专利名称：一种浮游动物及其肠道内含物总基因组dna的提取方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA 的提取方法。
背景技术：
浮游动物是食物链的次级生产者，在海洋食物网中处于承上启下的枢纽位置，是海洋生物泵的主要驱动者，对生源要素的生物地球化学循环作用显著。因此，开展其摄食生态学研究对了解海洋生态系统的结构功能，量化物质和能量沿食物链的级联效应，探讨海域生物生产力水平及其变化规律具有重要意义。运用分子生物学技术，可突破“培养”环节，直接研究自然环境中浮游动物的肠道食物组成及其摄食效率，明确其相应功能反应，准确构建现场浮游食物网的定性结构，进而解析区域生态系统的功能和效率。这些研究都要以获取高质量浮游动物肠道内含物基因组DNA为前提。但是由于浮游动物体表常附着有其他生物，因此要准确获得浮游动物摄食状况，首先要保证其体表无其他生物污染；要获取高质量的肠道DNA样品，必须保证浮游动物组织破碎完全，并且还许保证DNA裂解液能够完全裂解浮游动物的组织及其肠道内含物，从而获得高质量的DNA。CTAB是一种阳离子去污剂，具有沉淀核酸的特性；SDS使细胞裂解，使与DNA双链紧密相连的组蛋白分开和变性；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，可抑制核酸酶的活性；蛋白酶K 水解蛋白质，在SDS中稳定，不受EDTA的抑制，反应温度一般为50-55°C，可以用于消化各种蛋白；Tri-HCl提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；NaCl提供一个高盐环境，使核酸充分溶解，存在于液相中。氯仿去除变性的蛋白质及多糖、脂类等杂质。目前，尚无浮游动物及肠道内含物总基因组DNA提取方法的专利报告。
发明内容
本发明的目的是提供一种能从浮游动物中提取浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA，并能最大限度的减少浮游动物的肠道内含物DNA量的损耗的浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA的提取方法。本发明的浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA的提取方法，包括以下步骤(a)将浮游动物用中性鲁格氏液固定，再将同一种类的固定好的浮游动物分在一起，然后将固定好的同一种类的浮游动物用无菌、且经过0. 2 μ m滤膜过滤的海水反复冲洗浮游动物的体表，直至体表无其他生物附着；取出浮游动物，再用无菌超纯水清洗，取出将水吸干，冰冻成块，再研磨破碎；(b)将研磨破碎的浮游动物用DNA裂解液裂解，55°C裂解2 48h，然后用常规方法提取裂解后溶液中的DNA，所得到的DNA即为浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA ；所述的DNA 裂解液为 Tris-HCl 10 50mM，SDS 5 10g/L，EDTA lOOmM，蛋白酶 K 200 500μ g/mL，其余为水，pH8. 0。提取得到的浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA可以通过紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，确保后续使用的是高质量的DNA。所述的步骤(a)中的将浮游动物冰冻成块，优选用液氮或低温将其冰冻成块，更优选用用-80°C的超低温冰冻，因为1. 5ml离心管用液氮冷冻的话，操作起来不方便，而且为了减少工作人员的危险性，优先选用-80冷冻。所述的步骤(b)将研磨破碎的浮游动物用DNA裂解液裂解，优选在55°C裂解48h， 所述的 DNA 裂解液为 iTris-HCl IOmM, SDS 5g/L, EDTA lOOmM，蛋白酶 K 200yg/mL，其余为水，pH8.0。该裂解液不但在此裂解条件下能够很好的裂解浮游动物组织及其肠道内含物， 而且其用量少，并且不需要NaCl，因此比较经济。本发明的中性鲁格氏液属于现有技术中的物品，其按照以下方法制备的每 IOOml的中性鲁格氏液的配方碘5g，碘化钾IOg和超纯水100ml。分别称取碘5g与碘化钾10g，加入80ml超纯水中，搅拌溶解后，定容至100ml。本发明将浮游动物用中性鲁格氏液固定，可以使浮游动物的肠道内含物不会排空和损失，从而保护肠道内含物受到最小量的损耗，为提取浮游动物及其肠道内含物的总基因组DNA奠定了基础，从而能真实的反应浮游动物的肠道内含物的状况。中性鲁格氏液能够很好的固定浮游动物及其肠道内含物并且不会对后续的DNA提取造成影响，而本发明人用甲醛固定浮游动物后再提取DNA，结果发现，DNA提取失败。本发明用无菌的、且经过0. 2 μ m滤膜过滤的海水反复轻柔冲洗浮游动物体表，一般要冲3次以上，主要是为了将浮游动物体表附着的其他生物冲洗掉，再用显微镜检查，确保体表无其他生物附着，这是为了防止体表附着生物对肠道内含物造成污染。无菌的海水用0. 2 μ m滤膜过滤，其作用不仅是除菌，还去除海水中所有大于0. 2 μ m的杂质，包括细菌、 微藻、颗粒物、碎屑等，避免对提取DNA造成干扰。本发明用无菌的超纯水冲洗经无菌、且经过0.2μπι滤膜过滤的海水将体表附着的其生物清洗干净的浮游动物，是为了确保浮游动物身上的无菌过滤海水被冲洗干净，以降低无菌过滤海水中盐离子对DNA提取的影响。本发明用液氮或低温将浮游动物冰冻成块，研磨破碎，其主要目的是为了将浮游动物组织及其肠道内含物充分破碎，使细胞在DNA裂解液中充分裂解，减少由于研磨不充分造成DNA产量的损耗。应用本发明的DNA裂解液，经合适的温度和合适的时间，能够有效的裂解破碎后的浮游动物及其肠道内含物，使核酸游离出来，然后再经常规方法就可以从裂解液中提取出DNA。SDS可以在55°C 65°C下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；蛋白酶 K在SDS中稳定，反应温度一般为50-55°C，可以用于消化各种蛋白；EDTA抑制DNA酶的活性，Tri-HCl提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。裂解温度为55°C，裂解时间为2 48小时，时间过长可能会对DNA造成损伤，时间过短则使细胞裂解不完全。本发明根据浮游动物的生理特征，利用中性鲁格氏液固定浮游动物，使得浮游动物的肠道内含物不会损失，再利用无菌、且经过0. 2 μ m滤膜过滤的海水反复轻柔冲洗浮游动物体表，去除浮游动物体表附着的其他生物，从而避免体表附着的其他生物对浮游动物及其肠道内含物DNA的污染，然后再利用无菌超纯水清洗浮游动物，从而降低无菌过滤海水中盐离子对DNA提取可能造成的影响，经过充分的破碎后，用本发明的DNA裂解液裂解， 使得浮游动物及其肠道内含物中的DNA释放游离于裂解液中，然后再经常规方法，从裂解液中提取出DNA，即为浮游动物及其肠道内含物的总基因组DNA。因此本发明成功的实现了对浮游动物及其肠道内含物的总基因组DNA的提取，该方法可以最大限度的减少浮游动物肠道内含物DNA量的损耗，为准确构建现场浮游食物网的定性结构，进而解析区域生态系统的功能和效率提供了高质量的肠道内含物DNA样品。
图1是实施例1用本发明的方法提取亚强真哲水蚤及其肠道内含物总基因组DNA 的电泳图，其中1为Marker，2和3都为通过本发明的方法提取的亚强真哲水蚤及其肠道内含物总基因组的DNA ；图2是以实施例1用本发明的方法提取的亚强真哲水蚤及其肠道内含物总基因组 DNA为模板进行PCR的产物的电泳图，其中1为Marker，2为阴性对照，3是以亚强真哲水蚤及其肠道内含物总基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物的电泳图，4是阳性对照，是以三角褐指藻基因组DNA为模板PCR扩增产物的电泳图；图3是实施例2中应用本发明的方法提取的肥胖软箭虫(Flaccisagitta enflata)及其肠道内含物总基因组DNA电泳图，其中1为Marker，2为肥胖软箭虫及其肠道内含物总基因组DNA;图4是以肥胖软箭虫(Flaccisagitta enflata)及其肠道内含物总基因组DNA为模板进行PCR的产物的电泳图，其中1为Marker，2为阴性对照，3是以肥胖箭虫及其肠道内含物总基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物的电泳图，4是阳性对照，是以三角褐指藻基因组DNA为模板PCR扩增产物的电泳图。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1 于2011年3月，用浮游动物I型网在三亚珊瑚礁海区水平方向拖取浮游动物，将浮游动物用中性鲁格氏液固定后，在体式显微镜下，用一次性塑料吸管进行浮游动物分选， 将相同种类分别放入1. 5ml灭菌离心管中，中性鲁格氏液固定，4°C保存备用。取固定好的20只亚强真哲水蚤Eucalanus subcrassus放到直径3. 5cm的培养皿中，用经过0. 2 μ m Mi 11 ipore膜过滤后的灭菌海水反复轻柔冲洗浮游动物体表，显微镜检查，确保体表无其他生物附着；取出浮游动物，再用灭菌超纯水清洗，以降低无菌过滤海水中盐离子对DNA提取的影响，将浮游动物转移至1. 5ml离心管中，并将水吸干。将离心管置于_80°C超低温冰箱中冷冻，IOmin后取出，立即用杵棒进行碾磨破碎Ι-aiiin，重复以上操作3次；向离心管中加入 400 μ 1 DNA 裂解液(IOmMTris-HCl pH 8. 0,5g/L SDS，IOOmM EDTA ρΗ8· 0，200 μ gmL-1 proteinase K，其余为水，pH8. 0)，同时将杵棒的附作物进行洗脱。然后在55°C水浴48h， 期间轻摇离心管3-5次；向离心管中加入66 μ 1 5MNaCl溶液；混勻后再加入66 μ 1经56°C 预热后的10% (质量体积分数)的CTAB溶液，漩涡仪上振荡混勻后，56°C水浴IOmin ；然后加入等体积的氯仿，混勻，12000rpm离心IOmin ；将上清转移到新的1. 5ml离心管中；用 Zymo DNA concentrator (购自ZYMO RESEARCH公司，货号为No :D4034)试剂盒进行纯化 (按照其说明书操作)，将纯化后的DNA溶解于50 μ ITris-HCl (IOmM, pH8)中，-20°C保存。取4μ IDNA进行琼脂糖电泳，其电泳图如图1所示，其中2和3的点样孔中是本实施例提取获得的DNA，由此可见，通过本发明的方法能从浮游动物及其肠道内含物中提取得到DNA。以提取到的DNA为模板，用18S rDNA通用引物(18SrDNA comFl GCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGC ；18SrDNA comRl :CACCTACGGMACCTTGTTACGAC)，序列分别如 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2所示。对提取得到的DNA进行扩增，扩增体系为25 μ 1 :17. 375 μ 1 ddH20 ；2. 5 μ 1 Taq buffer ；2 μ IdNTP ；0. 125 μ 1 ExTaq ；引物 Fl 和 Rl 各 1 μ 1 ；模板 DNAl μ 1。扩增条件为 94 0C 3min ；5 X (94 °C 20s ；52 °C 30s ；72 °C Imin) ；30 X (94 °C 20s ；56 °C 30s ；72 °C Imin)； 720C 7min ； 15°C forever ；扩增片段为1. 81Λ。取4 μ 1扩增产物进行电泳，结果如图2所示， 其中2为阴性对照，3是以亚强真哲水蚤及其肠道内含物总基因组DNA为模板进行PCR扩增产物的电泳图，4是阳性对照，是以三角褐指藻基因组DNA为模板，以上述引物和体系进行扩增后，扩增的产物的电泳图。从图中可以看出，用本实施例的方法可以成功提取得到亚强真哲水蚤及其肠道内含物总基因组DNA。实施例2 于2011年5月，用浮游动物I型网在大亚湾海区水平方向拖取浮游动物，将浮游动物用中性鲁格氏液固定后，在体式显微镜下，用一次性塑料吸管进行浮游动物分选，将相同种类分别放入1. 5ml灭菌离心管中，中性鲁格氏液固定，4°C保存备用。取固定好的 20只肥胖软箭虫(Flaccisagitta enflata)放到直径3. 5cm的培养皿中，用经过0. 2 μ m Millipore膜过滤后的灭菌海水反复轻柔冲洗浮游动物体表，显微镜检查，确保体表无其他生物附着；取出浮游动物，再用灭菌超纯水清洗，以降低无菌过滤海水中盐离子对DNA 提取的影响，将浮游动物转移至1. 5ml离心管中，并将水吸干。将离心管置于_80°C超低温冰箱中冷冻，IOmin后取出，立即用杵棒进行碾磨破碎l-2min，重复以上操作3次；向离心管中加入 500μ1 DNA 裂解液(50mM Tris-HCl pH8. 0，10g/L SDS, IOOmM EDTApH8. 0， 500 μ gmL-lproteinase K，其余为水，pH8. 0)，同时将杵棒的附作物进行洗脱。然后在55°C 水浴池，期间轻摇离心管3-5次；冷却aiiin后，加入氯仿-异戊醇04 1)至满管，轻摇 2 3min，使两者混合均勻；IOOOOrpm离心lOmin，与此同时，将600 μ 1的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；将上清夜转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；IOOOOrpm离心Imin后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；60s后，直立离心管，加入720 μ 1 的体积分数75%的乙醇及80 μ 15Μ的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的 DNA块状物浮游于液体中；放置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；IOOOOrpm离心Imin后， 倒掉液体，再加入800 μ 1体积分数75%的乙醇，将DNA再洗30min ； IOOOOrpm离心30s后， 立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA(自然风干或用风筒吹干)；加入50 μ 1 0. 5 X TE (含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37°C恒温箱约 15h，使RNA消解；-20°C保存。取4 μ IDNA进行琼脂糖电泳，其电泳图如图3所示，其中2点样孔中是本实施例提取获得的DNA，由此可见，通过本发明的方法能从浮游动物及其肠道内含物中提取得到DNA。用18S rDNA 通用引物(18SrDNA comFl GCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGC ； 18SrDNAcomRl CACCTACGGAAACCTTGTTACGAC)对提取得到的DNA进行扩增，扩增体系为25 μ 1 17. 375 μ 1 ddH20 ；2. 5 μ 1 Taq buffer ；2 μ 1 dNTP ；0. 125 μ 1 ExTaq ；弓I 物 Fl 禾口 Rl 各 1 μ 1 ；模板 DNAl μ 1。扩增条件为94 "C 3min ；5 X (94 "C 20s ；52 "C 30s ；72 "C Imin)； 30X (940C 20s ；56°C 30s ；72°C Imin) ；72°C 7min ；15°C forever ；扩增片段理论为 1. 8bp，取 4μ 1扩增产物进行电泳，结果如图4所示，其中2为阴性对照，3是以肥胖箭虫及其肠道内含物总基因组DNA为模板进行PCR扩增产物的电泳图，4是阳性对照，是以三角褐指藻基因组DNA为模板经上述18s rDNA通用引物扩增的产物的电泳图。从图中可以看出，用本实施例的方法可以成功提取得到肥胖箭虫及其肠道内含物总基因组DNA。
权利要求
1.一种浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤(a)将浮游动物用中性鲁格氏液固定，再将同一种类的固定好的浮游动物分在一起，然后将固定好的同一种类的浮游动物用无菌、且经过0. 2 μ m滤膜过滤的海水反复冲洗浮游动物的体表，直至体表无其他生物附着；取出浮游动物，再用无菌超纯水清洗，取出将水吸干，冰冻成块，再研磨破碎；(b)将研磨破碎的浮游动物用DNA裂解液裂解，55°C裂解2 48h，然后用常规方法提取裂解后溶液中的DNA，所得到的DNA即为浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA ；所述的 DNA裂解液为 Tris-HCl 10 50mM，SDS 5 10g/L，EDTA lOOmM，蛋白酶K200 500μ g/mL，其余为水，pH8. 0。
2.根据权利要求1所述的浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的步骤(a)中将浮游动物冰冻成块，是用液氮或低温将其冰冻成块。
3.根据权利要求2所述的浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的用低温将浮游动物冰冻成块是用_80°C的超低温冰冻。
4.根据权利要求1所述的浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述的步骤(b)将研磨破碎的浮游动物用DNA裂解液裂解，是在55°C裂解48h，所述的 DNA 裂解液为 iTris-HCl IOmM, SDS 5g/L, EDTA lOOmM，蛋白酶 K 200 μ g/mL，其余为水， ρΗ8· 0。
全文摘要
本发明公开了一种浮游动物及其肠道内含物总基因组DNA的提取方法。它是利用中性鲁格氏液固定浮游动物使得肠道内含物不会损失，再利用无菌且经过0.2μm滤膜过滤的海水冲洗其体表去除体表附着的其他生物，避免其对浮游动物及其肠道内含物DNA的污染，再用无菌超纯水清洗降低海水中盐离子对DNA提取造成的影响，经破碎后用DNA裂解液裂解，使得浮游动物及其肠道内含物中的DNA释放游离于裂解液中，然后再经常规方法提取出浮游动物及其肠道内含物的总基因组DNA。本发明实现了对浮游动物及其肠道内含物的总基因组DNA的提取，最大限度的减少浮游动物肠道内含物DNA量的损耗，为准确构建现场浮游食物网的定性结构，进而解析区域生态系统的功能和效率提供了高质量的DNA样品。
文档编号C12N15/10GK102250882SQ201110175350
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月27日 优先权日2011年6月27日
发明者刘胜, 李涛, 林森杰, 胡思敏, 郭志灵 申请人:中国科学院南海海洋研究所