技术，可以快速准确地检测该类细菌在浸海碳钢表面的附着和生长状况及其随碳钢腐蚀程度变化的数量动态变化特征，为海水碳钢腐蚀微生物的研究和检测提供了新技术，大大提高了检测效率和准确率。该方法快速、高效、准确，并成功地应用于青岛沿岸海水碳钢腐蚀微生物的检测中，获得了理想检测数据。
发明内容
为了实现上述目的，本发明提供一种海洋玫瑰杆菌族(Roseobacter clade)细菌定量检测方法，包括以下步骤针对海洋玫瑰杆菌族细菌16S rRNA基因，设计特异性引物， 提取样品中微生物基因组DNA，利用实时荧光定量PCR技术定量检测样品中海洋玫瑰杆菌族(Roseobacter clade)细菌。优选的，所述的特异性引物为以 Rose_F :5，-CCGAACAACGCTAACCCC—3，(SEQ ID NO 1)禾口Rose_R 5' -GGCCTACCAAGTCTACGATC-3，(SEQ ID NO :2)。优选的，本发明实时荧光定量PCR条件为95°C变性50秒，之后进行40个PCR循环，每一循环包括95°C变性5秒；56°C退火30秒；72°C延伸45秒，荧光读值设定为72°C。本发明进一步提供了上述定量检测方法用于定量检测浸海碳钢表面海洋玫瑰杆菌族(Roseobacter clade)细菌的用途。本发明提供的一种以实时荧光定量PCR (fluorescent quantitative real-time PCR，简称FQ-PCR)为技术基础的碳钢海水腐蚀细菌群落海洋玫瑰杆菌族细菌的定量检测方法，通过自行设计的用以该检测技术的FQ-PCR引物对，实现了快速、准确、并且检测成本低的目标，易于推广应用。该引物对特异性非常好，并且FQ-PCR反应条件易于优化，该引物对是实现海洋玫瑰杆菌族细菌定量检测的关键技术，特别适用于碳钢海水腐蚀微生物群落中海洋玫瑰杆菌族细菌定量检测。
图1.青岛海水中碳钢腐蚀细菌群落中海洋玫瑰杆菌族细菌的定量检测及其数量变动特征(3 5次重复实验的平均值和标准差)，图中带“*”号的条柱为应用本发明自行设计的FQ-PCR引物对(Rose_F* Rose_R)得到的定量检测结果。该图还说明，类似的FQ-PCR检查方法也可用于海水中碳钢腐蚀细菌群落中其它菌群的定量检测(只是不同的菌群需用不同的FQ-PCR引物对)。
具体实施例方式本发明提供的一种浸海碳钢腐蚀细菌-海洋玫瑰杆菌族细菌定量检测方法，基于实时荧光定量PCR(FQ-PCR)这一基因定量检测技术原理，通过自行设计针对海洋玫瑰杆菌族细菌的特异FQ-PCR引物对(即一对引物)，在碳钢海水腐蚀微生物群落中特异性地定量检测海洋玫瑰杆菌族细菌的16S rRNA基因的丰度，从而实现对碳钢海水腐蚀微生物群落中海洋玫瑰杆菌族细菌的定量检测。该检测技术中，FQ-PCR引物对是实现碳钢海水腐蚀微生物群落中海洋玫瑰杆菌族细菌定量检测的关键，FQ-PCR引物对的作用是特异性地识别目标细菌的目标基因，这种识别特异性的实现归功于FQ-PCR引物对DNA序列的设计上。针对碳钢海水腐蚀微生物群落中海洋玫瑰杆菌族细菌的16S rRNA基因，本发明提供了特异性FQ-PCR引物对Rose_F 5' -CCGAACAACGCTAACCCC—3，(SEQ ID NO 1)Rose_R 5' -GGCCTACCAAGTCTACGATC-3，(SEQ ID NO 2)该FQ-PCR引物对保证了本发明的检测方法是特异性地针对海洋玫瑰杆菌族细菌 (而不是其他不相干细菌)，从而实现了该发明检测方法的检测有效性和特异性。在此基础上，本发明优化了 FQ-PCR检测条件，从而实现了该发明检测方法的准确性和可重复性。优化后的FQ-PCR实验条件具体如下应用宝生物公司(Takara，Japan)的 SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time)荧光定量试剂盒(Takara code :DRR081A ；除以下特别说明，试剂盒按照厂商提供的说明书使用)，对其反应条件优化为95°C变性50秒，之后进行40个PCR循环，每循环条件为(95°C变性5秒；56°C退火30秒；72°C延伸45秒)，荧光读值设定为72°C。为了获得解链曲线(Melting curves)以检验FQ-PCR检测反应的特异性和工作质量，本发明在60°C到95°C之间，温度每升高1°C进行一次荧光读值。该FQ-PCR检测反应在一台 ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems，USA)焚光定量PCR仪进行，在其它类似的不同商业品牌的荧光定量PCR仪上，该反应条件可得到相似结果。因此，只要有了该FQ-PCR引物对(R0Se_F*R0Se_R)，该碳钢腐蚀微生物定量检测技术的应用就可以得以实现，检测结果的准确性和检测效率将不受影响。因此，该发明检测技术不但优于以往技术，并且便于推广应用。实施例1.对实验室人工构建的模拟菌株目标基因的检测为验证应用该FQ-PCR引物对(Rose_F和Rose_R)对海洋玫瑰杆菌族细菌的定量检测可行性及准确率，本发明利用在以前研究中构建的海洋细菌16S rRNA基因文库(Dang et al.，2008)，从中选取了携带海洋玫瑰杆菌族细菌16S rRNA基因的克隆，应用Qiagen 公司(Qiagen, USA)的质粒提取试剂盒(Mini Plasmid Kit, Qiagen Catalog no. 12125， 试剂盒按照厂商提供的说明书使用)进行了海洋玫瑰杆菌族细菌16S rRNA基因质粒的提取，并应用定量焚光仪(Modulus Single Tube Multimode Reader fluorometer, Turner Biosystems, USA)和 PicoGreen 核酸荧光染料(Molecular Probes, USA)进行了质粒浓度定量测定并建立了质粒浓度梯度系列溶液。依照上述具体实施方式
，应用引物对(Rose_F和Rose_R)，本发明对不同浓度的质粒溶液进行了海洋玫瑰杆菌族细菌16S rRNA基因的FQ-PCR定量检测(3 5个重复)，同时使用不含海洋玫瑰杆菌族细菌16S rRNA基因的质粒溶液作为负对照(阴性对照)，实验结果显示，该FQ-PCR定量检测方法对所有的目标样品皆检测到海洋玫瑰杆菌族细菌16S rRNA基因，对不含海洋玫瑰杆菌族细菌16S rRNA基因的负对照(阴性对照)样品检测结果皆为0，表明该检测技术具有非常高的特异性和准确度，应用该技术的定量检测结果表明， 该方法同时还具有非常高的检查效率和检测灵敏度(表1)。表1.海洋玫瑰杆菌族细菌16S rRNA基因FQ-PCR定量检测的检测效率和检测灵敏度
权利要求
1.一种海洋玫瑰杆菌族(Roseobacter clade)细菌定量检测方法，其特征在于包括以下步骤针对海洋玫瑰杆菌族细菌16S rRNA基因，设计特异性引物，提取样品中微生物基因组DNA，利用实时荧光定量PCR技术定量检测样品中海洋玫瑰杆菌族(Roseobacter clade)细菌；所述的特异性引物如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的实时荧光定量PCR条件为95°C变性 50秒，之后进行40个PCR循环；每一循环为95°C变性5秒，56 V退火30秒，72°C延伸45秒； 荧光读值设定为72°C。
3.如权利要求1或2任一所述的方法用于定量检测浸海碳钢表面海洋玫瑰杆菌族 (Roseobacter clade)细菌的用途。
全文摘要
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种海洋玫瑰杆菌族(Roseobacter clade)细菌定量检测方法，该方法包括以下步骤针对海洋玫瑰杆菌族细菌16S rRNA基因，设计特异性引物，提取样品中微生物基因组DNA，利用实时荧光定量PCR技术定量检测样品中海洋玫瑰杆菌族(Roseobacter clade)细菌。
文档编号C12Q1/68GK102242203SQ20111017176
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月24日 优先权日2011年6月10日
发明者党宏月, 王琳, 陈瑞鹏 申请人:中国石油大学(华东)